大鼠脑缺血再灌注损伤后脑组织STAT3变化的免疫组织化学研究
作者：谢惠芳 刘振华 朱利元
单位：广州第一军医大学珠江医院神经内科 510282
关键词：STAT3；脑缺血再灌注；大鼠
临床神经病学杂志000603 【摘要】 目的 探讨信号转导和转录激活子(STAT)3在大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤中的表达及其与缺血性神经细胞损伤的关系。方法 用ABC免疫组化方法观察大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后脑组织中的STAT3蛋白免疫反应阳性细胞分布。结果 正常和假手术大鼠脑内以及脑缺血后的非缺血半球脑组织中未发现有STAT3免疫反应阳性细胞，脑缺血再灌注损伤后12小时在栓塞侧梗死区可见少量STAT3免疫阳性细胞，24小时后阳性细胞数显著增多达高峰，在缺血侧纹状体和缺血皮质周边区表达最明显，1周后梗死周边区少数神经细胞仍有阳性表达。差异有显著意义(P<0.01)。结论 STAT3的活化及超量表达可能介导了缺血神经细胞信号转导过程，并参与了脑缺血神经细胞损伤与修复的病理生理过程。
, 百拇医药
Immunohistochemical study on STAT3 change after focal cerebral ischemic reperfusive injury in rats
Xie Huifang, Liu Zhenhua,Zhu Liyuan.
(Department of Neurology, Zhujiang Hospital,the First Military Medical University, Guangzhou 510282)
【Abstract】 Objective To explore the expression of singal transducers and activators of transcription(STAT3) during focal cerebral ischemic reperfusive injury in rats and the relationship between ischemic neuronal damage and it.Methods Using immunohistochemical method of avidinbiotin peroxidase complex (ABC) we observed the distribution of positive cells in STAT3 protein immunoreaction after focal cerebral ischemic reperfusive injury in rats.Results STAT3 immunoreactive positive cells were not found in the cortex and striatum of normal and sham-operative rat brains and nonischemic hemisphere brain after cerebral ischemia,small amount of STAT3 immunity positive cells were induced in the embolism la-teral infarction area 12 h after reperfusive injury,and peaked after 24 h,especially in ischemic lateral striatum and around cortex,small number of nerve cells in around infarction still showed positive expression after one week.The difference had remarkable significance(P<0.01).Conclusion The expressions of STAT3 activation and overload might indicate the transmission course in ischemic nerve cell signal,and played a role in cerebral ischemic nerve cell injury and pathophysiological process of renovation.
, 百拇医药
【Key words】 STAT3 Cerebral ischemic reperfusion Rats
有文献报道，脑缺血时白细胞介素-6(IL-6)及IL-6受体(IL-6R)表达增加，但与IL-6信号转导有密切关系的信号转导和转录激活子(STAT)家族中的STAT3在脑缺血时如何表达至今尚未见报道。本研究用免疫组化方法，观察了大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后脑组织中STAT3蛋白的表达变化及其与缺血性神经细胞损伤的关系，现将结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 雄性Sprague-Dawley大鼠，体重280～310 g，由第一军医大学动物研究所提供。动物随机分为8组，缺血60分钟再灌注1小时、6小时、12小时、24小时、72小时、148小时和正常组及假手术对照组，每组3只鼠。
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1.2 动物模型制作 用10%水合氯醛0.35 ml/100 g体重，腹腔注射麻醉，将大鼠固定在手术台上，颈部左旁正中切开 ，分离左侧颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)、颈外动脉(ECA)，在翼腭动脉起始部置一血管夹，结扎、切断ECA，于ECA残断的起始部剪一0.2 mm小口，将已经消毒的4-0单丝尼龙线由ECA残断插入使之由ECA经CCA分叉沿ICA入颅，至大脑前动脉，插入深度由分叉部计17.5 mm左右，缺血60分钟，抽出尼龙线，于再灌注后1小时、6小时、12小时、24小时、72小时、148小时处死动物取材。 假手术对照组只是不插入单丝尼龙线，其它步骤同手术组。
10%水合氯醛(0.6 ml/100 g)腹腔注射麻醉，开胸经左心室至主动脉插管，先快速灌注生理盐水100 ml左右，然后灌注4℃用0.1 mol/L磷酸液配制的4%多聚甲醛400～600 ml，将脑取出后在上述固定液中固定1～2小时，再放入含30%蔗糖的0.1 mol/L磷酸缓冲液中，脑块下沉后，恒冷箱切片机冠状连续切片，片厚10 μm，然而按ABC法进行STAT3免疫组织化学染色。
, 百拇医药
1.3 STAT3免疫组织化学反应 STAT3免疫组化的主要步骤为：(1)0.3%甲醇过氧化氢孵育30分钟清除内源性过氧化物酶；(2)封闭用正常马血清室温孵育1小时；(3)小鼠STAT3单抗(1∶500)4℃过夜；(4)生物素标记的抗小鼠IgG抗体室温放置1小时；(5)AB复合物(1:100,Vector)室温反应1小时，用0.02%DAB和0.06%过氧化氢显色15分钟，PBS终止反应，苏木精复染，经脱水、透明和封片后光镜观察，以上各步骤间均用0.01 mol/L PBS洗3×5分钟。阴性对照用正常马血清代替Ⅰ抗，各步骤同上。鼠抗STAT3单克隆抗体为日本Transduction Laboratories产品，ABC试剂盒为Vector公司产品。其余试剂均为分析纯。
1.4 结果分析及统计学处理 在40×10倍的光镜视野下，分别对相邻切片的STAT3免疫阳性细胞进行计数，每只鼠各取3张切片。全部数据均采用均数±标准差(
±s)，统计处理用方差分析和t检验。
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2 结 果
正常组、假手术组、脑缺血60分钟再灌注1小时组、6小时组两侧大脑半球均未见STAT3蛋白阳性表达信号，脑缺血再灌注损伤后12小时在栓塞侧梗死区可见少量STAT3免疫阳性细胞(8.3±4.1个/每视野)，24小时后在缺血侧纹状体和缺血皮质周边、额顶皮质免疫阳性细胞数显著增多并达高峰(25.8±3.7个/每视野)，免疫阳性反应表现为神经细胞浆染成棕褐色，再灌注7天梗死周边区少数细胞形态尚完整的神经细胞仍有持续表达(14±3.6个/每视野)，差异有显著意义(P<0.01)。
3 讨 论
细胞因子作为一种细胞间信息传递因子愈来愈受到关注，近年来研究表明[1，2 ]，炎性细胞因子(IL-1、IL-6、TNF)在脑缺血性神经细胞死亡的病理机理中发挥重要的作用，其中IL-6水平的变化已引起人们的关注，脑缺血后神经元和胶质细胞均能快速合成并诱导IL-6及IL-6R的表达。IL-6可以通过其受体活化细胞内的一系列信号蛋白分子，从而实现IL-6反应基因的诱导表达，新近研究发现IL-6和IL-6R复合物结合于gp130分子的胞外区，迅速引起gp130的二聚体，这使得与其胞浆区box1偶联的Jak激酶分子相互接近，并通过交与Tyr磷酸化作用而活化。活化的Jak激酶催化gp130上的Tyr残基发生磷酸化，进而形成STAT3和/或STAT1α进入gp130受体复合物的“停泊位点”，STAT3或STAT1α由其SH2结构域介导结合gp130，并由Jak激酶催化其C端的Tyr残基发生磷酸化而活化；活化的STAT分子离开gp130并借助于磷酸Tyr的SH2结构域的Arg之间的作用形成同/异二聚体进入细胞核，与核内特异的靶基因位点结合从而激活目的基因的表达[3]。
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本研究发现，在正常大鼠脑组织中未发现STAT3免疫反应阳性细胞，这可能与STAT3在正常神经细胞中表达较低有关，脑缺血再灌注损伤后12小时在栓塞侧梗死区神经细胞可见少量STAT3蛋白阳性表达，24小时时阳性表达明显增多，在缺血侧纹状体和缺血皮质周边区表达最明显，1周后梗死周边区少数神经细胞仍有阳性表达。STAT3在受损神经细胞中的超量表达，提示脑缺血再灌注损伤可诱发STAT3蛋白的表达，至于脑缺血后STAT3蛋白的活化及高表达的原因目前尚不太清楚，我们认为可能与脑缺血时神经元和胶质细胞快速合成并诱导IL-6及IL-6R的表达，IL-6与神经细胞表面的IL-6R结合后，激活JAK-STAT信号转导系统，从而导致STAT3的活化及高表达。
STAT3蛋白在缺血半暗带区神经元细胞的延迟性高表达，表明STAT3可能与脑缺血半暗带区的神经细胞生存与凋亡的基因调控过程有关。目前有关STAT3在细胞死亡中的作用尚不十分清楚，在不同的细胞体系中，STAT3蛋白的活化具有介导细胞增殖和诱导凋亡双重作用。Minami等[4，5]研究发现STAT3在IL-6诱导的细胞凋亡中扮演重要的角色。而在某些情况下STAT3则可能通过诱导bcl-2、bcl-xl等基因的表达而具有抗细胞凋亡的作用[6]，甚至在许多肿瘤细胞中呈高表达，有学者认为它是一种癌基因[7]。那么，脑缺血后神经细胞内STAT3活化，通过调控何种目的基因，其具体的作用机理又是如何？均有待进一步研究。
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参 考 文 献
1，Saito K, Suyama K, Nishida K, et al. Early increases in TNF-2,IL-6,and IL-1β levels following transient cerebral ischemia in gerbil brain. Neurosci Lett,1996,206:146
2，Tarkowski E, Rosengren L, Blomstrand C,et al. Early intrathecal production of interleukin-6 predicts the size of brain lesion in stroke. Stroke,1995,26:1393
3，Taga T, Kishimoto T. Gp130 and the interleukin-6 family of cytokines. Annu Rev Immunol, 1997, 15:797
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4，Minami M, Inone M, Wei S,et al. STAT3 activation is a critical step in gp130-mediated terminal differentiation and growth arrest of a myeloid cell line. Proc Natl Acad Sci USA,1996, 93:3963
5，Oritani K,Tomiyama Y,Kincade PW,et al. Both STAT3-activation and STAT3-independent Bcl2 downregulation are important for interleukin-6-induced apoptosis of 1A9-M cells. Blood,1999,93:1346
6，Catlett FR,Landowski TH,Oshiro MM,et al. Constitutive activation of STAT3 signaling confers resistance to apoptosis in human U266 myeloma cells. Immuity,1999,10:105
7，Bromberg JF,Wrzeszczynska MH, Devgan G, et al.STAT3 as an oncogene. Cell,1999,98:295
(收稿2000-04-21 修回2000-06-19), http://www.100md.com
单位：广州第一军医大学珠江医院神经内科 510282
关键词：STAT3；脑缺血再灌注；大鼠
临床神经病学杂志000603 【摘要】 目的 探讨信号转导和转录激活子(STAT)3在大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤中的表达及其与缺血性神经细胞损伤的关系。方法 用ABC免疫组化方法观察大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后脑组织中的STAT3蛋白免疫反应阳性细胞分布。结果 正常和假手术大鼠脑内以及脑缺血后的非缺血半球脑组织中未发现有STAT3免疫反应阳性细胞，脑缺血再灌注损伤后12小时在栓塞侧梗死区可见少量STAT3免疫阳性细胞，24小时后阳性细胞数显著增多达高峰，在缺血侧纹状体和缺血皮质周边区表达最明显，1周后梗死周边区少数神经细胞仍有阳性表达。差异有显著意义(P<0.01)。结论 STAT3的活化及超量表达可能介导了缺血神经细胞信号转导过程，并参与了脑缺血神经细胞损伤与修复的病理生理过程。
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Immunohistochemical study on STAT3 change after focal cerebral ischemic reperfusive injury in rats
Xie Huifang, Liu Zhenhua,Zhu Liyuan.
(Department of Neurology, Zhujiang Hospital,the First Military Medical University, Guangzhou 510282)
【Abstract】 Objective To explore the expression of singal transducers and activators of transcription(STAT3) during focal cerebral ischemic reperfusive injury in rats and the relationship between ischemic neuronal damage and it.Methods Using immunohistochemical method of avidinbiotin peroxidase complex (ABC) we observed the distribution of positive cells in STAT3 protein immunoreaction after focal cerebral ischemic reperfusive injury in rats.Results STAT3 immunoreactive positive cells were not found in the cortex and striatum of normal and sham-operative rat brains and nonischemic hemisphere brain after cerebral ischemia,small amount of STAT3 immunity positive cells were induced in the embolism la-teral infarction area 12 h after reperfusive injury,and peaked after 24 h,especially in ischemic lateral striatum and around cortex,small number of nerve cells in around infarction still showed positive expression after one week.The difference had remarkable significance(P<0.01).Conclusion The expressions of STAT3 activation and overload might indicate the transmission course in ischemic nerve cell signal,and played a role in cerebral ischemic nerve cell injury and pathophysiological process of renovation.
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【Key words】 STAT3 Cerebral ischemic reperfusion Rats
有文献报道，脑缺血时白细胞介素-6(IL-6)及IL-6受体(IL-6R)表达增加，但与IL-6信号转导有密切关系的信号转导和转录激活子(STAT)家族中的STAT3在脑缺血时如何表达至今尚未见报道。本研究用免疫组化方法，观察了大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后脑组织中STAT3蛋白的表达变化及其与缺血性神经细胞损伤的关系，现将结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 雄性Sprague-Dawley大鼠，体重280～310 g，由第一军医大学动物研究所提供。动物随机分为8组，缺血60分钟再灌注1小时、6小时、12小时、24小时、72小时、148小时和正常组及假手术对照组，每组3只鼠。
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1.2 动物模型制作 用10%水合氯醛0.35 ml/100 g体重，腹腔注射麻醉，将大鼠固定在手术台上，颈部左旁正中切开 ，分离左侧颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)、颈外动脉(ECA)，在翼腭动脉起始部置一血管夹，结扎、切断ECA，于ECA残断的起始部剪一0.2 mm小口，将已经消毒的4-0单丝尼龙线由ECA残断插入使之由ECA经CCA分叉沿ICA入颅，至大脑前动脉，插入深度由分叉部计17.5 mm左右，缺血60分钟，抽出尼龙线，于再灌注后1小时、6小时、12小时、24小时、72小时、148小时处死动物取材。 假手术对照组只是不插入单丝尼龙线，其它步骤同手术组。
10%水合氯醛(0.6 ml/100 g)腹腔注射麻醉，开胸经左心室至主动脉插管，先快速灌注生理盐水100 ml左右，然后灌注4℃用0.1 mol/L磷酸液配制的4%多聚甲醛400～600 ml，将脑取出后在上述固定液中固定1～2小时，再放入含30%蔗糖的0.1 mol/L磷酸缓冲液中，脑块下沉后，恒冷箱切片机冠状连续切片，片厚10 μm，然而按ABC法进行STAT3免疫组织化学染色。
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1.3 STAT3免疫组织化学反应 STAT3免疫组化的主要步骤为：(1)0.3%甲醇过氧化氢孵育30分钟清除内源性过氧化物酶；(2)封闭用正常马血清室温孵育1小时；(3)小鼠STAT3单抗(1∶500)4℃过夜；(4)生物素标记的抗小鼠IgG抗体室温放置1小时；(5)AB复合物(1:100,Vector)室温反应1小时，用0.02%DAB和0.06%过氧化氢显色15分钟，PBS终止反应，苏木精复染，经脱水、透明和封片后光镜观察，以上各步骤间均用0.01 mol/L PBS洗3×5分钟。阴性对照用正常马血清代替Ⅰ抗，各步骤同上。鼠抗STAT3单克隆抗体为日本Transduction Laboratories产品，ABC试剂盒为Vector公司产品。其余试剂均为分析纯。
1.4 结果分析及统计学处理 在40×10倍的光镜视野下，分别对相邻切片的STAT3免疫阳性细胞进行计数，每只鼠各取3张切片。全部数据均采用均数±标准差(
±s)，统计处理用方差分析和t检验。, 百拇医药
2 结 果
正常组、假手术组、脑缺血60分钟再灌注1小时组、6小时组两侧大脑半球均未见STAT3蛋白阳性表达信号，脑缺血再灌注损伤后12小时在栓塞侧梗死区可见少量STAT3免疫阳性细胞(8.3±4.1个/每视野)，24小时后在缺血侧纹状体和缺血皮质周边、额顶皮质免疫阳性细胞数显著增多并达高峰(25.8±3.7个/每视野)，免疫阳性反应表现为神经细胞浆染成棕褐色，再灌注7天梗死周边区少数细胞形态尚完整的神经细胞仍有持续表达(14±3.6个/每视野)，差异有显著意义(P<0.01)。
3 讨 论
细胞因子作为一种细胞间信息传递因子愈来愈受到关注，近年来研究表明[1，2 ]，炎性细胞因子(IL-1、IL-6、TNF)在脑缺血性神经细胞死亡的病理机理中发挥重要的作用，其中IL-6水平的变化已引起人们的关注，脑缺血后神经元和胶质细胞均能快速合成并诱导IL-6及IL-6R的表达。IL-6可以通过其受体活化细胞内的一系列信号蛋白分子，从而实现IL-6反应基因的诱导表达，新近研究发现IL-6和IL-6R复合物结合于gp130分子的胞外区，迅速引起gp130的二聚体，这使得与其胞浆区box1偶联的Jak激酶分子相互接近，并通过交与Tyr磷酸化作用而活化。活化的Jak激酶催化gp130上的Tyr残基发生磷酸化，进而形成STAT3和/或STAT1α进入gp130受体复合物的“停泊位点”，STAT3或STAT1α由其SH2结构域介导结合gp130，并由Jak激酶催化其C端的Tyr残基发生磷酸化而活化；活化的STAT分子离开gp130并借助于磷酸Tyr的SH2结构域的Arg之间的作用形成同/异二聚体进入细胞核，与核内特异的靶基因位点结合从而激活目的基因的表达[3]。
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本研究发现，在正常大鼠脑组织中未发现STAT3免疫反应阳性细胞，这可能与STAT3在正常神经细胞中表达较低有关，脑缺血再灌注损伤后12小时在栓塞侧梗死区神经细胞可见少量STAT3蛋白阳性表达，24小时时阳性表达明显增多，在缺血侧纹状体和缺血皮质周边区表达最明显，1周后梗死周边区少数神经细胞仍有阳性表达。STAT3在受损神经细胞中的超量表达，提示脑缺血再灌注损伤可诱发STAT3蛋白的表达，至于脑缺血后STAT3蛋白的活化及高表达的原因目前尚不太清楚，我们认为可能与脑缺血时神经元和胶质细胞快速合成并诱导IL-6及IL-6R的表达，IL-6与神经细胞表面的IL-6R结合后，激活JAK-STAT信号转导系统，从而导致STAT3的活化及高表达。
STAT3蛋白在缺血半暗带区神经元细胞的延迟性高表达，表明STAT3可能与脑缺血半暗带区的神经细胞生存与凋亡的基因调控过程有关。目前有关STAT3在细胞死亡中的作用尚不十分清楚，在不同的细胞体系中，STAT3蛋白的活化具有介导细胞增殖和诱导凋亡双重作用。Minami等[4，5]研究发现STAT3在IL-6诱导的细胞凋亡中扮演重要的角色。而在某些情况下STAT3则可能通过诱导bcl-2、bcl-xl等基因的表达而具有抗细胞凋亡的作用[6]，甚至在许多肿瘤细胞中呈高表达，有学者认为它是一种癌基因[7]。那么，脑缺血后神经细胞内STAT3活化，通过调控何种目的基因，其具体的作用机理又是如何？均有待进一步研究。
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参 考 文 献
1，Saito K, Suyama K, Nishida K, et al. Early increases in TNF-2,IL-6,and IL-1β levels following transient cerebral ischemia in gerbil brain. Neurosci Lett,1996,206:146
2，Tarkowski E, Rosengren L, Blomstrand C,et al. Early intrathecal production of interleukin-6 predicts the size of brain lesion in stroke. Stroke,1995,26:1393
3，Taga T, Kishimoto T. Gp130 and the interleukin-6 family of cytokines. Annu Rev Immunol, 1997, 15:797
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4，Minami M, Inone M, Wei S,et al. STAT3 activation is a critical step in gp130-mediated terminal differentiation and growth arrest of a myeloid cell line. Proc Natl Acad Sci USA,1996, 93:3963
5，Oritani K,Tomiyama Y,Kincade PW,et al. Both STAT3-activation and STAT3-independent Bcl2 downregulation are important for interleukin-6-induced apoptosis of 1A9-M cells. Blood,1999,93:1346
6，Catlett FR,Landowski TH,Oshiro MM,et al. Constitutive activation of STAT3 signaling confers resistance to apoptosis in human U266 myeloma cells. Immuity,1999,10:105
7，Bromberg JF,Wrzeszczynska MH, Devgan G, et al.STAT3 as an oncogene. Cell,1999,98:295
(收稿2000-04-21 修回2000-06-19), http://www.100md.com