9种人参皂甙对培养鼠胚脊髓神经元生长的影响
作者：潘树义 刘大庸 钟世镇 王苏平
单位：潘树义(510515 第一军医大学临床解剖研究所)；刘大庸(510515 第一军医大学临床解剖研究所)；世镇(510515 第一军医大学临床解剖研究所)；王苏平(大连市中心医院神经内科)
关键词：人参皂甙；细胞活力；周围神经；细胞培养
脑与神经疾病杂志000604
摘 要 目的：探讨9种主要人参皂甙单体对体外培养鼠胚脊髓运动神经元和脊神经节感觉神经元生长的影响。 材料和方法： 孕期15d的SD雌鼠， 取其胎鼠， 消化法混合培养鼠胚脊髓运动神经元和脊神经节感觉神经元； MTT法观察9种人参皂甙单体(Rb1、Rb3、 Rd、 Re、 Rf、 Rg1、 Rg2、 Rh1、 Rh2)对脊髓神经元生长的影响。 结果： 人参皂甙Rg1、Rb1、 Re、 Rf、 Rh1可明显提高体外培养神经元的活力(P<0.01)； 而Rb3、 Rd、 Rg2、 Rh2对脊髓神经元活力无明显影响(P>0.05)。 结论： 人参皂甙对周围神经具有保护神经元作用。
, 百拇医药
The effect of 9 Kind of Ginsenosides on cultured spinal neurons from embryonic rat
Pan Shuyi, Liu Dayong, Zhong Shizhen, Wang Suping
(Institute of clinical-anatomy. the First Military Medical University. Guangzhou, 510515)
Abstract Objective To study the effect of 9 kind of main Ginsenosides on cultured spinal moter and spinal ganglinic sensory neurons growth from embryonic rat. Methods: The embryonic rat were used from the 15d pregnant SD rat Cultured spinal motor and spinal ganglionic sensory neurons of embryonic rat by digestive enzyme method, observed the effect of 9 kind of main Ginsenosides Rb1, Rb3, Rd，Re,Rf, Rg1, Rg2,Rh1, Rh2 on the vitality of spinal cells by MTT method.Result: Ginsenosides Rg1, Rb1,R1,Rf, Rh1 increased the vitality of the cultured the cells of peripheral nerve, but Ginsenosides Rb3, Rd, Rg2 had not the effect. Conclution: Ginsenosides have the protective effect to peripheral nerve.
, 百拇医药
Key words Ginsenosides vitality peripheral nerve cultured cell
周围神经损伤与修复再生是神经科学领域热点之一。 人们普遍认为周围神经损伤后具有再生能力， 并为此做了大量工作。 人参是传统中药， 其有效成分是人参皂甙(GS)； 目前已发现GS有20余种， 按其在薄层色谱中Kf值由大到小顺序， 分别称为人参皂甙R0，Ra，Rb，Rc……等[1]。 有关人参对中枢神经系统作用的研究早有报道。 本实验以体外培养鼠胚脊髓运动神经元和感觉神经元为模型， 选择9种主要GS单体， 观察其各自对神经元活力的影响。
材料与方法
一、 脊髓细胞的取材、 分离、 消化及接种
怀孕15d的SD雌鼠(由第一军医大学实验动物中心提供)， 以1%戊巴比妥钠0.6～0.7ml腹腔麻醉， 无菌状态下取其胎鼠， 解剖显微镜下分离脑干以下脊髓， 取出条索状脊髓和圆球状脊髓神经节； 仔细将脊髓腹侧切取下来， 连同脊髓神经节一起剪成糜状， 0.125%胰蛋白酶37℃消化30min， 其间每隔5min轻轻吹打10次左右； 30min后，以含10%胎牛血清的培养基中止消化(培养基与消化液的比例为1∶1)； 用200目滤网将脊髓细胞悬液中的残渣去掉， 把细胞悬液移至到10ml离心管中， 1000r/min离心10min； 去掉离心管中上清液， 再用含10%马血清的DMEM/F12培养液将沉积于离心管底部的脊髓细胞稀释吹打为细胞悬液， 以2×106/L密度接种于96孔培养板中(培养板已经预先涂布鼠尾胶并经D-Hank's液冲洗和培养基浸泡过夜)； 然后置于5%CO2、 37℃孵箱中培养。 24h换新鲜培养液， 平均每周换液2次。
, 百拇医药
二、 实验分组(9种人参皂甙组和对照组)
接种第3d， 按分组的不同， 实验组分别给予含9种不同人参皂甙的DMEM/F12培养液， 浓度100μg/ml； 对照组则只给予DMEM/12培养液。
三、 应用阿糖胞苷抑制非神经细胞生长
第5d， 各组均加入阿糖胞苷， 终浓度保持在10μmol/l-1(一般维持48h)， 以抑制非神经细胞增殖。 48h后除掉含阿糖胞苷的培养液， 实验组继续给予含人参皂甙的DMEM/F12培养液， 对照组也更换DMEM/F12培养液[2]。
四、 MTT法测定OD值
培养第10d， 根据MTT法用∑x960酶标仪对9个实验组和空白对照组进行OD值检测。
, 百拇医药
五、 MTT法的原理及操作方法
MTT即溴化-3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二甲基四唑氮， MTT法即微量细胞-培养四唑氮法(Tctrazolium salt简称MTT法)， 是一种快速、 经济、 简便、 有一定特异性的药物筛选方法[3]。 其原理是MTT可与活细胞线粒体琥珀酸脱氢酶发生反应， 形成蓝色甲瓒结晶， 后者又可被二甲基亚砜(DMSO)等溶解， 因此可间接反应细胞活力， 一般以0.01mol/L-1PBS液将MTT配制成0.5g/L-1浓度溶液。 检测时快速翻转培养板去除培养液， 加入MTT溶液50μl/孔， 37℃、 5%CO2孵箱中反应4h， 然后加入DMSO溶剂150μl/孔， 室温下震荡10min， 当成色产物溶解后用∑x960酶标仪检测， 检测波长570nm， OD值为检测指标[4]。
结 果
, 百拇医药
一、 形态学观察： 培养24h， 可见接种初期均匀分布的细胞渐渐聚集成多个大小不等的细胞团块； 在团块之间的区域可见散在的单个神经细胞； 大多部分细胞已有小突起出现， 相差显微镜下细胞呈强折光胞体见附图1。48h， 突起较以前增长许多， 部分突起已开始交织成网见附图1。 第3d， 细胞团块之间、 团块与分散细胞之间， 形成了纵横交错的突起连接。 整个视野遍及神经细胞突起网见附图2。
图1 培养24h的神经细胞生长情况
图2 培养第3d神经细胞生长情况
加入抑制剂阿糖胞苷后， 24h即可见非神经细胞逐渐固缩、 变暗， 台盼蓝染色证实非神经细胞死亡， 而神经细胞则不受其影响。 第8d， 对照组及一部分实验组神经元胞体折光度下降， 突起变细； 而另一部分实验组的神经元生长良好。
, 百拇医药
二、 实验组与对照组OD值比较
加入9种不同人参皂甙单体(GS)的实验组与对照组， OD值经统计处理结果如下：
表1 实验组与对照组OD值比较表
GS
OD值(mean±SD)
P
①
Rb1
0.295
<0.01
②
Rb3
, 百拇医药
0.101
>0.05
③
Rd
0.091
>0.05
④
Re
0.239
<0.01
⑤
Rf
0.221
, 百拇医药
<0.01
⑥
Rg1
0.371
<0.01
⑦
Rg2
0.091
<0.05
⑧
Rh1
0.239
<0.01
, http://www.100md.com
⑨
Rh2
0.075
>0.05
10
control(对照组)
0.177
OD值最高的是Rg1、Rb1、 Re、 Rf、 Rh1次之； Rg1与Re结果比较， 0.02⑥vs④<0.05， 说明Rg1的“神经营养因子”样作用比其他人参皂甙单体明显， 而Rb3、 Rd、 Rg2、 Rh2则未见明显神经营养因子样作用。
讨 论
周围神经损伤以后将引起一定数量的脊髓运动神经元和脊神经节感觉神经元死亡， 导致所支配部分肢体功能永久性丧失， 这是周围神经损伤后再生和功能难以完全恢复的原因之一。 因此尽可能地保护神经元免遭死亡， 将有利于周围神经的再生和功能恢复。 人参对中枢神经系统， 免疫内分泌系统等作用已经明确， 国内外每年都有报道[5，6，7]。 本实验通过对鼠胚脊髓神经元的体外培养模型， 对9种主要人参皂甙单体的作用进行比较， 丰富了人参的研究和周围神经损伤及修复研究的内容。 实验结果提示： 人参不仅对中枢神经系统具有保护、 增强其功能的作用， 对周围神经系统也具有同样的功能。 在人参皂甙单体中， Rg1最具有代表性， 说明它是人参的最主要成份之一； 除Rb1、 Rg1外， 本实验发现Re、Rf、Rh1也是人参的有效成份， 有关Re、Rf、Rh1的“神经营养因子样”作用， 国内外极少报道， 可能与这些GS单体难以获取有关。 由于已有的资料已显示， 人参的作用较其单体的作用(包括Rg1在内)强， 故本实验没有作组间配伍观察单体间的协同作用。 关于选择GS的有效浓度(100μg/ml)， 一方面是根据既往的报道和我们实验室的先期工作， 另一方面是根据预实验的结果。 因为人参具有其它药物不可比拟的优点， 如药用历史长、 无明显副作用、 患者易接受等， 所以人参治疗周围神经损伤具有较光明的前景。
, 百拇医药
参考文献
1，楼之芩. 中华人民共和国药典注释选遍. 中华人民共和国药典(1990年版一部). 广东科技出版社， 1993，3∶25～30.
2，李尹庆， 张香阁， 张均田. 人参皂甙Rg1抗神经细胞凋亡作用机制的研究. 药学学报， 1997，32(6)∶406～410.
3，温汉平， 王小宁， 孙华. 肿瘤细胞体外药敏试验MTT分析法. 中华肿瘤杂志， 1993，15(6)∶470～471.
4，刘密， 张均田. 人参皂甙Rb1, Rg1对原代培养大鼠海马细胞的保护作用. 药学学报， 1995，30(9)∶674～678.
5，Seong YH, Shin CS, Kin HS. Inhibitory effect of ginsen total saponins on glutamate-induced swelling of cultured astrocytes. Biol-Pharm-Bull, 1995, 18(12)∶1776～1778.
, 百拇医药
6，Kin HS, Kang JG, Oh KW. Inhabition by ginsen toyal saponins of the development of morphine reverse tolerance and dopamine receptor supersensitivity in mice. Gen Pharacol, 1995,26(5)∶1071～1076
7，Nah SY, Mccleskey EW. Ginseng root extract inhibits Calcium channels in rat sensory neurons through a similar path, but different recepter, as mu-type opioids. J-Ethnopharmacol, 1994,42(1)∶45～51
(2000-04-10收稿), http://www.100md.com
单位：潘树义(510515 第一军医大学临床解剖研究所)；刘大庸(510515 第一军医大学临床解剖研究所)；世镇(510515 第一军医大学临床解剖研究所)；王苏平(大连市中心医院神经内科)
关键词：人参皂甙；细胞活力；周围神经；细胞培养
脑与神经疾病杂志000604
摘 要 目的：探讨9种主要人参皂甙单体对体外培养鼠胚脊髓运动神经元和脊神经节感觉神经元生长的影响。 材料和方法： 孕期15d的SD雌鼠， 取其胎鼠， 消化法混合培养鼠胚脊髓运动神经元和脊神经节感觉神经元； MTT法观察9种人参皂甙单体(Rb1、Rb3、 Rd、 Re、 Rf、 Rg1、 Rg2、 Rh1、 Rh2)对脊髓神经元生长的影响。 结果： 人参皂甙Rg1、Rb1、 Re、 Rf、 Rh1可明显提高体外培养神经元的活力(P<0.01)； 而Rb3、 Rd、 Rg2、 Rh2对脊髓神经元活力无明显影响(P>0.05)。 结论： 人参皂甙对周围神经具有保护神经元作用。
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The effect of 9 Kind of Ginsenosides on cultured spinal neurons from embryonic rat
Pan Shuyi, Liu Dayong, Zhong Shizhen, Wang Suping
(Institute of clinical-anatomy. the First Military Medical University. Guangzhou, 510515)
Abstract Objective To study the effect of 9 kind of main Ginsenosides on cultured spinal moter and spinal ganglinic sensory neurons growth from embryonic rat. Methods: The embryonic rat were used from the 15d pregnant SD rat Cultured spinal motor and spinal ganglionic sensory neurons of embryonic rat by digestive enzyme method, observed the effect of 9 kind of main Ginsenosides Rb1, Rb3, Rd，Re,Rf, Rg1, Rg2,Rh1, Rh2 on the vitality of spinal cells by MTT method.Result: Ginsenosides Rg1, Rb1,R1,Rf, Rh1 increased the vitality of the cultured the cells of peripheral nerve, but Ginsenosides Rb3, Rd, Rg2 had not the effect. Conclution: Ginsenosides have the protective effect to peripheral nerve.
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Key words Ginsenosides vitality peripheral nerve cultured cell
周围神经损伤与修复再生是神经科学领域热点之一。 人们普遍认为周围神经损伤后具有再生能力， 并为此做了大量工作。 人参是传统中药， 其有效成分是人参皂甙(GS)； 目前已发现GS有20余种， 按其在薄层色谱中Kf值由大到小顺序， 分别称为人参皂甙R0，Ra，Rb，Rc……等[1]。 有关人参对中枢神经系统作用的研究早有报道。 本实验以体外培养鼠胚脊髓运动神经元和感觉神经元为模型， 选择9种主要GS单体， 观察其各自对神经元活力的影响。
材料与方法
一、 脊髓细胞的取材、 分离、 消化及接种
怀孕15d的SD雌鼠(由第一军医大学实验动物中心提供)， 以1%戊巴比妥钠0.6～0.7ml腹腔麻醉， 无菌状态下取其胎鼠， 解剖显微镜下分离脑干以下脊髓， 取出条索状脊髓和圆球状脊髓神经节； 仔细将脊髓腹侧切取下来， 连同脊髓神经节一起剪成糜状， 0.125%胰蛋白酶37℃消化30min， 其间每隔5min轻轻吹打10次左右； 30min后，以含10%胎牛血清的培养基中止消化(培养基与消化液的比例为1∶1)； 用200目滤网将脊髓细胞悬液中的残渣去掉， 把细胞悬液移至到10ml离心管中， 1000r/min离心10min； 去掉离心管中上清液， 再用含10%马血清的DMEM/F12培养液将沉积于离心管底部的脊髓细胞稀释吹打为细胞悬液， 以2×106/L密度接种于96孔培养板中(培养板已经预先涂布鼠尾胶并经D-Hank's液冲洗和培养基浸泡过夜)； 然后置于5%CO2、 37℃孵箱中培养。 24h换新鲜培养液， 平均每周换液2次。
, 百拇医药
二、 实验分组(9种人参皂甙组和对照组)
接种第3d， 按分组的不同， 实验组分别给予含9种不同人参皂甙的DMEM/F12培养液， 浓度100μg/ml； 对照组则只给予DMEM/12培养液。
三、 应用阿糖胞苷抑制非神经细胞生长
第5d， 各组均加入阿糖胞苷， 终浓度保持在10μmol/l-1(一般维持48h)， 以抑制非神经细胞增殖。 48h后除掉含阿糖胞苷的培养液， 实验组继续给予含人参皂甙的DMEM/F12培养液， 对照组也更换DMEM/F12培养液[2]。
四、 MTT法测定OD值
培养第10d， 根据MTT法用∑x960酶标仪对9个实验组和空白对照组进行OD值检测。
, 百拇医药
五、 MTT法的原理及操作方法
MTT即溴化-3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二甲基四唑氮， MTT法即微量细胞-培养四唑氮法(Tctrazolium salt简称MTT法)， 是一种快速、 经济、 简便、 有一定特异性的药物筛选方法[3]。 其原理是MTT可与活细胞线粒体琥珀酸脱氢酶发生反应， 形成蓝色甲瓒结晶， 后者又可被二甲基亚砜(DMSO)等溶解， 因此可间接反应细胞活力， 一般以0.01mol/L-1PBS液将MTT配制成0.5g/L-1浓度溶液。 检测时快速翻转培养板去除培养液， 加入MTT溶液50μl/孔， 37℃、 5%CO2孵箱中反应4h， 然后加入DMSO溶剂150μl/孔， 室温下震荡10min， 当成色产物溶解后用∑x960酶标仪检测， 检测波长570nm， OD值为检测指标[4]。
结 果
, 百拇医药
一、 形态学观察： 培养24h， 可见接种初期均匀分布的细胞渐渐聚集成多个大小不等的细胞团块； 在团块之间的区域可见散在的单个神经细胞； 大多部分细胞已有小突起出现， 相差显微镜下细胞呈强折光胞体见附图1。48h， 突起较以前增长许多， 部分突起已开始交织成网见附图1。 第3d， 细胞团块之间、 团块与分散细胞之间， 形成了纵横交错的突起连接。 整个视野遍及神经细胞突起网见附图2。
图1 培养24h的神经细胞生长情况
图2 培养第3d神经细胞生长情况
加入抑制剂阿糖胞苷后， 24h即可见非神经细胞逐渐固缩、 变暗， 台盼蓝染色证实非神经细胞死亡， 而神经细胞则不受其影响。 第8d， 对照组及一部分实验组神经元胞体折光度下降， 突起变细； 而另一部分实验组的神经元生长良好。
, 百拇医药
二、 实验组与对照组OD值比较
加入9种不同人参皂甙单体(GS)的实验组与对照组， OD值经统计处理结果如下：
表1 实验组与对照组OD值比较表
GS
OD值(mean±SD)
P
①
Rb1
0.295
<0.01
②
Rb3
, 百拇医药
0.101
>0.05
③
Rd
0.091
>0.05
④
Re
0.239
<0.01
⑤
Rf
0.221
, 百拇医药
<0.01
⑥
Rg1
0.371
<0.01
⑦
Rg2
0.091
<0.05
⑧
Rh1
0.239
<0.01
, http://www.100md.com
⑨
Rh2
0.075
>0.05
10
control(对照组)
0.177
OD值最高的是Rg1、Rb1、 Re、 Rf、 Rh1次之； Rg1与Re结果比较， 0.02
讨 论
周围神经损伤以后将引起一定数量的脊髓运动神经元和脊神经节感觉神经元死亡， 导致所支配部分肢体功能永久性丧失， 这是周围神经损伤后再生和功能难以完全恢复的原因之一。 因此尽可能地保护神经元免遭死亡， 将有利于周围神经的再生和功能恢复。 人参对中枢神经系统， 免疫内分泌系统等作用已经明确， 国内外每年都有报道[5，6，7]。 本实验通过对鼠胚脊髓神经元的体外培养模型， 对9种主要人参皂甙单体的作用进行比较， 丰富了人参的研究和周围神经损伤及修复研究的内容。 实验结果提示： 人参不仅对中枢神经系统具有保护、 增强其功能的作用， 对周围神经系统也具有同样的功能。 在人参皂甙单体中， Rg1最具有代表性， 说明它是人参的最主要成份之一； 除Rb1、 Rg1外， 本实验发现Re、Rf、Rh1也是人参的有效成份， 有关Re、Rf、Rh1的“神经营养因子样”作用， 国内外极少报道， 可能与这些GS单体难以获取有关。 由于已有的资料已显示， 人参的作用较其单体的作用(包括Rg1在内)强， 故本实验没有作组间配伍观察单体间的协同作用。 关于选择GS的有效浓度(100μg/ml)， 一方面是根据既往的报道和我们实验室的先期工作， 另一方面是根据预实验的结果。 因为人参具有其它药物不可比拟的优点， 如药用历史长、 无明显副作用、 患者易接受等， 所以人参治疗周围神经损伤具有较光明的前景。
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参考文献
1，楼之芩. 中华人民共和国药典注释选遍. 中华人民共和国药典(1990年版一部). 广东科技出版社， 1993，3∶25～30.
2，李尹庆， 张香阁， 张均田. 人参皂甙Rg1抗神经细胞凋亡作用机制的研究. 药学学报， 1997，32(6)∶406～410.
3，温汉平， 王小宁， 孙华. 肿瘤细胞体外药敏试验MTT分析法. 中华肿瘤杂志， 1993，15(6)∶470～471.
4，刘密， 张均田. 人参皂甙Rb1, Rg1对原代培养大鼠海马细胞的保护作用. 药学学报， 1995，30(9)∶674～678.
5，Seong YH, Shin CS, Kin HS. Inhibitory effect of ginsen total saponins on glutamate-induced swelling of cultured astrocytes. Biol-Pharm-Bull, 1995, 18(12)∶1776～1778.
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6，Kin HS, Kang JG, Oh KW. Inhabition by ginsen toyal saponins of the development of morphine reverse tolerance and dopamine receptor supersensitivity in mice. Gen Pharacol, 1995,26(5)∶1071～1076
7，Nah SY, Mccleskey EW. Ginseng root extract inhibits Calcium channels in rat sensory neurons through a similar path, but different recepter, as mu-type opioids. J-Ethnopharmacol, 1994,42(1)∶45～51
(2000-04-10收稿), http://www.100md.com