应用原位聚合酶链反应检测肝癌组织中bc1-2基因重排
作者：肖莎 吕俊豪 郭琳琅
单位：第一军医大学珠江医院病理科广州 510282
关键词：肝癌；原癌基因；聚合酶链反应
中国现代医学杂志000721 目的：探讨bc1-2基因重排与肝癌发生的关系。方法：采用半套式原位 聚合酶链反应检测40例肝细胞癌组织bc1-2/JH融合基因。结果：40例肝细胞癌发生bc1-2基 因重排有10例，阳性率为25%，各组织学分级间无明显差异。正常肝组织为阴性。结果说 明bc1-2基因重排并非淋巴瘤的特异改变，bc1-2基因重排在肝细胞癌变中可能起一定作用。
分类号 R735.7 R446.8
bc1-2基因重排是非何杰金氏淋巴瘤、特别是滤泡性淋巴瘤的主要分子 生 物学基础[1～3]。bc1-2基因断裂、易位与免疫球蛋白重链形成bc1-2/JH融合基 因，引起基因异常表达。肝癌细胞中有无bc1-2/JH融合基因形成尚不清楚，值得探讨。本研 究对40例肝癌石蜡包埋组织切片进行半套式原位聚合酶链反应扩增，再联合生物素探针进行 分子原位杂交检测bc1-2基因重排，并对其结果进行了原位观察。
, 百拇医药
1 材料与方法
40例肝细胞癌及7例正常肝组织标本均来自本院手术切除及活检组织。根据Edmondson-Stein er分类法，40例肝细胞癌中Ⅰ级7例，Ⅱ级18例，Ⅲ级15例。标本均经10%福尔马林固定，石 蜡包埋，4μm切片，贴于涂有APES的载玻片上60℃30min，半套式PCR一对半引物及生物素标 记寡核苷酸探针[4]由上海生物工程研究所合成。引物为bc1-2基因主要断裂区外 引物A1：5’-CAGCCTTGAAACATTGATGG-3’，内引物A2：5’-TATGGTGGTTTGACCTTTAG-3’，免 疫 球蛋白重链基因引物JH：5’-ACCTGGAGGAGACGGTGACC-3’，探针序列：5’-CCCTCCTGCCCTCC TTCCG-3’。原位PCR仪为西安飞机工业公司和第四军医大学联合研制。
半套式PCR原位扩增：石蜡切片脱蜡至水，0.1mol/L HCl 10min，10ug/ml蛋白酶K消化 室温1 0min,98℃2min，灭活蛋白酶。上行乙醇脱水吹干，滴加30ul PCR扩增反应液。PCR扩增分两 轮进行：第一轮用引物A1、JH扩增，第二轮用引物A2、JH扩增。热循环：94℃1min，55℃1m in，72℃1min,最后延伸10min。第一轮扩增25个循环，经0.01mol/L pH7.4P BS洗涤，加第 二 轮扩增液35个循环。分子原位杂交：揭去盖片，二甲苯洗涤，4%多聚甲醛固定10min，PBS洗 2×5min，吹干。滴加40ul杂交液(含探针0.8pmol/L)于切片上，98℃变性10min，37℃杂交 过夜。洗涤：2×SSC 2×10min,1×SSC 2×10min，buffer Ⅰ10min，buffer Ⅱ10min。2% 正 常牛血清封闭非特异性背景，滴加二抗，用碱性磷酸酶显色系统显色(福州迈新公司产)，显 微镜下观察，脱水，透明，封片。结果判定：阳性信号位于细胞核内，为紫蓝色，呈颗粒状 。
, http://www.100md.com
对照：用已知滤泡性淋巴瘤或B细胞淋巴瘤作阳性对照，瘤细胞核内见阳性信号反应。阴性 对照：PCR反应液不加Taq酶；杂交液不加探针。
2 结果
40例肝细胞癌中半套式原位聚合酶链的反应检测bc1-2/JH融合基因10例阳性，阳性率为25% 。肝癌各组织学分级中阳性例数分别为：Ⅰ级1例，Ⅱ级5例，Ⅲ级4例；各组间无明显差异( P>0.05)。癌旁肝细胞中发现2例出现bc1-2基因重排。阳性对照见淋巴瘤细胞核内有阳 性反应信号。7例正常肝组织中无1例bc1-2/JH基因阳性。阴性对照均为阴性。
3 讨论
bc1-2基因是一种凋亡相关基因，bc1-2/JH融合基因的形成引起bc1-2基因异常表达，在细胞凋亡过程中起抑制作用。bc1-2基因重排在淋巴瘤尤其是滤泡性淋巴瘤的发生中起重要 作用 [2，3]。本研究从分子水平研究bc1-2与肝癌发生的关系，根据bc1-2基因主要断 裂区设计一对半引物进行半套式PCR原位扩增，再用bc1-2主要断裂区特异性寡合苷酸探针进 行分子原位杂交，结果显示40例肝细胞癌中10例出现bc1-2/JH融合基因，阳性率为25%。说 明bc1-2基因重排可发生在除淋巴瘤之外的肿瘤，非淋巴瘤的特异改变，并提示bc1-2基因重 排在肝细胞癌变过程中可能起一定作用。此外，本研究除癌细胞外，在癌旁肝细胞中也检测 到bc1-2/JH融合基因，说明bc1-2基因重排非肿瘤细胞所特有，但阳性细胞是否表示细胞已 处于癌前状态，尚需进一步证实。
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鉴于半套式PCR具有特异、高效的特点，本研究在实验中先将石蜡切片进行原位扩增，再用 寡核苷酸探针杂交，从而提高了基因检测灵敏度，阳性检出率增高。本研究40例肝癌组织采 用单一的分子原位杂交检测，仅有4例检出bc1-2/JH融合基因，阳性占10%。但由于聚合酶链 反应受实验条件的影响，有可能使本为阴性的标本扩增出阳性产物，实验中我们对此高度重 视，每例标本进行2次分析，并用非相关组织作对照，以排除假阳性，从而使检测的结果更 客观，可信度更高。该方法对于低拷贝基因的形态学研究具有较强的实用价值。
参 考 文 献
1，Weiss LM,Clery ML.The t(14;18) chromosomal translocation in malignant lymophomas.N Eng J Med,1987;317:1187
2，Tsujimoto Y,Finger LR,Yunis J,et al.Cloning of the chromosome breakpoi nt of neoplastic B cell with the t(14;18) chromosome translocation.Science,1984; 226:1097
3，王 洁，李甘地，刘正明，等.滤泡型淋巴瘤的t(14;18)染色体易位与bc1-2蛋白 的表达.中华病理学杂志，1995；4(6)：337
4，Gribben JG,Freedman AS,Woo SD,et al.All advanced stage non-Hodgkin's l ymphomas with a polymerase chain reaction amplifiable breakpoint of bc1-2 have r esidual cells containing the bc1-2 rearrangement at evaluation and after treatme nt.Blood,1991;78:3275, 百拇医药
单位：第一军医大学珠江医院病理科广州 510282
关键词：肝癌；原癌基因；聚合酶链反应
中国现代医学杂志000721 目的：探讨bc1-2基因重排与肝癌发生的关系。方法：采用半套式原位 聚合酶链反应检测40例肝细胞癌组织bc1-2/JH融合基因。结果：40例肝细胞癌发生bc1-2基 因重排有10例，阳性率为25%，各组织学分级间无明显差异。正常肝组织为阴性。结果说 明bc1-2基因重排并非淋巴瘤的特异改变，bc1-2基因重排在肝细胞癌变中可能起一定作用。
分类号 R735.7 R446.8
bc1-2基因重排是非何杰金氏淋巴瘤、特别是滤泡性淋巴瘤的主要分子 生 物学基础[1～3]。bc1-2基因断裂、易位与免疫球蛋白重链形成bc1-2/JH融合基 因，引起基因异常表达。肝癌细胞中有无bc1-2/JH融合基因形成尚不清楚，值得探讨。本研 究对40例肝癌石蜡包埋组织切片进行半套式原位聚合酶链反应扩增，再联合生物素探针进行 分子原位杂交检测bc1-2基因重排，并对其结果进行了原位观察。
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1 材料与方法
40例肝细胞癌及7例正常肝组织标本均来自本院手术切除及活检组织。根据Edmondson-Stein er分类法，40例肝细胞癌中Ⅰ级7例，Ⅱ级18例，Ⅲ级15例。标本均经10%福尔马林固定，石 蜡包埋，4μm切片，贴于涂有APES的载玻片上60℃30min，半套式PCR一对半引物及生物素标 记寡核苷酸探针[4]由上海生物工程研究所合成。引物为bc1-2基因主要断裂区外 引物A1：5’-CAGCCTTGAAACATTGATGG-3’，内引物A2：5’-TATGGTGGTTTGACCTTTAG-3’，免 疫 球蛋白重链基因引物JH：5’-ACCTGGAGGAGACGGTGACC-3’，探针序列：5’-CCCTCCTGCCCTCC TTCCG-3’。原位PCR仪为西安飞机工业公司和第四军医大学联合研制。
半套式PCR原位扩增：石蜡切片脱蜡至水，0.1mol/L HCl 10min，10ug/ml蛋白酶K消化 室温1 0min,98℃2min，灭活蛋白酶。上行乙醇脱水吹干，滴加30ul PCR扩增反应液。PCR扩增分两 轮进行：第一轮用引物A1、JH扩增，第二轮用引物A2、JH扩增。热循环：94℃1min，55℃1m in，72℃1min,最后延伸10min。第一轮扩增25个循环，经0.01mol/L pH7.4P BS洗涤，加第 二 轮扩增液35个循环。分子原位杂交：揭去盖片，二甲苯洗涤，4%多聚甲醛固定10min，PBS洗 2×5min，吹干。滴加40ul杂交液(含探针0.8pmol/L)于切片上，98℃变性10min，37℃杂交 过夜。洗涤：2×SSC 2×10min,1×SSC 2×10min，buffer Ⅰ10min，buffer Ⅱ10min。2% 正 常牛血清封闭非特异性背景，滴加二抗，用碱性磷酸酶显色系统显色(福州迈新公司产)，显 微镜下观察，脱水，透明，封片。结果判定：阳性信号位于细胞核内，为紫蓝色，呈颗粒状 。
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对照：用已知滤泡性淋巴瘤或B细胞淋巴瘤作阳性对照，瘤细胞核内见阳性信号反应。阴性 对照：PCR反应液不加Taq酶；杂交液不加探针。
2 结果
40例肝细胞癌中半套式原位聚合酶链的反应检测bc1-2/JH融合基因10例阳性，阳性率为25% 。肝癌各组织学分级中阳性例数分别为：Ⅰ级1例，Ⅱ级5例，Ⅲ级4例；各组间无明显差异( P>0.05)。癌旁肝细胞中发现2例出现bc1-2基因重排。阳性对照见淋巴瘤细胞核内有阳 性反应信号。7例正常肝组织中无1例bc1-2/JH基因阳性。阴性对照均为阴性。
3 讨论
bc1-2基因是一种凋亡相关基因，bc1-2/JH融合基因的形成引起bc1-2基因异常表达，在细胞凋亡过程中起抑制作用。bc1-2基因重排在淋巴瘤尤其是滤泡性淋巴瘤的发生中起重要 作用 [2，3]。本研究从分子水平研究bc1-2与肝癌发生的关系，根据bc1-2基因主要断 裂区设计一对半引物进行半套式PCR原位扩增，再用bc1-2主要断裂区特异性寡合苷酸探针进 行分子原位杂交，结果显示40例肝细胞癌中10例出现bc1-2/JH融合基因，阳性率为25%。说 明bc1-2基因重排可发生在除淋巴瘤之外的肿瘤，非淋巴瘤的特异改变，并提示bc1-2基因重 排在肝细胞癌变过程中可能起一定作用。此外，本研究除癌细胞外，在癌旁肝细胞中也检测 到bc1-2/JH融合基因，说明bc1-2基因重排非肿瘤细胞所特有，但阳性细胞是否表示细胞已 处于癌前状态，尚需进一步证实。
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鉴于半套式PCR具有特异、高效的特点，本研究在实验中先将石蜡切片进行原位扩增，再用 寡核苷酸探针杂交，从而提高了基因检测灵敏度，阳性检出率增高。本研究40例肝癌组织采 用单一的分子原位杂交检测，仅有4例检出bc1-2/JH融合基因，阳性占10%。但由于聚合酶链 反应受实验条件的影响，有可能使本为阴性的标本扩增出阳性产物，实验中我们对此高度重 视，每例标本进行2次分析，并用非相关组织作对照，以排除假阳性，从而使检测的结果更 客观，可信度更高。该方法对于低拷贝基因的形态学研究具有较强的实用价值。
参 考 文 献
1，Weiss LM,Clery ML.The t(14;18) chromosomal translocation in malignant lymophomas.N Eng J Med,1987;317:1187
2，Tsujimoto Y,Finger LR,Yunis J,et al.Cloning of the chromosome breakpoi nt of neoplastic B cell with the t(14;18) chromosome translocation.Science,1984; 226:1097
3，王 洁，李甘地，刘正明，等.滤泡型淋巴瘤的t(14;18)染色体易位与bc1-2蛋白 的表达.中华病理学杂志，1995；4(6)：337
4，Gribben JG,Freedman AS,Woo SD,et al.All advanced stage non-Hodgkin's l ymphomas with a polymerase chain reaction amplifiable breakpoint of bc1-2 have r esidual cells containing the bc1-2 rearrangement at evaluation and after treatme nt.Blood,1991;78:3275, 百拇医药