慢性传输型便秘患者结肠神经丝蛋白和S-100蛋白的表达及意义
作者：田波 陈国庭 段全红 杨世玲 李云华 厉峰
单位：山东潍坊医学院附属医院肛肠外科 261031
关键词：
中华医学杂志000615 为进一步揭示结肠慢性传输型便秘(Slow transit costipation, STC)的发病机制，我们采用免疫组织化学及计算机图像分析方法，对33例STC患者结肠肌间神经丛内神经丝蛋白(Neurofilament，NF)和S-100蛋白进行了定量研究，并与病程和发病年龄进行了相关性分析，现将结果报道如下。
一、对象和方法
1.临床资料：选择1990年1月至1999年1月间经手术治疗的STC女性病人33例作为研究对象(STC组)，年龄25～56岁，平均40.5岁；病程2～26年，平均9年。手术方式均为次全结肠切除升直吻合术。
, http://www.100md.com
以上病人均按下列标准确定诊断：(1)便意淡漠(多在5 d以上无便意)伴腹胀，靠口服泻剂通便，用药量渐增多而通便效果渐差，病史多在2年以上。(2)结肠传输时间明显延长，72 h排出Marker明显少于80%。(3)钡灌肠透视及排粪造影排除结直肠器质性病变和出口处功能性梗阻。选择同期手术治疗的无便秘病史及服用泻剂史的非梗阻性结肠癌女性病人25例作为对照组，年龄28～60岁，平均42岁。
2.主要仪器设备和试剂：研究应用的主要仪器有：Leica光学显微镜、Olympus照相显微镜及CMIAS真彩色图像分析系统(日本产)等。主要试剂有：鼠抗人神经丝蛋白(NF一
表1 两组NF平均光密度值和积分光密度值(
±s) 组别
例数
平均光密度值
, 百拇医药
积分光密度值
升结肠
横结肠
降结肠
乙状结肠
升结肠
横结肠
降结肠
乙状结肠
STC组
33
0.110±0.023
0.119±0.031
, http://www.100md.com
0.120±0.035
0.115±0.026
4.75±1.86
5.50±2.05
4.76±1.72
5.42±2.32
对照组
25
0.090±0.029
0.089±0.019
0.098±0.024
0.095±0.035
, 百拇医药
4.65±1.42
5.30±1.25
4.68±1.38
5.24±1.67
P值
<0.01
<0.01
<0.01
<0.05
>0.05
>0.05
>0.01
, 百拇医药
>0.05
表2 两组S-100蛋白的平均光密度值和积分光密度值(±s) 组别
例数
平均光密度值
积分光密度值
升结肠
横结肠
降结肠
乙状结肠
升结肠
横结肠
, 百拇医药
降结肠
乙状结肠
STC组
33
0.098±0.027
0.091±0.032
0.102±0.035
0.095±0.036
5.85±2.14
5.51±2.14
5.51±2.23
5.68±2.47
, 百拇医药
对照组
25
0.084±0.025
0.088±0.030
0.080±0.027
0.085±0.019
4.54±2.12
4.54±2.12
4.72±1.95
4.63±2.26
P值
<0.01
, 百拇医药
<0.05
<0.01
<0.05
<0.01
<0.05
<0.01
<0.05
抗)、生物素标记羊抗鼠IgG(SP9000)(NF二抗)、兔抗人S-100蛋白(S-100蛋白一抗)、生物素标记羊抗兔IgG(S-100蛋白二抗)、辣根过氧化酶标记和碱性磷酸酶标记链霉卵白素工作液、DAB和BCIP/NBT显色试剂盒(以上试剂均购自北京中山生物制剂公司)以及自配的磷酸缓冲液(PBS液)等。
3.方法：(1)分别于STC组和对照组的升结肠、横结肠、降结肠和乙状结肠的结肠袋区取1.0 cm×1.0 cm的全层肠壁作为研究材料，标本取下后即用生理盐水冲洗干净，放入10%甲醛溶液中固定24 h，然后梯度酒精脱水，石蜡包埋，连续横断面切片法切成厚4 μm组织片，每张载玻片贴8个组织片，40℃ 10 h烘干备用。(2)常规HE染色。(3)免疫组织化学染色：将石蜡切片常规脱蜡后用3%过氧化氢室温孵育10 min，用蒸馏水冲洗、PBS液浸泡，然后修复NF抗原和S-100蛋白抗原。再先后分别加入NF一抗、NF二抗和S-100蛋白一抗、S-100蛋白二抗。分别用辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素和碱性磷酸标记链霉卵白素工作液作NF及S-100蛋白染色，最后用苏木素(DAB显色)或固红(NBT显色)复染，中性树胶封片。(4)计算机图像分析：每张切片高倍镜下(×200)沿肌间神经丛的方向取5个视野作体视学分析，计算每张切片的平均光密度和积分光密度的平均值。(5)统计学处理：将平均光密度值和积分光密度值对数转换后，用PEMS软件包分别对两组结肠各段进行组内和组间NF和S-100蛋白的平均光密度和积分光密度平均值的两两比较(t检验)，并将STC组乙状结肠肌间神经丛内NF的平均光密度值和S-100蛋白含量与便秘病程、发病年龄进行相关性分析。
, 百拇医药
二、结果
1.HE染色：STC组33例病人中，肌间神经丛神经节细胞与对照组相比差异无显著意义，无炎性细胞浸润。4例结肠壁肌层变薄。
2.免疫组织化学染色：STC组33例病人中，结肠各段肌间神经丛内NF表达阳性颗粒呈棕黄色，光镜下见神经节细胞及轴突内NF阳性颗粒堆积聚集，染色较深。结肠各段内NF平均光密度值明显高于对照组(图1、图2)(P<0.01)；28例(病史均≥3年)积分光密度值与对照组比较差异无显著意义P>0.05(表1)，5例(病史<3年)结肠各段NF表达虽呈阳性聚集，但积分光密度值减少。对照组25例结肠各段NF阳性颗粒均匀分布于肌间神经丛内，各段之间的含量差异无显著意义(P>0.05)(表1)。S-100蛋白表达阳性颗粒为蓝色，STC组各段结肠中S-100蛋白的平均光密度和积分光密度值均高于对照组(P<0.01)，但STC组和对照组内各段之间差异无显著意义(P>0.05)(表2)。
, 百拇医药
图1 对照组乙状结肠免疫组织化学染色结果 ×200
图2 STC病人乙状结肠免疫组织化学染色结果 ×200
3.STC组结肠肌间神经丛内NF的平均光密度值(相关系数为-0.238和-0.169，u值0.266，P>0.05)和S-100蛋白的含量(相关系数为0.754和0.276，u值2.429，P<0.01)与病程、年龄呈直线相关。
三、讨论
结肠动力减弱是STC的主要特点，为弄清楚引起结肠动力减弱的原因，许多学者对STC病人的结肠肌间神经丛的病理改变进行了研究。嗜银染色技术显示[1，2]，STC结肠壁内神经节细胞有数量减少，排列紊乱、空泡变性等病理改变。Riemann等[3]对STC结肠粘膜下神经细胞进行了超微观察，发现神经细胞的轴突发生空泡变性，神经微丝和微管数量减少、排列紊乱。发现STC病人结肠肌间神经丛有明显的退行变，这些病理改变与结肠动力减弱有关。在结肠肌间神经丛中，NF主要存在于神经元及突起中，是神经细胞内大分子物质轴浆转运的重要结构，多克隆抗体能可靠地显示其分布情况。S-100蛋白是Schwann细胞和星形胶质细胞所含有的一种钙离子结合蛋白，可作为神经间质的一种标志物。Schouten等[4]用抗NF2F11单克隆体对39例STC结肠标本检测发现，29例(74%)结肠壁肌间神经丛内NF2F11低表达或无表达，其中17例为全结肠表达异常，12例只有部分结肠表达异常。Park等[5]研究发现，STC升结肠和直肠肌间神经丛内S-100蛋白含量增高，而横结肠，降结肠和乙状结肠含量正常。我们的研究结果说明STC病人结肠肌间神经丛神经细胞内NF聚积和神经间质增生，这些病理改变涉及全结肠。NF的聚积阻碍了神经细胞内大分子物质的轴浆运输，从而影响了神经冲动的传递，最终引起神经细胞功能障碍，因而导致了结肠动力减弱。NF的聚积可能是细胞内NF转运障碍、降解降低或/和合成增加所致，S-100蛋白含量增加可能是机体代偿性调节之果。但是，引起STC病人结肠肌间神经丛内NF和S-100蛋白改变的原因尚不清楚，有待于进一步研究。
, 百拇医药
本研究还提示，应对STC进行早期诊断、早期治疗，以免随病程延长而加重结肠肌间神经丛的损害；药物治疗时，应禁用对结肠肌间神经丛有损害的刺激性泻剂；手术治疗时，应选用次全或全结肠切除术，以免残留结肠过多而致症状复发。
参考文献
1，田波，马善符，段全红，等.结肠切除治疗结肠慢传输型便秘12例体会.大肠肛门病外科杂志，1997，3：20.
2，张胜本，张连阳，黄显凯.结肠慢通过便秘的外科治疗，大肠肛门病外科杂志，1995，1：37.
3，Riemann JF, Schmidt H, Zimmermann W. The fine structure of colonic submucosal nerves in patients with chronic laxative abuse. Scand J Gastroenterol, 1980,15:761.
, 百拇医药
4，Schouten WR, Fibo JW, Eelco JR, et al. Viseral neuropathy in slow transit cositipation: an immunchistochemical antibodies against neurofilament. Dis Colon Rectum, 1993,36:1112.
5，Park HJ, Kamm MA, Abbasi MA, et al. Immunohistochemical study of the colonic muscle and innervation in idiopathic chronic constipation. Dis Colon Rectum, 1995,38:509.
(收稿日期：1999-06-30), 百拇医药
单位：山东潍坊医学院附属医院肛肠外科 261031
关键词：
中华医学杂志000615 为进一步揭示结肠慢性传输型便秘(Slow transit costipation, STC)的发病机制，我们采用免疫组织化学及计算机图像分析方法，对33例STC患者结肠肌间神经丛内神经丝蛋白(Neurofilament，NF)和S-100蛋白进行了定量研究，并与病程和发病年龄进行了相关性分析，现将结果报道如下。
一、对象和方法
1.临床资料：选择1990年1月至1999年1月间经手术治疗的STC女性病人33例作为研究对象(STC组)，年龄25～56岁，平均40.5岁；病程2～26年，平均9年。手术方式均为次全结肠切除升直吻合术。
, http://www.100md.com
以上病人均按下列标准确定诊断：(1)便意淡漠(多在5 d以上无便意)伴腹胀，靠口服泻剂通便，用药量渐增多而通便效果渐差，病史多在2年以上。(2)结肠传输时间明显延长，72 h排出Marker明显少于80%。(3)钡灌肠透视及排粪造影排除结直肠器质性病变和出口处功能性梗阻。选择同期手术治疗的无便秘病史及服用泻剂史的非梗阻性结肠癌女性病人25例作为对照组，年龄28～60岁，平均42岁。
2.主要仪器设备和试剂：研究应用的主要仪器有：Leica光学显微镜、Olympus照相显微镜及CMIAS真彩色图像分析系统(日本产)等。主要试剂有：鼠抗人神经丝蛋白(NF一
表1 两组NF平均光密度值和积分光密度值(
±s) 组别例数
平均光密度值
, 百拇医药
积分光密度值
升结肠
横结肠
降结肠
乙状结肠
升结肠
横结肠
降结肠
乙状结肠
STC组
33
0.110±0.023
0.119±0.031
, http://www.100md.com
0.120±0.035
0.115±0.026
4.75±1.86
5.50±2.05
4.76±1.72
5.42±2.32
对照组
25
0.090±0.029
0.089±0.019
0.098±0.024
0.095±0.035
, 百拇医药
4.65±1.42
5.30±1.25
4.68±1.38
5.24±1.67
P值
<0.01
<0.01
<0.01
<0.05
>0.05
>0.05
>0.01
, 百拇医药
>0.05
表2 两组S-100蛋白的平均光密度值和积分光密度值(
±s) 组别例数
平均光密度值
积分光密度值
升结肠
横结肠
降结肠
乙状结肠
升结肠
横结肠
, 百拇医药
降结肠
乙状结肠
STC组
33
0.098±0.027
0.091±0.032
0.102±0.035
0.095±0.036
5.85±2.14
5.51±2.14
5.51±2.23
5.68±2.47
, 百拇医药
对照组
25
0.084±0.025
0.088±0.030
0.080±0.027
0.085±0.019
4.54±2.12
4.54±2.12
4.72±1.95
4.63±2.26
P值
<0.01
, 百拇医药
<0.05
<0.01
<0.05
<0.01
<0.05
<0.01
<0.05
抗)、生物素标记羊抗鼠IgG(SP9000)(NF二抗)、兔抗人S-100蛋白(S-100蛋白一抗)、生物素标记羊抗兔IgG(S-100蛋白二抗)、辣根过氧化酶标记和碱性磷酸酶标记链霉卵白素工作液、DAB和BCIP/NBT显色试剂盒(以上试剂均购自北京中山生物制剂公司)以及自配的磷酸缓冲液(PBS液)等。
3.方法：(1)分别于STC组和对照组的升结肠、横结肠、降结肠和乙状结肠的结肠袋区取1.0 cm×1.0 cm的全层肠壁作为研究材料，标本取下后即用生理盐水冲洗干净，放入10%甲醛溶液中固定24 h，然后梯度酒精脱水，石蜡包埋，连续横断面切片法切成厚4 μm组织片，每张载玻片贴8个组织片，40℃ 10 h烘干备用。(2)常规HE染色。(3)免疫组织化学染色：将石蜡切片常规脱蜡后用3%过氧化氢室温孵育10 min，用蒸馏水冲洗、PBS液浸泡，然后修复NF抗原和S-100蛋白抗原。再先后分别加入NF一抗、NF二抗和S-100蛋白一抗、S-100蛋白二抗。分别用辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素和碱性磷酸标记链霉卵白素工作液作NF及S-100蛋白染色，最后用苏木素(DAB显色)或固红(NBT显色)复染，中性树胶封片。(4)计算机图像分析：每张切片高倍镜下(×200)沿肌间神经丛的方向取5个视野作体视学分析，计算每张切片的平均光密度和积分光密度的平均值。(5)统计学处理：将平均光密度值和积分光密度值对数转换后，用PEMS软件包分别对两组结肠各段进行组内和组间NF和S-100蛋白的平均光密度和积分光密度平均值的两两比较(t检验)，并将STC组乙状结肠肌间神经丛内NF的平均光密度值和S-100蛋白含量与便秘病程、发病年龄进行相关性分析。
, 百拇医药
二、结果
1.HE染色：STC组33例病人中，肌间神经丛神经节细胞与对照组相比差异无显著意义，无炎性细胞浸润。4例结肠壁肌层变薄。
2.免疫组织化学染色：STC组33例病人中，结肠各段肌间神经丛内NF表达阳性颗粒呈棕黄色，光镜下见神经节细胞及轴突内NF阳性颗粒堆积聚集，染色较深。结肠各段内NF平均光密度值明显高于对照组(图1、图2)(P<0.01)；28例(病史均≥3年)积分光密度值与对照组比较差异无显著意义P>0.05(表1)，5例(病史<3年)结肠各段NF表达虽呈阳性聚集，但积分光密度值减少。对照组25例结肠各段NF阳性颗粒均匀分布于肌间神经丛内，各段之间的含量差异无显著意义(P>0.05)(表1)。S-100蛋白表达阳性颗粒为蓝色，STC组各段结肠中S-100蛋白的平均光密度和积分光密度值均高于对照组(P<0.01)，但STC组和对照组内各段之间差异无显著意义(P>0.05)(表2)。
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图1 对照组乙状结肠免疫组织化学染色结果 ×200
图2 STC病人乙状结肠免疫组织化学染色结果 ×200
3.STC组结肠肌间神经丛内NF的平均光密度值(相关系数为-0.238和-0.169，u值0.266，P>0.05)和S-100蛋白的含量(相关系数为0.754和0.276，u值2.429，P<0.01)与病程、年龄呈直线相关。
三、讨论
结肠动力减弱是STC的主要特点，为弄清楚引起结肠动力减弱的原因，许多学者对STC病人的结肠肌间神经丛的病理改变进行了研究。嗜银染色技术显示[1，2]，STC结肠壁内神经节细胞有数量减少，排列紊乱、空泡变性等病理改变。Riemann等[3]对STC结肠粘膜下神经细胞进行了超微观察，发现神经细胞的轴突发生空泡变性，神经微丝和微管数量减少、排列紊乱。发现STC病人结肠肌间神经丛有明显的退行变，这些病理改变与结肠动力减弱有关。在结肠肌间神经丛中，NF主要存在于神经元及突起中，是神经细胞内大分子物质轴浆转运的重要结构，多克隆抗体能可靠地显示其分布情况。S-100蛋白是Schwann细胞和星形胶质细胞所含有的一种钙离子结合蛋白，可作为神经间质的一种标志物。Schouten等[4]用抗NF2F11单克隆体对39例STC结肠标本检测发现，29例(74%)结肠壁肌间神经丛内NF2F11低表达或无表达，其中17例为全结肠表达异常，12例只有部分结肠表达异常。Park等[5]研究发现，STC升结肠和直肠肌间神经丛内S-100蛋白含量增高，而横结肠，降结肠和乙状结肠含量正常。我们的研究结果说明STC病人结肠肌间神经丛神经细胞内NF聚积和神经间质增生，这些病理改变涉及全结肠。NF的聚积阻碍了神经细胞内大分子物质的轴浆运输，从而影响了神经冲动的传递，最终引起神经细胞功能障碍，因而导致了结肠动力减弱。NF的聚积可能是细胞内NF转运障碍、降解降低或/和合成增加所致，S-100蛋白含量增加可能是机体代偿性调节之果。但是，引起STC病人结肠肌间神经丛内NF和S-100蛋白改变的原因尚不清楚，有待于进一步研究。
, 百拇医药
本研究还提示，应对STC进行早期诊断、早期治疗，以免随病程延长而加重结肠肌间神经丛的损害；药物治疗时，应禁用对结肠肌间神经丛有损害的刺激性泻剂；手术治疗时，应选用次全或全结肠切除术，以免残留结肠过多而致症状复发。
参考文献
1，田波，马善符，段全红，等.结肠切除治疗结肠慢传输型便秘12例体会.大肠肛门病外科杂志，1997，3：20.
2，张胜本，张连阳，黄显凯.结肠慢通过便秘的外科治疗，大肠肛门病外科杂志，1995，1：37.
3，Riemann JF, Schmidt H, Zimmermann W. The fine structure of colonic submucosal nerves in patients with chronic laxative abuse. Scand J Gastroenterol, 1980,15:761.
, 百拇医药
4，Schouten WR, Fibo JW, Eelco JR, et al. Viseral neuropathy in slow transit cositipation: an immunchistochemical antibodies against neurofilament. Dis Colon Rectum, 1993,36:1112.
5，Park HJ, Kamm MA, Abbasi MA, et al. Immunohistochemical study of the colonic muscle and innervation in idiopathic chronic constipation. Dis Colon Rectum, 1995,38:509.
(收稿日期：1999-06-30), 百拇医药