端粒、端粒酶与肿瘤临床
作者：邱健 姜馨 何文宪
单位：陕西省人民医院普外科710068
关键词：端粒；端粒酶；肿瘤
中国现代医学杂志000717 分类号 R73
90年代中期以来的研究表明端粒酶活化与细胞衰老 、肿瘤发生有着密切关系。近年来，端粒长度维持机制、端粒酶活性的调控机制是分子生物 学普遍关注的领域之一，而以端粒长度、端粒酶活性为手段的肿瘤早期检测和针对端粒酶的 肿瘤生物学治疗则成为医学研究的热点。
1 端粒
端粒是存在于真核细胞线性染色体末端的特殊结构，由端粒DNA和端粒结合蛋白构成。30年 代，Muller等发现端粒对保持染色体稳定及基因组完整有重要作用。1978年Blackburn [1]首次自四膜虫分离端粒，证实其为染色体DNA末端一富含嘌呤碱基(G)的重复序列。 其 后许多作者在多种低等真核生物证实了这种结构的存在。1988年克隆人类细胞染色体端粒， 证实人类染色体两端存在(TTAGGG)n的重复序列，n约为2?000次。人类体细胞端粒长度5～1 5kb，精细胞15kb。端粒在染色体两端与核蛋白结合为复合物，使端粒免受外切酶、连接酶 作用，起保护和稳定作用，并解决线性染色体末端复制问题。在细胞有丝分裂中可能起着细 胞“分裂钟”的作用，通过染色体末端限制性片段分析 ，细胞每分裂1次，染色体末端大约丢失50～100个核苷酸。因此端粒的长度可作为细胞分裂 经历的标志[2]。
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2 端粒酶
2.1 端粒酶
是真核细胞一种核糖核蛋白，具有逆转录酶活性。该酶以自身RNA为模板，按照碱基互补配 对原 则，催化合成端粒DNA重复序列。1985年，Blackburn等[3]自四膜虫分离端粒酶。 1989年，Morin[4]自Hela细胞分离人端粒酶。1995年，Feng等[5]成功克 隆人端粒酶RNA基因，其位于第3号染色体长臂上(3q23,3)。现有资料表明，端粒酶活性存在 于 人胚胎细胞、成人男生殖细胞、造血干细胞、活化的淋巴细胞、毛囊细胞等，近来尚发现人 子宫内膜腺上皮细胞随月经周期性的活性表达[6]。而人正常体细胞无端粒酶活性 表达。
2.2 结构
端粒酶由RNA和蛋白质两成分构成。Collins等[7]纯化了四膜虫端粒酶成分，并对 其两蛋白质组分进行了基因克隆。其蛋白质组分P80和P95(分子量分别为80kD,95kD)中，P80 与端粒酶RNA模板结合，P95则可与端粒DNA引物结合。1997年在人、小鼠克隆了四膜虫端粒 酶组分P80同源物，且证明为人端粒酶成分，命名TP1(Telomerase associated protein1)， 但缺乏其为端粒酶催化亚单位的证据。同年，Nakamura[8]在人胚肾293细胞系分 离了一种端粒酶成分hTRT(Human telomerase reverse transcriptase)，并检测了6种端粒 酶阳性的永生化细胞系和6种无端粒酶活性的非永生化细胞的hTRT mRNA表达，证实与端粒酶 活性密切相关。近期的研究也证实hTRT是人端粒酶催化亚单位。
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2.3 活性测定
以Kim[9]1994年创建的TRAP(Telomeric repeat amplification protocol)为经典 方法。其将端粒酶可合成端粒重复序列的酶特性与PCR技术相结合，以去污剂处理待测细胞 ，提取端粒酶成分，以dNTPs为原料在端粒正向引物上延伸重复序列，该产物与逆向引物含 互补序列经PCR扩增，扩增产物掺入放射性同位素，经聚丙烯凝胶电泳，放射自显影，分析 显示扩增的6bp梯度条带而得出阳性结果。Sovoyski等[10]将TRAP方法与闪烁亲 近 法(Scintillation proximated assay SPA)相结合，可定量分析端粒酶活性，方法快速灵敏 。Ohyashiki[11]将原位PCR技术与TRAP相结合，从形态学上分析单层培养细胞及 脱落细胞的端粒酶活性。我国有人[12，13]将TRAP方法与ELISA法或将TRAP法 与凝胶电泳银染结合，方法安全快速。
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3 端粒、端粒酶与恶性肿瘤的检测
端粒短缩、端粒酶活化与恶性肿瘤间的密切关系，使得通过研究端粒长度、端粒酶活性检测 恶性肿瘤，探讨其在良恶区别、临床分期、病理分级以及预后上的价值，成为临床研究的热 点。Murakami[14]检测卵巢肿瘤端粒及端粒酶，结果表明正常卵巢组织端粒长度 8～13kb，恶性肿瘤小于8kb；恶性肿瘤端粒酶阳性率92%，交界性肿瘤为16.7%，良性肿瘤为 20%(样本量少，且阳性者均为胚胎性肿瘤)。Hiraga等[15]研究脑肿瘤组织，结 果发现端粒酶阳性率，二级星性细胞为20%，分化不良星性细胞为40%，而胶质瘤为72.3%， 端粒酶阳性者末端限制性片段长度明显小于阴性者。Sommerfeld[16]研究了正常 前列腺组织、前列腺增生组织、前列腺癌组织端粒长度和端粒酶活性，认为端粒长度和端粒 酶活性可作为判定前列腺良性增生和恶性肿瘤的标志物。Hiyama[17]于1995年研究 5 79例未治疗的人成神经瘤端粒酶活性与预后的关系，发现16例端粒酶高活性且伴其他遗传改 变(如N-myc基因扩增)者预后不良；60例低活性且无遗传改变者预后尚好；3例无活性者自发 消退。同一位作者[18]，也证实了端粒酶活性检测在胃癌诊断及预后的价值。基 于 TRAP方法的敏感性(放大104倍)，国内外大量资料研究了体液脱落细胞、体腔灌洗液离心 细胞、细针穿刺抽吸细胞端粒酶活性对肿瘤的无创或微创早期诊断的价值。例如，Kinoshit a[19]报道42例膀胱癌患者自排尿标本中23例(55%)可检出端粒酶活性，43例患者 膀胱灌洗液标本中36例(84%)可检出其活性，对照尿液病理细胞学检查，总结出端粒酶活性 是判断肿瘤存在更为敏感的指标。Ohyashiki[20]使用原位TRAP法及半定量的荧 光标记TRAP法检测23例泌尿系肿瘤患者自排尿标本，端粒酶检出率前者较后者为高，提示两 者结合可能对泌尿系肿瘤检测更为有效。尿液细胞端粒酶活性测定已成为泌尿系肿瘤 特别是膀胱肿瘤检测的一个新指标。同样在口腔肿瘤、支气管肺肿瘤、胰胆管肿瘤等的肿瘤 早期检 测以及良恶性鉴别也有着光明的应用前景。目前端粒酶活性定量化研究正在展开，端粒酶活 性与良恶性肿瘤鉴别、肿瘤中细胞分级、肿瘤分期以及预后之间量化的关系将会得以明确。
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4 端粒、端粒酶与恶性肿瘤的治疗
端粒、端粒酶在恶性肿瘤发生、发展的关键节点作用，为恶性肿瘤治疗提供了新的靶点。而 且端粒长度、端粒酶活性使恶性与正常细胞有明显区别，故针对端粒、端粒酶的治疗将有相 当大的安全度。前述诱导分化肿瘤细胞转良即可能抑制了端粒的活性表达。1995年Chen [21]等以三磷酸叠氮胸苷处理了CHO细胞株，显示 了端粒酶抑制作为肿瘤生物治疗手段的可行性。Greider[22]等以反义寡核苷酸 结合端粒酶mRNA模板，阻断端粒酶活性表达，取得了有意义的结果。Feng对hTR进行点突变 及反义RNA调控，结果使Hela细胞端粒酶短缩，端粒酶活性下降甚至消失，肿瘤细胞分裂明 显受抑。Norton等[23]以肽核酸(Peptide nucleic acids PNAs)靶向作用于端粒 酶RNA的模板序列，强效抑制端粒酶活性，较反义寡核苷酸高10～50倍。Kanazawa[2 4]等针对人端粒酶RNA成分设计了锤头状核酶(TeloRZ)特异切割端粒酶RNA，有效抑制了 端粒酶活性。有多位作者报道了诱导分化剂和某些化疗药物对端粒酶活性的抑制作用。这些 端粒酶抑制方法作为肿瘤治疗手段，去除了端粒酶活化对肿瘤细胞无限增殖分裂的允许作用 ，将有效地加速肿瘤细胞的凋亡，推动肿瘤生物治疗的进展。随着人端粒结合蛋白、端粒 酶蛋白催化亚单位、细胞周期因子、某些癌基因及抑癌基因等作用于端粒酶活性调控机制的 研究进一步深入，抑制端粒酶活性表达，藉以阻断恶性肿瘤发生、发展的治疗新手段将会诞 生。这对于肿瘤临床治疗的意义将不言而喻。
, 百拇医药
参考文献
1，Blackburn EH.Structure and function of telomere.Nature,1991;350:569
2，Allsopp RC,Vairi H,Patterson C,et al.Telomere length predicts rplicati ve capactity of human fibroblasts.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1992;89:10114
3，Blackburn EH.Telomerases and their synthesis.Sience,1990;249:489
4，Morin GB.The human telomere terminal transferase enzyme in aribonucleo -protein the sythesizes TTAGGG repeats.Cell,1989;59:521
, http://www.100md.com
5，Feng J,Funk WD,Wang SS,et al.The RNA component of human telomerase.Sie nce,1995;269:1236
6，Tanaka M,Kyo S,Takakura M,et al.Expression of telomerase activity in h uman endometrium is localiazed to epithelial glandulr cells and regulated in a m enstrual phase-dependent manner correlated with cell proliferition.Am J Pathol,1 998;153:1985
7，Collins K,Kobayashi R,Greider CW,et al.Purification of tetrahymena tel omerase and cloning of genes encoding the two protein omponents of the enzyme.Ce ll,1995;81:677
, http://www.100md.com
8，Nakamura TM,Morin GB,Chapman KB,et al.Telomerase catalytic subunit hom ologs from fission yeast and human.Sience,1997;277:955
9，Kim NW,Piatyszek MA,Prowse KR,et al.Spcific asociation of human telome rse activity with immortal cells and cancer.Science,1994;266:2011
10，Savoysky E,Akamatsu K,Tsuchiya M,et al.Detection of telomerase activt y by combanation of TRAP method and scintillation proximity assay (SPA).Nucleic Acids Res,1996;24:1175
, 百拇医药
11，Ohyashiki K,Ohyashi J H,Nishimaki J,et al.Cytological detecgtion of t elomerase activity using an in situ telomeric repeat amplification protocol assa y.Cancer Res,1997;57:2100
12，张来保，文剑明，张，萌，等.TRAP-银染方法检测体外培养细胞的端粒酶活性. 癌症，1997；6：468
13，卫立辛，郭亚军，阎振林，等.检测人端粒酶活性的端粒酶TRAP-ELISA法的建立 .中华肿瘤杂志，1998；20(4)：264
14，Murakami J,Nagai N,Ohama K,et al.Telomerse activity in ovarian tumors .Cancer,1997;80(6):1085
, 百拇医药
15，Hiraga S,Ohnishi T,Izumoto S,et al.Telomerase activity and aiterratio ns in telomere length in human brain tumors.Cancer Res,1998;58:2117
16，Sommerfeld HJ,Meeker AK,Piatyszek MA,et al.Telomerase activity:a prev elent marker of malignant human prostate tissue.Caner research,1996;56:218
17，Hiyama E,Hiyama K,Yokoyama T,et al.Telomerase activity with human ner uoblastoma outcomes.Nat.Med,1995;1:249
, 百拇医药
18，Hiyama E,Yokoyama T,Tatsumoto N,et al.Telomerase activity in gastric cancer.Cancr Res,1995;55:3258
19，Kinoshita H,Ogawa O,Kakehi Y,et al.Detection of telomerase activity i n exfoliated cells in urine from patients with bladder cancer,J Natl Cancer Inst ,1997;157:1161
20，Ohyashiki K,Yanata N,Ohyashiki J,et al.A combination of semiquantaiti ve telomerase assay and in-cell telomerase activity measurement using exfoliated urothelial cells for the detection of urothelial neoplasia.Cancer,1998;83:2554
, http://www.100md.com
21，Chen SF,Maine IP,Windle B,et al.Effect of 3'-azidothymidine triphosph ate and 3-azidothymidine on telomerase activity and telomere function.Pro Am Ass o Cancer Red,1995;36:554
22，Greider CW,Blackburn EH.Telomere,telomerase and cancer.Sci American,1 996;2:80
23，Norton JC,Piatyszek MA,Wright WE,et al.Inhibition of human telomerase activity by peptide nucleic acids.Nat Biotechnol,1996;14(5):615
24，Kanazawa R,Ohykawa K,Ueda K,et al.Hammerhead ribozyme mediated inhibi tion of telomerase activity.Bilchem Biophys Res Commun,1996;225:570, http://www.100md.com
单位：陕西省人民医院普外科710068
关键词：端粒；端粒酶；肿瘤
中国现代医学杂志000717 分类号 R73
90年代中期以来的研究表明端粒酶活化与细胞衰老 、肿瘤发生有着密切关系。近年来，端粒长度维持机制、端粒酶活性的调控机制是分子生物 学普遍关注的领域之一，而以端粒长度、端粒酶活性为手段的肿瘤早期检测和针对端粒酶的 肿瘤生物学治疗则成为医学研究的热点。
1 端粒
端粒是存在于真核细胞线性染色体末端的特殊结构，由端粒DNA和端粒结合蛋白构成。30年 代，Muller等发现端粒对保持染色体稳定及基因组完整有重要作用。1978年Blackburn [1]首次自四膜虫分离端粒，证实其为染色体DNA末端一富含嘌呤碱基(G)的重复序列。 其 后许多作者在多种低等真核生物证实了这种结构的存在。1988年克隆人类细胞染色体端粒， 证实人类染色体两端存在(TTAGGG)n的重复序列，n约为2?000次。人类体细胞端粒长度5～1 5kb，精细胞15kb。端粒在染色体两端与核蛋白结合为复合物，使端粒免受外切酶、连接酶 作用，起保护和稳定作用，并解决线性染色体末端复制问题。在细胞有丝分裂中可能起着细 胞“分裂钟”的作用，通过染色体末端限制性片段分析 ，细胞每分裂1次，染色体末端大约丢失50～100个核苷酸。因此端粒的长度可作为细胞分裂 经历的标志[2]。
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2 端粒酶
2.1 端粒酶
是真核细胞一种核糖核蛋白，具有逆转录酶活性。该酶以自身RNA为模板，按照碱基互补配 对原 则，催化合成端粒DNA重复序列。1985年，Blackburn等[3]自四膜虫分离端粒酶。 1989年，Morin[4]自Hela细胞分离人端粒酶。1995年，Feng等[5]成功克 隆人端粒酶RNA基因，其位于第3号染色体长臂上(3q23,3)。现有资料表明，端粒酶活性存在 于 人胚胎细胞、成人男生殖细胞、造血干细胞、活化的淋巴细胞、毛囊细胞等，近来尚发现人 子宫内膜腺上皮细胞随月经周期性的活性表达[6]。而人正常体细胞无端粒酶活性 表达。
2.2 结构
端粒酶由RNA和蛋白质两成分构成。Collins等[7]纯化了四膜虫端粒酶成分，并对 其两蛋白质组分进行了基因克隆。其蛋白质组分P80和P95(分子量分别为80kD,95kD)中，P80 与端粒酶RNA模板结合，P95则可与端粒DNA引物结合。1997年在人、小鼠克隆了四膜虫端粒 酶组分P80同源物，且证明为人端粒酶成分，命名TP1(Telomerase associated protein1)， 但缺乏其为端粒酶催化亚单位的证据。同年，Nakamura[8]在人胚肾293细胞系分 离了一种端粒酶成分hTRT(Human telomerase reverse transcriptase)，并检测了6种端粒 酶阳性的永生化细胞系和6种无端粒酶活性的非永生化细胞的hTRT mRNA表达，证实与端粒酶 活性密切相关。近期的研究也证实hTRT是人端粒酶催化亚单位。
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2.3 活性测定
以Kim[9]1994年创建的TRAP(Telomeric repeat amplification protocol)为经典 方法。其将端粒酶可合成端粒重复序列的酶特性与PCR技术相结合，以去污剂处理待测细胞 ，提取端粒酶成分，以dNTPs为原料在端粒正向引物上延伸重复序列，该产物与逆向引物含 互补序列经PCR扩增，扩增产物掺入放射性同位素，经聚丙烯凝胶电泳，放射自显影，分析 显示扩增的6bp梯度条带而得出阳性结果。Sovoyski等[10]将TRAP方法与闪烁亲 近 法(Scintillation proximated assay SPA)相结合，可定量分析端粒酶活性，方法快速灵敏 。Ohyashiki[11]将原位PCR技术与TRAP相结合，从形态学上分析单层培养细胞及 脱落细胞的端粒酶活性。我国有人[12，13]将TRAP方法与ELISA法或将TRAP法 与凝胶电泳银染结合，方法安全快速。
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3 端粒、端粒酶与恶性肿瘤的检测
端粒短缩、端粒酶活化与恶性肿瘤间的密切关系，使得通过研究端粒长度、端粒酶活性检测 恶性肿瘤，探讨其在良恶区别、临床分期、病理分级以及预后上的价值，成为临床研究的热 点。Murakami[14]检测卵巢肿瘤端粒及端粒酶，结果表明正常卵巢组织端粒长度 8～13kb，恶性肿瘤小于8kb；恶性肿瘤端粒酶阳性率92%，交界性肿瘤为16.7%，良性肿瘤为 20%(样本量少，且阳性者均为胚胎性肿瘤)。Hiraga等[15]研究脑肿瘤组织，结 果发现端粒酶阳性率，二级星性细胞为20%，分化不良星性细胞为40%，而胶质瘤为72.3%， 端粒酶阳性者末端限制性片段长度明显小于阴性者。Sommerfeld[16]研究了正常 前列腺组织、前列腺增生组织、前列腺癌组织端粒长度和端粒酶活性，认为端粒长度和端粒 酶活性可作为判定前列腺良性增生和恶性肿瘤的标志物。Hiyama[17]于1995年研究 5 79例未治疗的人成神经瘤端粒酶活性与预后的关系，发现16例端粒酶高活性且伴其他遗传改 变(如N-myc基因扩增)者预后不良；60例低活性且无遗传改变者预后尚好；3例无活性者自发 消退。同一位作者[18]，也证实了端粒酶活性检测在胃癌诊断及预后的价值。基 于 TRAP方法的敏感性(放大104倍)，国内外大量资料研究了体液脱落细胞、体腔灌洗液离心 细胞、细针穿刺抽吸细胞端粒酶活性对肿瘤的无创或微创早期诊断的价值。例如，Kinoshit a[19]报道42例膀胱癌患者自排尿标本中23例(55%)可检出端粒酶活性，43例患者 膀胱灌洗液标本中36例(84%)可检出其活性，对照尿液病理细胞学检查，总结出端粒酶活性 是判断肿瘤存在更为敏感的指标。Ohyashiki[20]使用原位TRAP法及半定量的荧 光标记TRAP法检测23例泌尿系肿瘤患者自排尿标本，端粒酶检出率前者较后者为高，提示两 者结合可能对泌尿系肿瘤检测更为有效。尿液细胞端粒酶活性测定已成为泌尿系肿瘤 特别是膀胱肿瘤检测的一个新指标。同样在口腔肿瘤、支气管肺肿瘤、胰胆管肿瘤等的肿瘤 早期检 测以及良恶性鉴别也有着光明的应用前景。目前端粒酶活性定量化研究正在展开，端粒酶活 性与良恶性肿瘤鉴别、肿瘤中细胞分级、肿瘤分期以及预后之间量化的关系将会得以明确。
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4 端粒、端粒酶与恶性肿瘤的治疗
端粒、端粒酶在恶性肿瘤发生、发展的关键节点作用，为恶性肿瘤治疗提供了新的靶点。而 且端粒长度、端粒酶活性使恶性与正常细胞有明显区别，故针对端粒、端粒酶的治疗将有相 当大的安全度。前述诱导分化肿瘤细胞转良即可能抑制了端粒的活性表达。1995年Chen [21]等以三磷酸叠氮胸苷处理了CHO细胞株，显示 了端粒酶抑制作为肿瘤生物治疗手段的可行性。Greider[22]等以反义寡核苷酸 结合端粒酶mRNA模板，阻断端粒酶活性表达，取得了有意义的结果。Feng对hTR进行点突变 及反义RNA调控，结果使Hela细胞端粒酶短缩，端粒酶活性下降甚至消失，肿瘤细胞分裂明 显受抑。Norton等[23]以肽核酸(Peptide nucleic acids PNAs)靶向作用于端粒 酶RNA的模板序列，强效抑制端粒酶活性，较反义寡核苷酸高10～50倍。Kanazawa[2 4]等针对人端粒酶RNA成分设计了锤头状核酶(TeloRZ)特异切割端粒酶RNA，有效抑制了 端粒酶活性。有多位作者报道了诱导分化剂和某些化疗药物对端粒酶活性的抑制作用。这些 端粒酶抑制方法作为肿瘤治疗手段，去除了端粒酶活化对肿瘤细胞无限增殖分裂的允许作用 ，将有效地加速肿瘤细胞的凋亡，推动肿瘤生物治疗的进展。随着人端粒结合蛋白、端粒 酶蛋白催化亚单位、细胞周期因子、某些癌基因及抑癌基因等作用于端粒酶活性调控机制的 研究进一步深入，抑制端粒酶活性表达，藉以阻断恶性肿瘤发生、发展的治疗新手段将会诞 生。这对于肿瘤临床治疗的意义将不言而喻。
, 百拇医药
参考文献
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2，Allsopp RC,Vairi H,Patterson C,et al.Telomere length predicts rplicati ve capactity of human fibroblasts.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1992;89:10114
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5，Feng J,Funk WD,Wang SS,et al.The RNA component of human telomerase.Sie nce,1995;269:1236
6，Tanaka M,Kyo S,Takakura M,et al.Expression of telomerase activity in h uman endometrium is localiazed to epithelial glandulr cells and regulated in a m enstrual phase-dependent manner correlated with cell proliferition.Am J Pathol,1 998;153:1985
7，Collins K,Kobayashi R,Greider CW,et al.Purification of tetrahymena tel omerase and cloning of genes encoding the two protein omponents of the enzyme.Ce ll,1995;81:677
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14，Murakami J,Nagai N,Ohama K,et al.Telomerse activity in ovarian tumors .Cancer,1997;80(6):1085
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16，Sommerfeld HJ,Meeker AK,Piatyszek MA,et al.Telomerase activity:a prev elent marker of malignant human prostate tissue.Caner research,1996;56:218
17，Hiyama E,Hiyama K,Yokoyama T,et al.Telomerase activity with human ner uoblastoma outcomes.Nat.Med,1995;1:249
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18，Hiyama E,Yokoyama T,Tatsumoto N,et al.Telomerase activity in gastric cancer.Cancr Res,1995;55:3258
19，Kinoshita H,Ogawa O,Kakehi Y,et al.Detection of telomerase activity i n exfoliated cells in urine from patients with bladder cancer,J Natl Cancer Inst ,1997;157:1161
20，Ohyashiki K,Yanata N,Ohyashiki J,et al.A combination of semiquantaiti ve telomerase assay and in-cell telomerase activity measurement using exfoliated urothelial cells for the detection of urothelial neoplasia.Cancer,1998;83:2554
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21，Chen SF,Maine IP,Windle B,et al.Effect of 3'-azidothymidine triphosph ate and 3-azidothymidine on telomerase activity and telomere function.Pro Am Ass o Cancer Red,1995;36:554
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23，Norton JC,Piatyszek MA,Wright WE,et al.Inhibition of human telomerase activity by peptide nucleic acids.Nat Biotechnol,1996;14(5):615
24，Kanazawa R,Ohykawa K,Ueda K,et al.Hammerhead ribozyme mediated inhibi tion of telomerase activity.Bilchem Biophys Res Commun,1996;225:570, http://www.100md.com