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编号:10252723
不同气候区银杏叶中黄酮和萜内酯含量的变化
http://www.100md.com 《中草药》 2000年第6期
     作者:刘叔倩 郑俊华 王弘 陈旭 丘澄 果德安

    单位:北京医科大学生药学生物技术研究室 100083

    关键词:银杏;黄酮;萜内酯

    中草药000612摘 要 目的:为了比较不同气候区银杏叶中黄酮和萜内酯的含量,并 进一步探讨 影响二者含量的环境因素。方法:采用RP-HPLC法对样品中黄酮和萜内酯进行定量分析。结 果:不同气候区之间银杏叶中两类成分的含量存在很大差异,贵州高原区银杏叶中总黄酮和 总内酯的含量明显高于其它地区。结论:通过系统比较全国不同银杏分布区银杏叶中有效成 分的含量,为提高银杏叶质量,优化银杏叶资源提供了理论依据。

    Variation of Flavonoids and Terpenlactones in Ginkgo (Ginkgo biloba) Leavic Conditions from Regions with Different Climatic Conditions
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    Liu Shuqian, Zheng Junhua, Wang Hong, Chen Xu, Qiu Chen g and Guo De'an

    (Department of Pharmacognostical Biotechnology, Beijing University of Medical Sci ences Beijing 100083)

    Abstract To compare the contents of flavonoids and terpenlact ones in the leaves of Ginkgo biloba L. from different regions a nd di scuss the influential factors of climatic environment. RP-HPLC was used to det e rmine the flavonoids and terpenlactones. The contents of these active constitue n ts varied greatly from place to place. The contents of total flavonoids and ter p enlactones were much higher in the leaves of G. biloba. from G uizhou Plateau than those from other regions. Data from this experiment may provide a basis for the optimization of the quality and resources of G. biloba.
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    Key words Ginkgo biloba L. flavonoids terpenlacton es

    目前,世界上许多厂家正在用银杏叶提取物(GBE)制造各种药物。90年代以来,我国银杏栽 培面积大幅度增加。但研究表明,不同产地、不同采收期的银杏叶,其有效成分含量相差甚 远[1,2]。因此,有必要对不同产地银杏叶黄酮和萜内酯含量变化进行系统研究。 本文测定比较了我国6 个农业气候区23 份银杏叶中黄酮和萜内酯的含量,分析了不同生态 环境对两种成分含量的影响,为提高银杏叶质量,优化银杏叶资源,同时对其进行道地性研 究提供了理论依据。

    1 材料与方法

    1.1 材料:全国银杏主产区可划分为6 个农业气候区[3,4],1997年9月本着 具有产区代表性原则,在每个农业气候区2~4个银杏产区,采集2~10年实生银杏叶样品 共23份(表1)。采集时间均为当地银杏叶采收期。银杏叶及时晒干粉碎,过40 目筛备用。
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    1.2 仪器、药品、试剂:测定黄酮含量的HPLC仪为美国TSP公司P400系统;测定萜内酯含 量的HPLC仪为惠普公司1100系统。

    表1 材料来源 编号

    农业气候区

    采集地点

    样品个数

    1

    辽东半岛区

    丹东 大连

    3

    2

    黄淮海平原区

, http://www.100md.com     郯城 泰安 邳州

    4

    3

    江苏南部栽培区

    泰兴 南京 杭州

    4

    4

    伏牛山-大别山区

    新县 随州 安陆

    4

    5

    贵州高原区

    盘县 正安 惠水
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    4

    6

    南岭山地区

    南雄 兴安 灵川 桂林

    4

    对照品:槲皮素(Q)、白果内酯(BB)、银杏内酯A(GA)、银杏内酯B(GB) 购自Sigma公司;芦丁 、银杏内酯C(GC)购自中国药品生物制品检定所;山柰酚(K)、异鼠李素(I)由北京市新技术 研究所惠赠。提取溶剂均为分析纯,色谱用甲醇为色谱纯,水为双蒸水。

    1.3 方法

    1.3.1 黄酮含量测定:a)色谱条件:色谱柱:Inertsil ODS-3柱,4.6 mm×150 mm,5 μm;流动相:甲醇-水-磷酸(60∶40∶0.2);流速:1.0 mL/min;检测波长360 nm; 柱温30 ℃;进样量10 μL。
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    b)线性关系:分别称取Q,K,I对照品5.1 mg、4.1 mg、2.2 mg,加甲醇溶解,定容50 m L, 按上述色谱条件分别进样2,4,6,8,10 μL,测定峰面积,以峰面积对进样量 (μg)进行回归 分析,得到3 条直线,其线性范围和相关系数为Q:2.04~10.2 μg,r=0.999 9;K:1.64~8.2 μg,r=0.999 9;I:0.88~4.4 μg, r=0.999 7。总黄酮苷的计算方法参照文献的方法计算[5],即 将3 种苷元之和乘以系数2.51。

    c)样品处理采用酸水解法[6],色谱图见图1。

    d)精密度和回收率:吸取上述对照品溶液,依色谱条件进行分析,重复进样5 次,每次10 μL,测得Q,K,I峰面积RSD分别为1.2%,0.9%,0.7%。称取加入一定 量芦丁的银杏叶样品,按上述方法处理,计算芦丁的回收率为97.6%(n=3),RSD[ WTBZ〗为1.22%,表明该方法水解完全。
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    图1 HPLC图谱

    1.3.2 萜内酯含量测定:a)色谱条件:色谱柱:惠普公司HP ODS hypersl柱,4 mm×125 mm 5 μm;流动相:甲醇-水(23∶77);流速:0.5 mL/min;检测器:示差折光检测器;柱温25 ℃;进样量5 μL。

    b)线性关系:称取GA,GB,GC和BB对照品10.80,12.40,10.70,9.70 mg,加甲醇溶解 , 定容2 mL,依次稀释原浓度的1/2,1/4,1/8,1/16,1/32,按上述色谱条件,各进样5 μL,测定峰面积,以峰面积对进样量(μg)进行回归分析,得到4 条直线,其线性范围和相关系数为GA:0.844~27.00 μg,r=0.999 9;GB:0.969~31.00 μg,r=0.999 9;GC:0.836~26.75 μg,r=0.999 9;BB:0.758~24.25 μg,r=0.999 9。

, 百拇医药     c)样品采用双柱法处理[7],色谱图见图1。

    d)精密度和回收率:吸取上述对照品溶液,依色谱条件进行分析,重复进样4 次,每次5 μ L,测得GA,GB,GC,BB峰面积RSD分别为0.7%,0.5%,0.5%,0.3%。 称取加入一定量4 种对照品的银杏叶样品,按以上方法提取分离及测定。计算GA、GB、GC、 BB的加样回收率分别为96.0%,91.4%,99.3%,99.1%,RSD分别为4. 7%,3.6%,4.1%,4.9%(n=3)。

    2 结果与分析

    2.1 不同气候区银杏叶各成分平均含量及变异程度:表2为全国6个气候区银杏叶中各成分 的平均含量、气候区之间的变异系数及方差分析结果。由表2各成分的平均值可见,6 个气 候区银杏叶中总黄酮的平均含量为0.781%,萜内酯类为0.372%,两类成分占叶干重的1.1 53%,在3 种黄酮苷元中,槲皮素(Q)的含量最高,约占1/2,其次为山柰酚(K)。在4 种内酯 中,银杏内酯A(GA)和白果内酯(BB)的含量较高,银杏内酯B(GB)的含量较低。由变异系数可 以看出,不同气候区之间总黄酮含量的变异小于总内酯的变异;黄酮苷元中Q含量变异较大 ,内酯类中GA和BB的含量变异较大。由单因素方差分析的F值可见,6 个 气候区之间的银杏叶中除异鼠李素(I)外,其综合成分的含量差异均达到极显著水平(P<0.01)。这说明生态条件和栽培技术对银杏叶中以异鼠李素为苷元的黄酮苷 的含量影响较小,而对总黄酮、总内酯及其它各成分含量影响较大,表现出地区间的显著差 异。
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    表2 6 个气候区银杏叶各成分平均含量及气候 区之间的变异程度 气候区

    编号*

    黄酮(%)

    内酯(%)

    Q

    K

    I

    总黄酮

    BB

    GA

    GB

    GC
, 百拇医药
    总黄酮

    x

    0.154

    0.118

    0.035

    0.781

    0.104

    0.148

    0.037

    0.082

    0.372

    s

    0.062
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    0.034

    0.010

    0.224

    0.064

    0.09 6

    0.014

    0.028

    0.197

    RSD%

    40.40

    28.53

    27.32

    28.70
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    61.28

    64.71

    38.19

    34.07

    53.05

    F值

    7.1**

    13.1**

    1.5

    10.7* *

    13.8**

    16.8**
, 百拇医药
    5.6**

    6.1**

    13.1 **

    x:23 份样品的平均值 6 个气候区之间各成分含量的比较:** P<0.01(F0.05=2.81,F0.01=4.34)

    2.2 不同气候区银杏叶中总黄酮和总内酯含量的差异:对6 个气候区银杏叶总黄酮和总内 酯的含量进行多重比较(表3),结果表明,贵州高原区的银杏叶中两种成分的含量均为最高 ,并与其它气候区的含量呈显著差异。这说明该气候区的生态环境和栽培技术有利于银杏叶 黄酮和内酯的积累。其它几个气候区黄酮和内酯的含量未表现出一致性,如长江中下游区银 杏叶中总黄酮含量较低,而总内酯含量较高。二者综合比较,除贵州高原区外,南岭山地地 区两种成分的含量较高。
, 百拇医药
    表3 6 个气候区银杏叶中总黄酮和总内酯含量的多重 比较 气候区

    编号*

    总黄酮

    总内酯

    平均含量(%)

    差异显著性P<0.01

    平均含量(%)

    差 异显著性P<0.01

    5

    1.132 1

    A

    0.631 4
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    A

    6

    0.909 8

    AB

    0.413 4

    C

    2

    0.794 3

    B

    0.281 3

    D

    1

    0.704 6
, 百拇医药
    BC

    0.145 0

    E

    4

    0.629 3

    BC

    0.532 1

    B

    3

    0.494 5

    C

    0.170 5

    E
, 百拇医药
    *编号的代表地区见表1

    2.3 银杏叶中各成分间的相关关系:由表4可见,总黄酮和总内酯含量呈显著正相关,槲 皮素和山柰酚呈显著正相关,4 种内酯成分相互之间均为正相关关系。由此说明,环境条件 对这些成分含量的影响是比较一致的。异鼠李素与其它成分均呈负相关,但未达到极显著水 平。

    表4 银杏叶中各成分间的相关系数 成分

    K

    I

    总黄酮

    BB

    GA

    GB

, 百拇医药     GC

    总内酯

    Q

    0.630**

    -0.223

    0.949**

    0.551**

    0.302

    0.658**

    0.276

    0.580**

, http://www.100md.com     K

    -0.225

    0.808**

    0.403

    0.164

    0.638 **

    0.444*

    0.514*

    I

    -0.085

    -0.334

    -0.427*
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    -0.394

    -0.333

    -0.402

    总黄酮

    0. 508**

    0.217

    0.666**

    0.317

    0.560**

    BB

    0.863**

, 百拇医药     0.878**

    0.677**

    0.962**

    GA

    0.741**

    0.707**

    0.873**

    GB

    0.687**

    0.963**

, 百拇医药     GC

    0.762**

    *P<0.05 **P<0.01(r0.05=0.413,r0.01 =0.526)

    4 讨论

    不同地区的银杏叶,其有效成分的含量也存在很大变化。贵州高原区银杏叶中黄酮和内酯含 量明显高于其它地区。我们比较了6 个气候区的海拔、年降水量、>10 ℃积温、年平均温度 及土质5 个环境因子与银杏叶总黄酮和总内酯含量的关系,发现单一的环境因子与二者含量 无明显的相关性。如贵州高原区海拔最高,为1 000~1 500 m,而黄淮海平原区海拔最低, 为100 m以下,但该区银杏叶中黄酮和内酯的含量均不是最低。又如,江苏南部栽培区和南 岭山地区年降水量较接近,分别为1 100~1 800 mm和1 500~1 500 mm,但这两个气候区银 杏叶中黄酮和内酯的含量存在显著差异。再如,江苏南部栽培区和伏牛山-大别山区年均温 度均为15 ℃~17 ℃,>10 ℃积温均为4 500~5 000 ℃,但这两个气候区银杏叶中内酯的 含量存在显著差异。由此可见,银杏叶总黄酮和总内酯的含量变化可能是多种环境因子相互 作用的结果,而并非只与单一的环境因子有直接的相关关系。总黄酮和总内酯的含量均为最 高的贵州高原区属中亚热带,年平均气温13.5 ℃~16 ℃ ,年降水量900~1 300 mm,土 壤为黄壤和黄棕壤,这些环境条件对银杏生长发育较为有利,而对银杏叶中黄酮和内酯的积 累是否有利,尚需进一步研究。
, 百拇医药
    致谢:本文承蒙北京医科大学药学院药物分析教研室徐秉玖教授、生药生物技术研 究室马小军博士审阅。

    国家教育部高等学校博士学科点专项科研基金(9720)资助课题

    刘叔倩 北京医科大学药学院97级博士研究生

    郑俊华 课题负责人

    陈旭 现在桂林医学院

    参 考 文 献

    1,庄向平,等.中草药,1992,23(3):122

    2,池静端,等.药物分析杂志,1998,18(6):367

    3,席承藩,等编著.中国自然区划概要.北京:科学出版社,1984

    4,张云跃,等.’97银杏国际研讨会论文集.1997:66

    5,Hasler A, et al. J Chromatogr,1992,605:41

    6,范可武,等.中草药,1997,28(4):211

    7,Van Beek T A, et al. J of Chromatogr,1991,543:375

    (1999-09-08收稿), 百拇医药