免疫乳清对葡萄糖基转移酶活性的影响
作者：陈文霞 樊明文 边专 杜民权 王茜
单位：430079 武汉，湖北医科大学口腔医学院牙体牙髓科
关键词：转移酶类；链球菌；变异；牛奶
中华口腔医学杂志000622 【摘要】 目的 了解免疫乳清对变形链球菌葡萄糖基转移酶(glucosyltransferase,GTF)活性的影响。方法 免疫乳清来源于GTF 过表达株B-29-33免疫孕牛中获得的牛奶。对照乳清从未免疫孕牛中获得。用gtf B基因缺陷株B-29吸收免疫乳清中的抗体获得免疫吸收乳清。采用蒽酮定糖法检测3种乳清在50、70及90 μl 3种剂量条件下对GTF合成水不溶性葡聚糖的影响。结果 对照乳清具有增强酶活性的作用，可使酶活性增强3倍以上。免疫吸收乳清可部分抑制这种增强作用。免疫乳清可完全抑制乳清对酶活性的增强作用，并在此基础上抑制GTF的活性。结论 免疫乳清可以有效抑制 GTF合成水不溶性葡聚糖。其抑制作用可能与乳清中所含的抗GTF 特异性抗体有关。
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The effect of immune bovine whey on cell-associated glucosyltransferase activity of Streptococcus mutans
CHEN Wenxia, FAN Mingwen, BIAN Zhuan, et al.
(Department of Operative Dentistry,Cariology and Endodontology, School of Stomatology, Hubei Medical University, Wuhan 430079, China)
【Abstract】 Objective To study the effect of immune bovine whey on cell-associated glucosyltransferase (GTF) activity of S.mutans MT8148. Methods The immune milk was collected from cows immunized with cell-associated GTF overexpression strain B-29-33 of S.mutans MT8148. The control milk was from non-immunized cows. The immune absorbed whey was gotten from immune bovine whey which was absorbed with lyophilized Formalin-killed B-29 whole cells. Three kinds of whey were subdivided into three groups: 50 μl、70 μl、90 μl. The content of insoluble glucan was estimated colorimetrically by anthrone method. Results The control bovine whey had an enhancing GTF activity (407.00%～485.62%). The immune absorbed whey inhibited partly the enhancing GTF activity (208.74%～273.00%). The immune whey inhibited significantly the GTF activity (70.24%～38.62%) and the inhibition showed a tendency to depend on doses. Conclusions The immune bovine whey inhibits significantly the cell-associated GTF activity of S.mutans MT8148.
, 百拇医药
【Key words】 Transferases； Streptococcus mutans ； Milk
变形链球菌(下简称变链菌)对牙面的粘附和定居是致龋的始动因子。变链菌所产生的葡糖基转移酶(glucosyltransferase， GTF)被认为是主要的致龋毒力因子之一。GTF能以蔗糖为底物，合成2种葡聚糖，即水溶性和水不溶性葡聚糖。水不溶性葡聚糖(isoluble glucan，ISG)因其非水溶性和粘性，在细菌粘附中起重要作用。我们的研究目的是体外观察免疫乳清对变链菌GTF合成ISG活性的影响。
材料和方法
1.细菌：本研究所使用的菌株为S.mutans MT8148(国际标准株)和B-29。B-29为本实验室以S.mutans MT8148为亲代株，采用基因工程手段构建的gtfB基因缺陷株[1]。
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2.免疫乳清和对照乳清的制备：本项研究所使用的免疫牛奶来源于边专等[2]用细胞结合型GTF过表达株B-29-33单株全菌疫苗免疫孕牛获得的免疫牛奶。对照牛奶来源于同一饲养场未免疫奶牛的牛奶。根据Michalek等[3]介绍的方法制备免疫乳清和对照乳清。
3.免疫吸收乳清的制备：B-29在含红霉素(10 mg/L)和卡那霉素(250 mg/L)的MSB和TTY培养基中培养及增菌，0.5%甲醛灭活，调节菌浓度至A450=1，取1ml菌液冻干成粉，加入1 ml免疫乳清混匀。4℃冰箱放置48 h，离心。上清即为免疫吸收乳清。
4.细胞结合型GTF的提取[4]： 800 ml TTY培养基中24 h培养的MT8148，4℃离心，沉淀细胞用10 mmol/L磷酸钠缓冲液4℃反复洗3次，加入8 mol/L脲素22.5 ml，置25℃水浴中1 h，偶尔震摇。4℃下10 mmol/L磷酸钠缓冲液透析至无NH3检出为止。离心，上清即为细胞结合型GTF的粗提物(以下简称酶粗提物)。
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5.酶活性的测定： 酶的反应混合液由50 μl 酶粗提物、100 μl含3%蔗糖溶液的0.1 mol/L磷酸钠缓冲液、不同剂量的乳清(免疫或对照或免疫吸收乳清)，加入0.1 mol/L磷酸钠缓冲液，使反应混合液的总体积达300 μl。实验分为免疫乳清、对照乳清、免疫吸收乳清及空白对照共4组。前3组根据加入乳清剂量的不同，再分为3个小组，剂量分别为50、70及90 μl。空白对照组在反应混合液中不加任何乳清。以上各组一式三份，结果取均值。反应程序为：加入酶粗提物、乳清及缓冲液，37℃孵育30 min，然后加入蔗糖溶液，蔗糖终浓度为1%。37℃反应2 h。冰上终止反应，离心收集反应合成的ISG，蒸馏水反复洗3次。ISG的量采用蒽酮法测定，以葡萄糖为标准。统计学分析采用方差分析。
结果
一、 3种不同的乳清影响GTF合成ISG活性的比较(表1)
对照乳清组和免疫吸收乳清组GTF合成ISG的量与乳清的剂量之间无明显关联。免疫乳清在不同剂量条件下，抑制酶活性作用的强度差异无显著性，但有剂量依赖性趋势，即随着免疫乳清量的增加，抑制作用增强。与对照乳清相比，免疫乳清和免疫吸收乳清均可抑制GTF活性，免疫吸收乳清在90 μl时有明显的抑制作用(P<0.01)。而免疫乳清在50 μl时即表现出抑制作用(P<0.05)，并随着剂量的增加作用增强(90 μl时P<0.01)。
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表1 3种乳清对葡萄糖基转移酶合成水不溶性葡聚糖量的影响(μg，
±s，n=3) 乳清剂量( μl)
对照乳清
免疫吸收乳清
免疫乳清
50
65.65±26.91
34.67±7.77
11.33±6.91*
70
78.33±41.04
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44.03±2.11
12.00±7.85*
90
72.17±13.70
33.67±1.01**
6.23±2.16**
注：空白对照组水不溶性葡聚糖的合成量为(16.13±5.42)μg；与对照乳清相比*P<0.05，**P< 0.01
二、 乳清对酶活性的增强作用(图1)
空白对照组GTF合成ISG的量为16.13μg。对照乳清组在3种剂量条件下ISG的合成量为65.65～78.33 μg，ISG的合成量为空白对照组的407.00%～485.62%，这表明对照乳清可以明显地增强细胞结合型GTF合成ISG的能力 (P<0.05)。免疫吸收乳清也有这种增强作用，3种剂量条件下ISG的合成量为空白对照组的208.74%～273.00%(P<0.05)。而免疫乳清则在3种剂量条件下均可抑制GTF合成ISG，加入量为50 μl时，ISG的合成量仅为空白对照组的70.24%，当剂量达90 μl时，下降至 38.62%，这表明免疫乳清可完全抵消乳清中的其他成分对酶活性的增强作用，并在此基础上发挥抑制作用。免疫吸收乳清仅可部分抑制这种增强作用。
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图1 3种乳清对酶活性的增强作用(空白对照为100%)
讨论
本研究比较了3种乳清对细胞结合型GTF合成ISG活性的影响。结果显示，对照乳清可以增强GTF的活性达3倍以上，这与Loimaranta等[5]的研究结果相似，在他们的研究中，对照乳清组细胞结合型和细胞游离型GTF合成ISG的活性分别为无乳清组的120%和160%。两种结果的差异可能与酶反应混合物的组成、反应条件等因素不同有关。
为了观察GTF过表达株单株全菌疫苗是否可诱导产生足量的抗变链菌GTF的特异性抗体，研究中采用B-29吸收免疫乳清中的其他特异性抗体。大多数变形链球菌至少含3种gtf基因，即gtfB、gtfC和gtfD。gtfB编码GTFI催化合成ISG，gtfD编码GTFS合成水溶性葡聚糖(soluble glucan，SG)，gtfC编码的GTFIS既合成SG也合成ISG。研究表明GTFI与GTFIS 和GTFI之间存在序列同源[7，8]。B-29-33和B-29的构建是以MT8148为亲代株，采用基因工程手段获得[1，6]，B-29-33为细胞结合型GTF过表达株，B-29为gtfB缺陷株。用B-29吸收乳清中的抗体后，免疫吸收乳清对GTF的抑制作用减弱，不足以抵抗乳清中某种物质对酶活性的增强作用。推测是由于GTFI与GTFIS 和GTFI之间存在序列同源，吸收了一部分抗GTF抗体。但随着剂量的增加，ISG的合成量也明显少于对照乳清中ISG的合成量(90 μl时，P<0.01)，推测是由于免疫吸收乳清剂量的增加，其中残留的抗GTF抗体的量随之增加，抑制作用的强度也增强的结果。本研究结果与Loimaranta等[5]的结果基本一致。在他们的研究中观察到，细胞结合型和细胞游离型GTF的活性均可被免疫乳清抑制，抑制作用也呈剂量依赖性，要求免疫乳清冻干粉的浓度超过1%以上时，才出现抑制作用。我们的研究结果显示，当免疫乳清和免疫吸收乳清达90 μl时，可以获得较好的抑制效果。
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牛奶中大约85%的蛋白质为酪蛋白，牛奶在去除脂肪和酪蛋白后即乳清，其中除含免疫球蛋白外，还含有其他小分子蛋白质等成分。许多学者对牛奶与龋病的关系作了大量研究，已经证实酪蛋白有抗龋作用。但乳清增强GTF活性的确切机制仍不清楚，推测与乳清中的磷脂有关[5]。被动免疫防龋需要解决的关键问题是如何经济地获得大量特异性抗体，牛奶是世界范围内普遍被人们消费的营养品，其来源广，产量高，消费方便，虽然Loimaranta和我们的研究显示乳清能增强GTF的活性，但将牛奶作为被动免疫的载体仍然是可以考虑的途径之一。
参考文献
1.边专，樊明文，凌均. 变形链球菌葡糖基转移酶基因缺陷株特征的研究 . 中华口腔医学杂志，1996，31：344-347.
2.边专，樊明文，杜明权，等. 变形链球菌GTase高表达株免疫奶牛应用研究 . 口腔医学纵横，1999，15：1-3.
, http://www.100md.com
3.Michalek SM，Gregory RL，Harmon CC，et al . Protection of gnotobiotic rats against dental caries by passive immunization with bovine milk antibodies to Streptococcus mutans . Infect Immun，1987，55：2 341-2 347.
4.Hamada S, Horikoshi T, Minami T, et al. Purification and characterization of cell-ssociated glucosyltransferase synthesizing water-insoluble glucan from serotype c Streptococcus mutans. J Gen Microbiol, 1989,135:335-344.
, http://www.100md.com 5.Loimaranta V，Tenovuo J，Virtanen S，et al. Generation of bovine immune colostrum against Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus and its effect on glucose uptake and extracellular polysaccharide formation by mutans streptococci . Vaccine，1997，15：1 261- 1 268 .
6.边专，樊明文，魏国贤，等. 变形链球菌葡糖基转移酶过表达株的构建及特征 . 中华口腔医学杂志，1998，33：40.
7.Ueda S, Shiroza T, Kuramitsu HK. Sequence analysis of the gtfC gene from Streptococcus mutans GS-5. Gene, 1988, 69:101-109.
8.Honda O, Kato C, Kuramitsu HK, et al. Nucleotide sequence of the Streptococcus mutans gtfD geneencoding the glucosyltransferase-S enzyme. J Gen Microbiol, 1990, 136:2 099-2 105.
(收稿日期：1999-11-25), 百拇医药
单位：430079 武汉，湖北医科大学口腔医学院牙体牙髓科
关键词：转移酶类；链球菌；变异；牛奶
中华口腔医学杂志000622 【摘要】 目的 了解免疫乳清对变形链球菌葡萄糖基转移酶(glucosyltransferase,GTF)活性的影响。方法 免疫乳清来源于GTF 过表达株B-29-33免疫孕牛中获得的牛奶。对照乳清从未免疫孕牛中获得。用gtf B基因缺陷株B-29吸收免疫乳清中的抗体获得免疫吸收乳清。采用蒽酮定糖法检测3种乳清在50、70及90 μl 3种剂量条件下对GTF合成水不溶性葡聚糖的影响。结果 对照乳清具有增强酶活性的作用，可使酶活性增强3倍以上。免疫吸收乳清可部分抑制这种增强作用。免疫乳清可完全抑制乳清对酶活性的增强作用，并在此基础上抑制GTF的活性。结论 免疫乳清可以有效抑制 GTF合成水不溶性葡聚糖。其抑制作用可能与乳清中所含的抗GTF 特异性抗体有关。
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The effect of immune bovine whey on cell-associated glucosyltransferase activity of Streptococcus mutans
CHEN Wenxia, FAN Mingwen, BIAN Zhuan, et al.
(Department of Operative Dentistry,Cariology and Endodontology, School of Stomatology, Hubei Medical University, Wuhan 430079, China)
【Abstract】 Objective To study the effect of immune bovine whey on cell-associated glucosyltransferase (GTF) activity of S.mutans MT8148. Methods The immune milk was collected from cows immunized with cell-associated GTF overexpression strain B-29-33 of S.mutans MT8148. The control milk was from non-immunized cows. The immune absorbed whey was gotten from immune bovine whey which was absorbed with lyophilized Formalin-killed B-29 whole cells. Three kinds of whey were subdivided into three groups: 50 μl、70 μl、90 μl. The content of insoluble glucan was estimated colorimetrically by anthrone method. Results The control bovine whey had an enhancing GTF activity (407.00%～485.62%). The immune absorbed whey inhibited partly the enhancing GTF activity (208.74%～273.00%). The immune whey inhibited significantly the GTF activity (70.24%～38.62%) and the inhibition showed a tendency to depend on doses. Conclusions The immune bovine whey inhibits significantly the cell-associated GTF activity of S.mutans MT8148.
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【Key words】 Transferases； Streptococcus mutans ； Milk
变形链球菌(下简称变链菌)对牙面的粘附和定居是致龋的始动因子。变链菌所产生的葡糖基转移酶(glucosyltransferase， GTF)被认为是主要的致龋毒力因子之一。GTF能以蔗糖为底物，合成2种葡聚糖，即水溶性和水不溶性葡聚糖。水不溶性葡聚糖(isoluble glucan，ISG)因其非水溶性和粘性，在细菌粘附中起重要作用。我们的研究目的是体外观察免疫乳清对变链菌GTF合成ISG活性的影响。
材料和方法
1.细菌：本研究所使用的菌株为S.mutans MT8148(国际标准株)和B-29。B-29为本实验室以S.mutans MT8148为亲代株，采用基因工程手段构建的gtfB基因缺陷株[1]。
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2.免疫乳清和对照乳清的制备：本项研究所使用的免疫牛奶来源于边专等[2]用细胞结合型GTF过表达株B-29-33单株全菌疫苗免疫孕牛获得的免疫牛奶。对照牛奶来源于同一饲养场未免疫奶牛的牛奶。根据Michalek等[3]介绍的方法制备免疫乳清和对照乳清。
3.免疫吸收乳清的制备：B-29在含红霉素(10 mg/L)和卡那霉素(250 mg/L)的MSB和TTY培养基中培养及增菌，0.5%甲醛灭活，调节菌浓度至A450=1，取1ml菌液冻干成粉，加入1 ml免疫乳清混匀。4℃冰箱放置48 h，离心。上清即为免疫吸收乳清。
4.细胞结合型GTF的提取[4]： 800 ml TTY培养基中24 h培养的MT8148，4℃离心，沉淀细胞用10 mmol/L磷酸钠缓冲液4℃反复洗3次，加入8 mol/L脲素22.5 ml，置25℃水浴中1 h，偶尔震摇。4℃下10 mmol/L磷酸钠缓冲液透析至无NH3检出为止。离心，上清即为细胞结合型GTF的粗提物(以下简称酶粗提物)。
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5.酶活性的测定： 酶的反应混合液由50 μl 酶粗提物、100 μl含3%蔗糖溶液的0.1 mol/L磷酸钠缓冲液、不同剂量的乳清(免疫或对照或免疫吸收乳清)，加入0.1 mol/L磷酸钠缓冲液，使反应混合液的总体积达300 μl。实验分为免疫乳清、对照乳清、免疫吸收乳清及空白对照共4组。前3组根据加入乳清剂量的不同，再分为3个小组，剂量分别为50、70及90 μl。空白对照组在反应混合液中不加任何乳清。以上各组一式三份，结果取均值。反应程序为：加入酶粗提物、乳清及缓冲液，37℃孵育30 min，然后加入蔗糖溶液，蔗糖终浓度为1%。37℃反应2 h。冰上终止反应，离心收集反应合成的ISG，蒸馏水反复洗3次。ISG的量采用蒽酮法测定，以葡萄糖为标准。统计学分析采用方差分析。
结果
一、 3种不同的乳清影响GTF合成ISG活性的比较(表1)
对照乳清组和免疫吸收乳清组GTF合成ISG的量与乳清的剂量之间无明显关联。免疫乳清在不同剂量条件下，抑制酶活性作用的强度差异无显著性，但有剂量依赖性趋势，即随着免疫乳清量的增加，抑制作用增强。与对照乳清相比，免疫乳清和免疫吸收乳清均可抑制GTF活性，免疫吸收乳清在90 μl时有明显的抑制作用(P<0.01)。而免疫乳清在50 μl时即表现出抑制作用(P<0.05)，并随着剂量的增加作用增强(90 μl时P<0.01)。
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表1 3种乳清对葡萄糖基转移酶合成水不溶性葡聚糖量的影响(μg，
±s，n=3) 乳清剂量( μl)对照乳清
免疫吸收乳清
免疫乳清
50
65.65±26.91
34.67±7.77
11.33±6.91*
70
78.33±41.04
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44.03±2.11
12.00±7.85*
90
72.17±13.70
33.67±1.01**
6.23±2.16**
注：空白对照组水不溶性葡聚糖的合成量为(16.13±5.42)μg；与对照乳清相比*P<0.05，**P< 0.01
二、 乳清对酶活性的增强作用(图1)
空白对照组GTF合成ISG的量为16.13μg。对照乳清组在3种剂量条件下ISG的合成量为65.65～78.33 μg，ISG的合成量为空白对照组的407.00%～485.62%，这表明对照乳清可以明显地增强细胞结合型GTF合成ISG的能力 (P<0.05)。免疫吸收乳清也有这种增强作用，3种剂量条件下ISG的合成量为空白对照组的208.74%～273.00%(P<0.05)。而免疫乳清则在3种剂量条件下均可抑制GTF合成ISG，加入量为50 μl时，ISG的合成量仅为空白对照组的70.24%，当剂量达90 μl时，下降至 38.62%，这表明免疫乳清可完全抵消乳清中的其他成分对酶活性的增强作用，并在此基础上发挥抑制作用。免疫吸收乳清仅可部分抑制这种增强作用。
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图1 3种乳清对酶活性的增强作用(空白对照为100%)
讨论
本研究比较了3种乳清对细胞结合型GTF合成ISG活性的影响。结果显示，对照乳清可以增强GTF的活性达3倍以上，这与Loimaranta等[5]的研究结果相似，在他们的研究中，对照乳清组细胞结合型和细胞游离型GTF合成ISG的活性分别为无乳清组的120%和160%。两种结果的差异可能与酶反应混合物的组成、反应条件等因素不同有关。
为了观察GTF过表达株单株全菌疫苗是否可诱导产生足量的抗变链菌GTF的特异性抗体，研究中采用B-29吸收免疫乳清中的其他特异性抗体。大多数变形链球菌至少含3种gtf基因，即gtfB、gtfC和gtfD。gtfB编码GTFI催化合成ISG，gtfD编码GTFS合成水溶性葡聚糖(soluble glucan，SG)，gtfC编码的GTFIS既合成SG也合成ISG。研究表明GTFI与GTFIS 和GTFI之间存在序列同源[7，8]。B-29-33和B-29的构建是以MT8148为亲代株，采用基因工程手段获得[1，6]，B-29-33为细胞结合型GTF过表达株，B-29为gtfB缺陷株。用B-29吸收乳清中的抗体后，免疫吸收乳清对GTF的抑制作用减弱，不足以抵抗乳清中某种物质对酶活性的增强作用。推测是由于GTFI与GTFIS 和GTFI之间存在序列同源，吸收了一部分抗GTF抗体。但随着剂量的增加，ISG的合成量也明显少于对照乳清中ISG的合成量(90 μl时，P<0.01)，推测是由于免疫吸收乳清剂量的增加，其中残留的抗GTF抗体的量随之增加，抑制作用的强度也增强的结果。本研究结果与Loimaranta等[5]的结果基本一致。在他们的研究中观察到，细胞结合型和细胞游离型GTF的活性均可被免疫乳清抑制，抑制作用也呈剂量依赖性，要求免疫乳清冻干粉的浓度超过1%以上时，才出现抑制作用。我们的研究结果显示，当免疫乳清和免疫吸收乳清达90 μl时，可以获得较好的抑制效果。
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牛奶中大约85%的蛋白质为酪蛋白，牛奶在去除脂肪和酪蛋白后即乳清，其中除含免疫球蛋白外，还含有其他小分子蛋白质等成分。许多学者对牛奶与龋病的关系作了大量研究，已经证实酪蛋白有抗龋作用。但乳清增强GTF活性的确切机制仍不清楚，推测与乳清中的磷脂有关[5]。被动免疫防龋需要解决的关键问题是如何经济地获得大量特异性抗体，牛奶是世界范围内普遍被人们消费的营养品，其来源广，产量高，消费方便，虽然Loimaranta和我们的研究显示乳清能增强GTF的活性，但将牛奶作为被动免疫的载体仍然是可以考虑的途径之一。
参考文献
1.边专，樊明文，凌均. 变形链球菌葡糖基转移酶基因缺陷株特征的研究 . 中华口腔医学杂志，1996，31：344-347.
2.边专，樊明文，杜明权，等. 变形链球菌GTase高表达株免疫奶牛应用研究 . 口腔医学纵横，1999，15：1-3.
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4.Hamada S, Horikoshi T, Minami T, et al. Purification and characterization of cell-ssociated glucosyltransferase synthesizing water-insoluble glucan from serotype c Streptococcus mutans. J Gen Microbiol, 1989,135:335-344.
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6.边专，樊明文，魏国贤，等. 变形链球菌葡糖基转移酶过表达株的构建及特征 . 中华口腔医学杂志，1998，33：40.
7.Ueda S, Shiroza T, Kuramitsu HK. Sequence analysis of the gtfC gene from Streptococcus mutans GS-5. Gene, 1988, 69:101-109.
8.Honda O, Kato C, Kuramitsu HK, et al. Nucleotide sequence of the Streptococcus mutans gtfD geneencoding the glucosyltransferase-S enzyme. J Gen Microbiol, 1990, 136:2 099-2 105.
(收稿日期：1999-11-25), 百拇医药