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柔红霉素在HL-60/ADR细胞内的异常分布
作者：龚玉萍 王燕婷 陈芳源 韩洁英 邵念贤 方智文 欧阳仁荣
单位：200021 上海第二医科大学附属仁济医院血液内科
关键词：抗药性，多药；共聚焦激光扫描显微镜；细胞株，HL-60；ADR；药物分布
中华血液学杂志000608 【摘要】 目的 了解化疗药物在非Pgp耐药细胞株HL-60/ADR细胞内的异常分布与耐药的关系。方法 采用共聚焦激光扫描显微镜观察、荧光染色、MTT、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)等方法研究柔红霉素(DNR)在HL-60/ADR细胞内的分布及与耐药的关系，以及维拉帕米、布雷菲尔得菌素、氯喹对细胞内DNR异常分布的影响。结果 与DNR在HL-60细胞核、胞浆均匀分布不同，在HL-60/ADR，DNR呈点棘状分布于细胞浆外周区，核内DNR荧光很少；维拉帕米、布雷菲尔得菌素可逆转DNR在HL-60/ADR的异常分布，而氯喹无此作用。结论 DNR在耐药细胞的异常分布与肿瘤细胞耐药的形成有关。
Altered subcellular distribution of daunorubicin in the non-P-glycoprotein-mediated multidrug-resistant cell line HL-60/ADR
GONG Yuping, WANG Yanting, CHEN Fangyuan, et al.
(Renji Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200021，China)
【Abstract】 Objective To investigate DNR subcellular distribution in the non-P-glycoprotein-mediated multidrug-resistant cell line HL-60/ADR and its relation to multidrug resistance. Methods DNR subcellular disposition was studied by confocal scanning laser microscopy, fluorescent methods, MTT and RT-PCR. The effects of verapamil, brefeldin A, chloroquine were also examined. Results In the drug-sensitive cell line HL-60/S DNR fluorscence distributed evenly in the nucleus and cytoplasm, while in the resistant cell line DNR distributed in a punctate pattern in the cytoplasm and was reduced in the nucleus. Verapamil, brefeldin A, but not chlorquine could recover the intracellular distribution of DNR from punctate to even in the resistant cell line. Conclusion Altered subcellular disposition of DNR in resistant cell line was involved in the mechanism of multidrug resistance.
【Key words】 Multidrug resistance; Confocal scanning laser microscope; Subcellular distribution
研究表明，经化疗药物诱导的白血病细胞系可产生多药耐药(MDR)细胞亚型，这些细胞可因表达Pgp或MRP而将化疗药物泵出细胞外导致耐药的发生。除此以外，化疗药物在细胞内的异常分布与耐药的关系已引起人们重视。我们利用蒽环类抗生素本身固有的荧光，采用共聚焦激光扫描显微镜(CSLM)定位研究柔红霉素(DNR)在白血病MDR细胞株HL-60/ADR细胞内的异常分布及其与耐药的关系。现将结果报道如下。
材料和方法
1 试剂 盐酸柔红霉素：Farmitalia公司产品，维拉帕米(verapamil)、布雷菲尔得菌素(brefeldin A)、氯喹购自Sigma公司，RNA抽提试剂、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒购自Gibico公司。
2 细胞株及其培养条件 HL-60为DNR敏感白血病细胞株，由上海血液学研究所提供，用含体积分数为10%的小牛血清的RPMI 1640培养液在37℃、体积分数为5%的CO2条件下培养。耐药细胞株HL-60/ADR为阿霉素(ADR)诱导HL-60细胞建立的MDR细胞株，由中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所提供，在含ADR 0.5μg/L、体积分数为10%小牛血清的RPMI 1640培养液中稳定生长。试验前2周换用无ADR的RPMI 1640培养液培养。
3 DNR在细胞内的分布 采用CSLM观察DNR在细胞中的分布。将1×105细胞DNR(0.1～10μmol/L)在37℃、体积分数为5%的CO2中分别孵育5，10，20，30，60，120min后离心，冷PBS洗涤2次，用冷PBS重新悬浮细胞，加入特制载玻片容器，置CSLM(ZEISS 510，德国)下观察激发光488nm，发射光575nm药物分布的情况。
4 测定细胞内DNR含量 采用荧光法测定细胞内DNR含量，参见文献[1]。
5 逆转试验 逆转剂维拉帕米(20μmol/L)、brefeldin A(90μmol/L)、氯喹(100μmol/L)分别作用30min后再加DNR(2μmol/L)与之反应，然后测定DNR在细胞内的分布及其含量。
6 RT-PCR检测两种耐药相关基因(mdr1、mrp)的表达 以β-actin作为内参照。引物由中国科学院上海细胞生物研究所合成，mdr1引物为5′-GGCTCCGATACATGGTTTTCC-3′,3′-TTCAGTGCGATCTTCCCAGC-5′;mrp引物为5′-GCTTTGATCGTCAAGTCCCCA-3′,3′-GTGCCACTGACGAAGCAGGATG-5′;β-actin引物为：5′-CCCTGGACTTCGAGCAAGAGAT-3′,3′-GTTTTCTGCGCAAGTTAGG-5′。
总RNA抽提(Trizol法)，RT-PCR参照试剂盒说明书操作。扩增条件：94℃ 45s;50℃ 45s,72℃ 60s，共循环33次，扩增片段分别为157bp，280bp，518bp。
7 细胞毒性试验 采用MTT法，参见文献[2]。
结果
1 DNR在细胞内的分布 图1示在37℃DNR 2μmol/L 反应1h的条件下，DNR弥漫分布于HL-60细胞核内、核膜及胞浆中。DNR低浓度(0.1μmol/L)时仍可见类似分布，仅荧光强度较弱。反应的前30min细胞内荧光逐渐增强，30min基本达饱和，60min时强度变化不大。加逆转剂后荧光强度及分布变化不大。而HL-60/ADR细胞在37℃、DNR 2μmol/L反应1h的条件下，荧光物质呈点棘状分布于细胞浆外周区，而核内、核膜基本见不到荧光信号(图2)。DNR低浓度(0.1μmol/L)时荧光很弱。DNR进入细胞内速度较HL-60慢，反应60min时基本稳定。图3、图4显示经加维拉帕米、brefeldin A后HL-60/ADR细胞核内、核膜及胞浆出现弥漫分布的荧光，在强度及分布上基本恢复至敏感细胞状。加氯喹后无变化。
图1 DNA在HL-60细胞内的分布
图2 DNA在HL-60细胞内的分布
图3 加维拉帕米后DNA在HL-60/ADR细胞内的分布
图4 加 brefeldin A后DNA在HL-60/ADR细胞内的分布
2 细胞内DNR含量 HL-60/ADR细胞DNR含量明显低于HL-60细胞，加维拉帕米、brefeldin A后DNR含量明显增高，而加氯喹后无变化。逆转剂对HL-60细胞影响不大(表1)。
3 RT-PCR结果 图5示HL-60/ADR细胞表达mrp,而mdr1阴性；HL-60细胞两者匀阴性。
4 细胞毒性试验 HL-60、HL-60/ADR细胞DNR半数致死量(IC50)分别为0.03μmol/L，1.59μmol/L。抵抗因子RF(Resistance factor,耐药细胞IC50比敏感细胞IC50)为53。
表1 逆转剂对细胞内DNR含量的影响 组别
DNR含量(荧光强度)
HL-60细胞
HL-60/ADR细胞
DNR组
678±54
231±32
DNR+维拉帕米
668±28
561±29*
DNR+brefeldin A
670±37
424±14*
DNR+氯喹
591±45
225±18
注：*与DNR比较，P<0.05
图5 HL-60/ADR细胞 RT-PCR产物电泳图
讨论
曾有研究发现，经ADR诱导的MDR细胞株HL-60/ADR虽无Pgp的表达，却表达另一种与耐药有关的蛋白——MRP。该蛋白与Pgp同属膜转运蛋白超家族成员，能将药物泵出细胞外，引起细胞内化疗药物积聚减少而发生耐药[3]。我们经RT-PCR证实HL-60/ADR仅表达MRP，而无Pgp的表达，经荧光法测得细胞内DNR含量明显低于敏感细胞，同时IC50高于敏感细胞。这些结果进一步证实了上述研究结论，表明MRP与Pgp一样可以将化疗药物泵出细胞外。
分析我们实验结果，HL-60/ADR细胞内DNR含量为HL-60的34%(即HL-60 DNR含量为HL-60/ADR的2.2倍)，而经MTT细胞毒性试验检测却出现HL-60/ADR对DNR的抵抗性为HL-60的53倍。由此可以推测HL-60/ADR对DNR的耐药性不能完全用MRP将药物泵出细胞外引起细胞内DNR含量减少这一作用来解释。虽然尚有很多机制如谷胱甘肽含量下降，拓扑异构酶活性改变等参与耐药的形成，但是化疗药物在细胞内异常分布与耐药的关系已引起重视。
CSLM具有较高的分辨能力，能较好地定位荧光物质在细胞或组织中的位置。因此，它是研究荧光物质在细胞或组织中分布的有力工具。我们利用DNR本身固有的荧光，采用CSLM可很好地观察DNR在细胞内的分布。结果显示，与HL-60相比，HL-60/ADR细胞内DNR呈点棘状分布于胞浆周边，而核内、核膜基本无DNR的分布。这与国外报道一致[4]。这种异常分布使得DNR在耐药细胞内远离作用靶点——细胞核，因而不能发挥其抗癌作用。因此，结合文献和我们的结果可以得出化疗化物在细胞内的异常分布可增强其对化疗药物的耐受性，是肿瘤细胞发生耐药的原因之一。
关于MDR细胞内分隔储留DNR的细胞器性质目前尚有争议，推测可能为溶酶体或高尔基体。Hurwitz等[5]认为MDR细胞内扩大的呈酸性环境的溶酶体可储留碱性化疗药物于其中，他们采用嗜酸性的荧光探针Lysosenor yellow/blue DND-160和溶酶体膜蛋白特异抗体LAMP-1，证实在耐药的U937细胞中储留DNR的细胞器为溶酶体。但更多的研究支持这些细胞器为高尔基体[6-8]，主要依据为，第一：利用高尔基体特异荧光探针或特异结合于高尔基体的凝结素(wheat germ agglutinin)与细胞反应后，发现它们与DNR在细胞内的分布 一致。第二：高尔基体阻断剂brefeldin A可逆转某些耐药细胞的耐药性。
为此，我们先用相应细胞器的特异阻断剂，根据其逆转效果来推论细胞器的性质。氯喹为一碱性物质，可进入溶酶体，升高溶酶体内的pH值以减少碱性化疗药物DNR的储留。我们将氯喹先与耐药细胞孵育后再加DNR发现，氯喹不能增加细胞内DNR含量，也不能打乱DNR在细胞内的点棘状分布，故可排除细胞器为溶酶体。brefelin A为高尔基体阻断剂，可阻断蛋白质从内质网向高尔基体运送。我们的研究结果显示，加入brefeldin A后既增加了MDR细胞内DNR含量，又可恢复DNR在细胞核浆中的弥漫分布。因此表明DNR在HL-60/ADR细胞中被储留在高尔基体内，随后经胞吐作用排出细胞外。
以前研究发现MRP除存在于细胞膜外，尚位于高尔基体等细胞器膜上[9]。因此，它是否在此过程中发挥了作用，将细胞浆内化疗药物泵入高尔基体内，使其远离作用靶点，促进耐药的形成为此，我们分析了膜转运蛋白阻断剂——维拉帕米对HL-60/ADR耐药细胞内DNR分布的影响。我们的结果显示维拉帕米可恢复DNR在耐药细胞核、浆中的弥漫分布，表明MRP在此过程中发挥了重要作用。
目前，关于储留DNR的细胞器尚有争议，这可能与研究的细胞系不同有关。今后可先用特异的细胞器探针，特别是激发光与DNR不同的荧光探针与DNR进行双标记，有望明确储留DNR的细胞器。
(本文图1，2，3，4见插页图第2页)
参考文献
1，马建国，杨纯正，李中，等.白血病细胞内柔红霉素的测定.药物分析杂志，1992，12：9-11.
2，Mosmann T.Rapid colormetric assay for cellular growth and survival:application to proliferation and cytotoxicity assays.J Immunol Methods,1983,65:55-63.
3，Zaman GJR,Flens MJ,van Leusden MR,et al.The human multidrug resistance-associated protein MRP is a plasma membrane drug-efflux pump.Proc Natl Acad Sci U S A,1994,91:8822-8826.
4，Coley HM,Amos WB,Twentyman PRT,et al.Examination by laser scanning confocal fluorescence imaging microscopy of the subcellular location of anthracycline in parent and multidrug resistant cell line.Br J Cancer,1993,67:1316-1323.
5，Hurwitz SJ,Terashima M,Mizunuma N,et al.Vesicular anthracycline accumulation in doxarubicin-selected U-937 cells:participation of lysosomes.Blood,1997,89:3745-3754.
6，Lautier O,Bailly JD,Demur C,et al.Altered intracellular distribution of daunorubicin in immmature acute myeloid leukemia cells.Int J Cancer,1997,71:292-299.
7，Barrand MA,Rhodes T,Center MS,et al.Chemosensitisation and drug accumulation,effects of cyclosporin A,PSC-833 and verapamil human MDR large cell lung cancer cells expressing a 190k membrane protein distinct from P-glycoprotein.Eur J Cancer,1993,29A:408-415.
8，Rhodes T,Barrand MA,Twentyman PR.Modification by brefeldin A,bafilomycin A1 and 7-cholro-4-nitrobenz-z-oxa-1,3-diazole(NBD) of cellular accumulation and intracellular distribution of anthracyclines in the non-p-glycoprotein-mediated multidrug-resistant cell line COR-L23/R.Br J Cancer,1994,70:60-66.
9，Marquardt D,Mccrone S,Center MS.Mexhanisms of multidrug resistance in HL60 cells:detection of resistance-associated proteins with antibodies against synthetic peptides that correspond to the deduced sequence of P-glycoprotein.Cancer Res,1990,50:1426-1430.
(收稿日期：1999-05-25)