肾病综合征患儿血小板活化与活性氧
作者：白晓玲 许波 郑楠 段晓辉 孙晓明 尹格平 姚慧
单位：白晓玲 许波 郑楠 段晓辉 孙晓明 尹格平(济南军医总医院250031)；姚慧(山东省千佛山医院济南 250000)
关键词：肾病综合征；血小板膜糖蛋白；活性氧；流式细胞术
中国现代医学杂志000718 目的：探讨原发性肾病综合征(NS)患儿血小板活化与活性氧的关系。方 法：采用流式细胞术检测了38例NS患儿外周血小板膜糖蛋白CD62P、CD63阳性表达率，并检 测了外周血SOD活性及MDA含量。结果：NS活动期CD62P、CD63及MDA均显著增高，SOD明显下 降，恢复期接近正常对照组水平；CD62P、CD63与SOD明显负相关，与MDA明显正相关。结论 ：NS活动期血小板活化异常与机体活性氧产生之间存在一定的相互关系，可能是小儿NS重要 的发病机制之一。
, http://www.100md.com 分类号 R692
笔者采用流式细胞术，检测了38例NS患儿外周血血小板膜糖蛋白CD62P、CD63阳性表达率， 并检 测了外周血超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量，以保持NS患儿血小板活化与机体 氧化、抗氧化的相互关系及其临床意义。
1 对象与方法
1.1 对象
1997年1月以来收治的NS患儿38例，诊断标准均符合1981年全国小儿肾小球疾病科研协作组 修订的方案。38例中男25例，女13例，年龄1.5～12岁，病程1周～6年，初发22例，反复或 复发16例，肾组织活检8例，其中系膜增生型肾炎5例，局灶节段硬化1例，IgM肾病2例，对 照组为健康儿童20例，男12例，女8例，年龄2～12岁。
1.2 方法
, http://www.100md.com
1.2.1 特殊试剂 异硫氰酸荧光素(FITC)标记的鼠抗人膜糖蛋白CD62P-FIT C、CD63-FITC及阴性对照羊抗鼠IgG1-FITC，均由法国国际免疫公司提供；四乙氧基丙烷 (TEP)为Flukda产品，硫代巴比妥酸(上海试剂二厂生产)，连苯三酚(遵义化工厂生产)。
1.2.2 CD62P、CD63测定 空腹静脉血2ml，2%EDTA抗凝，800r/min离心5mi n，取上清高含血小板血清100μl(调整血小板数2×106/ml)，加荧光单抗20μl，避 光反应30min，PBS漂洗，2?000r/min离心5min,弃上清，加PBS 500μl,用美国BD公司生产 的 FACscan型流式细胞仪进行测试，上机后收集2×104个血小板，在Macintosh650计算机上 用Cell Quest软件(BD公司产)分析数据，由HP120 OC/PS打印结果。
1.2.3 SOD活性测定 采用改良连苯三酚自氧化法[1]测定。
, http://www.100md.com
1.2.4 MDA含量测定 采用硫代巴比妥酸比色法[2]测定。
1.2.5 统计学方法 采用单因素方差分析，q检验及t检验，直线相关 分析。
2 结果
NS活动期外周血血小板CD62P、CD63阳性细胞表达率明显增高，缓解期下降，接近正常对照 组水平(见附表)。
附表 NS患儿CD62P、CD63、SOD及MDA变化 (
±s ) 组别
n
CD62P(%)
CD63(%)
, http://www.100md.com
SOD(u/L)
MDAμmol/L
活动期
38
5.01±3.011)2)
4.16±2.051)2)
0.35±0.061) 2)
4.75±1.381)2)
缓解期
31
1.93±1.06
, 百拇医药
2.13±1.28
0.40±0.06
3.46±0.97
对照组
20
1.82±1.33
2.11±1.25
0.43±0.07
2.96±0.31
F
21.02
11.10
, 百拇医药
14.68
4.56
注：1)与对照组比较P<0.01
2)与缓解期比较P<0.01
NS活动期外周血SOD活性明显下降，MDA 含量显著增高，与缓解期及对照组比较，均P<0.01，有显著性差异(见附表)。
NS单纯型肾病26例，CD62P、CD63表达率分别为(4.84±2.86)%，(4.03±1.80)%，SOD活性为 (0.346±0.06)u/L,MDA含量为(4.610±1.25)μmol/L；肾炎型肾病12例，以上指标分别为(5.39±3.40)%，(4.41±2.52)%，(0.345±0.06)u/L,(5.060±1.65)μmol/L，两种类 型NS之间无显著性差异(P>0.05)。
, 百拇医药
NS活动期CD62P、CD63表达率与SOD活性呈明显负相关，γ分别为-0.522及-0.398，均P <0.01，与MDA呈明显正相关，γ分别为0.423及0.357，P<0.01及P<0.05。
3 讨论
本研究结果显示，NS患儿活动期血小板CD62P及CD63表达率显著 增高，表明NS患儿体内血小板活化程度增高，随着疾病缓解CD62P、CD63表达水平均明显下 降，提示活化的血小板参与了肾小球疾病的发病过程，其活化程度与疾病的转归有关。同时 观察到NS患儿活动期MDA含量显著增高，SOD活性明显下降，缓解期均接近正常对照组水平， 表明NS活动期活性氧的产生增高，机体氧化及抗氧化平衡失调。
CD62P及CD63表达水平与MDA含量呈明显正相关，与SOD活性明显负相关，提示血小板活化与 机体内活性氧的产生存在一定的内在联系，在肾小球疾病时，由于肾脏出现免疫性炎症反 应 ，免疫复合物、补体、组胺及凝血酶等均可使血小板激活，CD62P介导了活化的血小板或内 皮 细胞与中性粒细胞、单核细胞粘附，在其他粘附分子的协同作用下，使白细胞在肾脏浸润 [3]，而CD63则在与中性粒细胞粘附过程中起活化信号传递作用[4]。激活 中性粒细胞发生呼吸爆发，产生大量的活性氧，血小板活化时本身也能产生活性氧，通过膜 脂质过氧化反应破坏肾小球基底膜和上皮细胞，造成肾组织病理损害。无论是外源性的O-2或血小板自身源性O-2均可诱导血小板活化及内皮细胞上表达CD62P[5，6 ]，导致血小板聚集、释放、而肾小球内血小板聚集可引起肾小球内细胞增生及细外基 质沉积，加重和扩大了肾组织病理损害。
, 百拇医药
济南军医科研经费资助
参 考 文 献
1，邓碧玉，袁勤生，李文杰.改良的连苯三酚自氧化测定超氧化物歧化酶活性的方 法.生物化学与生物物理进展，1991；18：163
2，Yagi KA.A simple flourometric assay for lipoperoxide in blood plsma.Bi ochem Med,1976;15:212
3，Tipping PG,Huang XR,Bemdt XR,et al.A role for P selection in complemen t-independent neurtophil-medfiated glomerular injury.Kidney Int,1994;46:779～788
, 百拇医药
4，Skubitz KM,Campbcell KD,J.CD63 associatcds with tyrosinekinase activit y and CD11/CD18,and transmits and activation signalin neutrophils.J Immunol,1996 ;157:3617～3626
5，刘立根综述.活性氧与血小板活化.国外医学输血及血液学分册.1995；18：364～ 366
6，Nagata K,Tsuji T,Todorki N,et al.Activatd platelets induce superoxide anion release by monocytes and neutrophils through Pselectin(CD62).J Immunol,199 3;151:3267～3273, 百拇医药
单位：白晓玲 许波 郑楠 段晓辉 孙晓明 尹格平(济南军医总医院250031)；姚慧(山东省千佛山医院济南 250000)
关键词：肾病综合征；血小板膜糖蛋白；活性氧；流式细胞术
中国现代医学杂志000718 目的：探讨原发性肾病综合征(NS)患儿血小板活化与活性氧的关系。方 法：采用流式细胞术检测了38例NS患儿外周血小板膜糖蛋白CD62P、CD63阳性表达率，并检 测了外周血SOD活性及MDA含量。结果：NS活动期CD62P、CD63及MDA均显著增高，SOD明显下 降，恢复期接近正常对照组水平；CD62P、CD63与SOD明显负相关，与MDA明显正相关。结论 ：NS活动期血小板活化异常与机体活性氧产生之间存在一定的相互关系，可能是小儿NS重要 的发病机制之一。
, http://www.100md.com 分类号 R692
笔者采用流式细胞术，检测了38例NS患儿外周血血小板膜糖蛋白CD62P、CD63阳性表达率， 并检 测了外周血超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量，以保持NS患儿血小板活化与机体 氧化、抗氧化的相互关系及其临床意义。
1 对象与方法
1.1 对象
1997年1月以来收治的NS患儿38例，诊断标准均符合1981年全国小儿肾小球疾病科研协作组 修订的方案。38例中男25例，女13例，年龄1.5～12岁，病程1周～6年，初发22例，反复或 复发16例，肾组织活检8例，其中系膜增生型肾炎5例，局灶节段硬化1例，IgM肾病2例，对 照组为健康儿童20例，男12例，女8例，年龄2～12岁。
1.2 方法
, http://www.100md.com
1.2.1 特殊试剂 异硫氰酸荧光素(FITC)标记的鼠抗人膜糖蛋白CD62P-FIT C、CD63-FITC及阴性对照羊抗鼠IgG1-FITC，均由法国国际免疫公司提供；四乙氧基丙烷 (TEP)为Flukda产品，硫代巴比妥酸(上海试剂二厂生产)，连苯三酚(遵义化工厂生产)。
1.2.2 CD62P、CD63测定 空腹静脉血2ml，2%EDTA抗凝，800r/min离心5mi n，取上清高含血小板血清100μl(调整血小板数2×106/ml)，加荧光单抗20μl，避 光反应30min，PBS漂洗，2?000r/min离心5min,弃上清，加PBS 500μl,用美国BD公司生产 的 FACscan型流式细胞仪进行测试，上机后收集2×104个血小板，在Macintosh650计算机上 用Cell Quest软件(BD公司产)分析数据，由HP120 OC/PS打印结果。
1.2.3 SOD活性测定 采用改良连苯三酚自氧化法[1]测定。
, http://www.100md.com
1.2.4 MDA含量测定 采用硫代巴比妥酸比色法[2]测定。
1.2.5 统计学方法 采用单因素方差分析，q检验及t检验，直线相关 分析。
2 结果
NS活动期外周血血小板CD62P、CD63阳性细胞表达率明显增高，缓解期下降，接近正常对照 组水平(见附表)。
附表 NS患儿CD62P、CD63、SOD及MDA变化 (
±s ) 组别n
CD62P(%)
CD63(%)
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SOD(u/L)
MDAμmol/L
活动期
38
5.01±3.011)2)
4.16±2.051)2)
0.35±0.061) 2)
4.75±1.381)2)
缓解期
31
1.93±1.06
, 百拇医药
2.13±1.28
0.40±0.06
3.46±0.97
对照组
20
1.82±1.33
2.11±1.25
0.43±0.07
2.96±0.31
F
21.02
11.10
, 百拇医药
14.68
4.56
注：1)与对照组比较P<0.01
2)与缓解期比较P<0.01
NS活动期外周血SOD活性明显下降，MDA 含量显著增高，与缓解期及对照组比较，均P<0.01，有显著性差异(见附表)。
NS单纯型肾病26例，CD62P、CD63表达率分别为(4.84±2.86)%，(4.03±1.80)%，SOD活性为 (0.346±0.06)u/L,MDA含量为(4.610±1.25)μmol/L；肾炎型肾病12例，以上指标分别为(5.39±3.40)%，(4.41±2.52)%，(0.345±0.06)u/L,(5.060±1.65)μmol/L，两种类 型NS之间无显著性差异(P>0.05)。
, 百拇医药
NS活动期CD62P、CD63表达率与SOD活性呈明显负相关，γ分别为-0.522及-0.398，均P <0.01，与MDA呈明显正相关，γ分别为0.423及0.357，P<0.01及P<0.05。
3 讨论
本研究结果显示，NS患儿活动期血小板CD62P及CD63表达率显著 增高，表明NS患儿体内血小板活化程度增高，随着疾病缓解CD62P、CD63表达水平均明显下 降，提示活化的血小板参与了肾小球疾病的发病过程，其活化程度与疾病的转归有关。同时 观察到NS患儿活动期MDA含量显著增高，SOD活性明显下降，缓解期均接近正常对照组水平， 表明NS活动期活性氧的产生增高，机体氧化及抗氧化平衡失调。
CD62P及CD63表达水平与MDA含量呈明显正相关，与SOD活性明显负相关，提示血小板活化与 机体内活性氧的产生存在一定的内在联系，在肾小球疾病时，由于肾脏出现免疫性炎症反 应 ，免疫复合物、补体、组胺及凝血酶等均可使血小板激活，CD62P介导了活化的血小板或内 皮 细胞与中性粒细胞、单核细胞粘附，在其他粘附分子的协同作用下，使白细胞在肾脏浸润 [3]，而CD63则在与中性粒细胞粘附过程中起活化信号传递作用[4]。激活 中性粒细胞发生呼吸爆发，产生大量的活性氧，血小板活化时本身也能产生活性氧，通过膜 脂质过氧化反应破坏肾小球基底膜和上皮细胞，造成肾组织病理损害。无论是外源性的O-2或血小板自身源性O-2均可诱导血小板活化及内皮细胞上表达CD62P[5，6 ]，导致血小板聚集、释放、而肾小球内血小板聚集可引起肾小球内细胞增生及细外基 质沉积，加重和扩大了肾组织病理损害。
, 百拇医药
济南军医科研经费资助
参 考 文 献
1，邓碧玉，袁勤生，李文杰.改良的连苯三酚自氧化测定超氧化物歧化酶活性的方 法.生物化学与生物物理进展，1991；18：163
2，Yagi KA.A simple flourometric assay for lipoperoxide in blood plsma.Bi ochem Med,1976;15:212
3，Tipping PG,Huang XR,Bemdt XR,et al.A role for P selection in complemen t-independent neurtophil-medfiated glomerular injury.Kidney Int,1994;46:779～788
, 百拇医药
4，Skubitz KM,Campbcell KD,J.CD63 associatcds with tyrosinekinase activit y and CD11/CD18,and transmits and activation signalin neutrophils.J Immunol,1996 ;157:3617～3626
5，刘立根综述.活性氧与血小板活化.国外医学输血及血液学分册.1995；18：364～ 366
6，Nagata K,Tsuji T,Todorki N,et al.Activatd platelets induce superoxide anion release by monocytes and neutrophils through Pselectin(CD62).J Immunol,199 3;151:3267～3273, 百拇医药