大肠癌Fas、FasL表达、突变与肝转移关系的研究
作者：于波 李世拥 安萍 梁振家 苑树俊
单位：北京军区总医院普外科100700
关键词：结直肠肿瘤Fas＼FasL系统；肝转移
中国现代医学杂志000703
目的：探讨Fas、FasL系统表达、突变与大肠癌转移的关系。方法：采 用RT-PCR和P CR-SSCP方法检测大肠癌原发灶、肝转移灶、癌旁肠粘膜、门静脉血淋巴细胞中Fas、FasL表 达、突变。结果：在86例大肠癌原发灶、肝转移灶、癌旁肠粘膜、门静脉血淋巴细胞中Fas 表达阳 性率分别为67.4%，63.2%，41.9%，87.2%。Fas突变率分别为50.0%，70.8%，25.%，8.0%。 在大肠癌原发灶、肝转移灶中Fas突变率较高(P<0.01)。38例肝转移灶中全部有FasL表 达，而在原发灶、癌旁肠粘膜、门静脉血淋巴细胞中FasL表达阳性率分别为25.6%，14.0 %， 50.0%。肝转移灶中FasL表达高于其它组织(P<0.01)。结论：Fas突变和FasL增强表达 是大肠癌细胞逃避免疫监视和杀伤并发生肝转移的机制之一。
, 百拇医药
分类号 R735.3+4
STUDY OF THE RELATION OF EXPRESSION AND
MUTATION OF FAS AND FASL WITH HEPATIC METASTASIS
OF COLORECTAL CARCINOMA
Yu Bo, Li Shiyong, An Ping, et al.
(Department of General Surgery, Beijing Military Area General Hospital, B eijing 100700)
Abstract: To study the relationship of expression and mutati on of Fas and FasL w ith hepatic metastasis of colorectal carcinoma. RT-PCR and PCR-SSCP was used to detect expression and mutation of Fas and FasL in primary foci, hepatic metastas is, paracancer mucosa and lymphocytes in portal vein blood. In 86 cases of large intestinal cancer, the positive rates of Fas expression in primary foci, hepati c metastasis, paracancer mucosa and the blood lymphocytes were 67.4%, 63.2%, 41. 9%, 87.2% respectively. And the rates of Fas mutations were 50.0%, 70.8%, 25.0%, 8.0% in the different tissues. The rates of Fas mutations in primary foci and h epatic metastasis were higher than that in paracancer mucosa and the blood lymph ocytes (P<0.01). The positive expression of FasL was discovered in all 38 hepati c metastasis. But in primary foci, paracancer mucosa and blood lymphocytes, FasL expression rates were 25.6%, 14.0%, 50.0% respectively. The expression of FasL in hepatic metastasis was higher than that in other tissues (P<0.01). But the co ntrast of FasL mutations in the tissues was no significant difference. Mutation of Fas and expression of FasL in large intestinal cancer cells is one of the me chanisms with which carcinoma cells escape from immune surveillance and being ki lled and result in hepatic metastasis.
, 百拇医药
Key words: Colorectal Neoplasms; Fas＼FasL System; Hepatic Metas tasis
肿瘤细胞逃逸机体免疫监视，是癌细胞发生转移的重要原因。FasL(Fa s ligand)及其受体Fas在机体免疫调节中起着重要作用，我们通过检测大肠癌Fas＼FasL系 统的表达、突变，探讨Fas＼FasL在大肠癌细胞逃避免疫系统监视和杀伤及发生肝转移中的作用。
1 资料与方法
1.1 一般资料
我院大肠癌患者86例，男46例，女40例，年龄28～85岁，平均55.6岁。均行手术治疗，经病 理组织学证实。其中高分化腺癌21例，中分化腺部23例，低分化腺癌22例，粘液腺癌20例。 术中发现肝转移者38例。
, 百拇医药 1.2 标本采集
取手术切除大肠癌新鲜标本原发灶、癌旁肠粘膜、肝转移灶组织。所有病例均于术中采集门 静脉血10ml，用Ficoll-Hypaque溶液分离门静脉血淋巴细胞。
1.3 检测Fas、FasL表达
采用RT-PCR方法检测大肠癌原发灶、癌旁肠粘膜、肝转移灶、门静脉血淋巴细胞中Fas、Fas L表达。Fas引物序列：5’-CTGTTACTACAGTTGAGACTC-3’，5’-CTTCCTGTACCGAATCTTC-3’， 扩增片段为225bp。FasL引物序列：5’-CTGGGGATGTTTCAGCTCTTC-3’，5’-CTTCACTCCAGAAA GCAGGAC-3’，扩增片段为210bp。用β-actin为内参照，引物序列：5’-ATCTGGCACCACACCC TTCTACAATGAG-3’，5’-CGTCATACTCCTGCTTCTACAATGAG-3’，扩增片段为838bp。
, 百拇医药
1.4 Fas、FasL突变检测
采用PCR-SSCP方法[1]检测Fas、FasL突变情况。
1.5 统计学处理
应用SPSS统计软件对不同组别间Fas、FasL表达、突变检测结果行χ2检验。
2 结果
2.1 Fas、FasL表达、突变检测结果
86例大肠癌原发灶、癌旁肠粘膜、肝转移灶、门静脉血淋巴细胞中Fas、FasL表达、突变检 测结果见附表。在大肠癌原发灶中，高分化、中分化、低分化及粘液腺癌组织中Fas表达(χ2=0.357，P>0.05)，突变(χ2=1.546，P>0.05)均无显著性差别。但 在4 种不同病理类型中，FasL表达有显著性差别(χ2=7.325，P<0.05)。低分化腺癌和粘 液腺癌原发灶中FasL表达较高。FasL突变的差别无显著性意义(χ2=3.653，P>0.05) 。在38例肝转移组的原发灶中，检测出Fas表达24例，突变17例。在无肝转移组48例原发灶 中发现Fas表达34例，突变12例。两组原发灶中Fas表达(χ 2=1.33，P>0.05)、突变(χ2=1.59，P>0.05)无显著性差别。但FasL表达在 肝转移组原发灶中为44.7%(17/38)，而在无肝转移组原发病灶为10.4%(5/48)，两组的差别 有显著性意义(χ2=5.42，P<0.05)。肝转移组原发灶中FasL表达高于无肝转移组。
, 百拇医药
附表 86例大肠癌Fas＼FasL系统表达、突变检测结果
例数
Fas
FasL
表达(+)
表达(-)
表达(+)
表达(-)
原发灶
86
58
29
20
, 百拇医药
5
高分化腺癌
21
19
6
2
0
中分化腺癌
23
16
7
3
1
低分化腺癌
, 百拇医药
22
12
8
8
2
粘液腺癌
20
11
8
7
2
癌旁肠粘膜
86
36
, 百拇医药
9
12
1
肝转移灶
38
24
17
38
4
血淋巴细胞
86
75
6
43
, 百拇医药
3
2.2 Fas、FasL表达、突变与大肠癌肝转移的关系
大肠癌原发灶、肝转移灶、癌旁肠粘膜及血淋巴细胞中的Fas表达阳性率分别为67.4 %，63.2 %，41.9%，87.2%，其差别无显著性意义(χ2=2.51，P>0.05)。Fas突变率分别 为50. 0%，70.8%，25.0%，8.0%，其差别有显著性意义(χ2=56.32，P<0.01)。原 发灶和肝 转移灶中Fas突变率较高。在原发灶、肝转移灶、癌旁肠粘膜和血淋巴细胞中FasL表达阳性 率分别为25.6%，100%，14.0%，50.0%，其表达有显著性差别(χ2=62.59，P<0. 01)。肝转移灶中FasL表达比其它组织高，但不同组中FasL突变无显著性差别(χ2=3.46， P>0.05)。3 讨论
大肠癌根治性术后失败的主要原因是出现肝转移。来自结直肠的恶性肿瘤细胞经门静脉途径 到达肝脏后，必须逃逸免疫系统监视和杀伤并适应肝脏的微环境才能生长、增殖，发展成 为临床转移病灶。免疫细胞的Fas＼FasL系统在清除肿瘤细胞，实现免疫防御和免疫监视方 面发挥着重要作用。有些肿瘤细胞可表达Fas，而CTL细胞被抗原激活后可迅速高表达FasL。 这样，被激活的CTL便以FasL与肿瘤细胞的Fas结合，通过不依赖穿孔素的Fas＼FasL途径使 肿瘤细胞死亡，这是免疫系统实现免疫监视与防御的机制之一[2]。
, http://www.100md.com
本实验结果表明，大肠癌原发灶、癌旁粘膜和门静脉血淋巴细胞中Fas表达无显著差别，但 在癌原发灶中Fas突变率较高。我们所设计的引物经RT-PCR扩增后得到的产物包括了Fas部分 胞外区、跨膜区和部分胞浆内信号传递区的cDNA序列，这些区域的突变可影响Fas的功能， 使得免疫细胞所表达的FasL不能与之结合，从而使肿瘤细胞对Fas＼FasL系统诱导的凋亡产 生抗性。虽然在大肠癌原发灶中Fas的表达、突变与病理组织学类型无关，但FasL表达与原 发灶癌细胞的分化程度有关。我们还发现在肝转移组原发灶中FasL表达比无肝转移组高。而 机体免疫细胞，包括T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞等均可表达Fas。这样，免疫细胞非 但不能杀伤肿瘤细胞，FasL+肿瘤细胞与免疫细胞Fas受体结合后，通过Fas＼FasL系统反 而诱导免疫细胞如CTL细胞凋亡，使肿瘤细胞能够逃避免疫系统杀伤而发生转移。
在肝转移灶中，Fas表达检测结果也表明其突变率较高。而且在肝转移灶中全部有FasL表达 。说明肿瘤细胞中FasL表达与大肠癌肝转移有密切关系。FasL属TNF家族成员，主要在淋巴 组织 中表达，T细胞活化后FasL表达增加，FasL表达于被激活的CD8+ CTL细胞表面，籍FasL 与肿瘤细胞的Fas结合，对肿瘤细胞发挥不依赖穿孔素的杀伤作用。FasL胞外区与Fas+细 胞结合后，可诱导Fas+细胞凋亡，而对Fas-细胞无作用[3]。经门静脉系统 到达肝脏的大肠癌细胞，在出现Fas突变和FasL表达后，不但可逃避免疫细胞Fas＼FasL系统 的 杀伤，而且可通过Fas＼FasL系统诱导机体免疫细胞的凋亡，从而使癌细胞得以生长、增殖 ，发展成临床转移病灶。
, 百拇医药
细胞凋亡机制在肿瘤细胞免疫逸逃逸中起着重要作用。有些肿瘤如肝癌、乳腺癌在逃逸免疫 监 视和杀伤时表现为Fas表达下调或缺失[4]。但在大肠癌肝转移时出现的是Fas突变 和FasL高表达。这些都表明Fas＼FasL系统是肿瘤细胞逃避免疫监视，抗拒细胞凋亡的重要 途径。Fas＼FasL系统所诱导的细胞凋亡机制在机体与肿瘤细胞对抗中具有重要的生物学意 义。一方面，机体利用细胞凋亡机制清除肿瘤细胞，实现机体的抗肿瘤作用；另一方面， 肿瘤细胞也可利用细胞凋亡机制清除衰老肿瘤细胞和正常免疫细胞，维持肿瘤细胞的生长、 增殖，并促进转移。因此，检测大肠癌原发灶和门静脉血淋巴细胞Fas＼FasL系统改变对临 床预 测肝转移有重要意义。调节肝转移癌细胞Fas表达、以转移癌细胞FasL为靶标，可作为防治 大肠癌肝转移的一条新途径。
参 考 文 献
1，李世拥，于 波，安 萍，等.胆汁中的突变基因与大肠癌肝转移关系的研究.中 华外科杂志，1999；37：106～107
, 百拇医药
2，Lee RK,Spielman J,Zhao DY,et al.Perforin,Fas ligand,and tumor necrosis factor are the major cytoxic molecules used by lyphokine-activated killer cells .J Immunol,1996;157:1919～1925
3，Walker PR,Dietrich PY.Role of Fas ligand (CD95L) in immune escape:the tumor cell striks bak.J Immunol,1997;158:4521～4524
4，Keane MM,Ettenberg SA,Lowry GA,et al.Fas expression and function in no rmal and malignant breast cell lines.Cancer Res,1996;56:4791～4798, 百拇医药
单位：北京军区总医院普外科100700
关键词：结直肠肿瘤Fas＼FasL系统；肝转移
中国现代医学杂志000703
目的：探讨Fas、FasL系统表达、突变与大肠癌转移的关系。方法：采 用RT-PCR和P CR-SSCP方法检测大肠癌原发灶、肝转移灶、癌旁肠粘膜、门静脉血淋巴细胞中Fas、FasL表 达、突变。结果：在86例大肠癌原发灶、肝转移灶、癌旁肠粘膜、门静脉血淋巴细胞中Fas 表达阳 性率分别为67.4%，63.2%，41.9%，87.2%。Fas突变率分别为50.0%，70.8%，25.%，8.0%。 在大肠癌原发灶、肝转移灶中Fas突变率较高(P<0.01)。38例肝转移灶中全部有FasL表 达，而在原发灶、癌旁肠粘膜、门静脉血淋巴细胞中FasL表达阳性率分别为25.6%，14.0 %， 50.0%。肝转移灶中FasL表达高于其它组织(P<0.01)。结论：Fas突变和FasL增强表达 是大肠癌细胞逃避免疫监视和杀伤并发生肝转移的机制之一。
, 百拇医药
分类号 R735.3+4
STUDY OF THE RELATION OF EXPRESSION AND
MUTATION OF FAS AND FASL WITH HEPATIC METASTASIS
OF COLORECTAL CARCINOMA
Yu Bo, Li Shiyong, An Ping, et al.
(Department of General Surgery, Beijing Military Area General Hospital, B eijing 100700)
Abstract: To study the relationship of expression and mutati on of Fas and FasL w ith hepatic metastasis of colorectal carcinoma. RT-PCR and PCR-SSCP was used to detect expression and mutation of Fas and FasL in primary foci, hepatic metastas is, paracancer mucosa and lymphocytes in portal vein blood. In 86 cases of large intestinal cancer, the positive rates of Fas expression in primary foci, hepati c metastasis, paracancer mucosa and the blood lymphocytes were 67.4%, 63.2%, 41. 9%, 87.2% respectively. And the rates of Fas mutations were 50.0%, 70.8%, 25.0%, 8.0% in the different tissues. The rates of Fas mutations in primary foci and h epatic metastasis were higher than that in paracancer mucosa and the blood lymph ocytes (P<0.01). The positive expression of FasL was discovered in all 38 hepati c metastasis. But in primary foci, paracancer mucosa and blood lymphocytes, FasL expression rates were 25.6%, 14.0%, 50.0% respectively. The expression of FasL in hepatic metastasis was higher than that in other tissues (P<0.01). But the co ntrast of FasL mutations in the tissues was no significant difference. Mutation of Fas and expression of FasL in large intestinal cancer cells is one of the me chanisms with which carcinoma cells escape from immune surveillance and being ki lled and result in hepatic metastasis.
, 百拇医药
Key words: Colorectal Neoplasms; Fas＼FasL System; Hepatic Metas tasis
肿瘤细胞逃逸机体免疫监视，是癌细胞发生转移的重要原因。FasL(Fa s ligand)及其受体Fas在机体免疫调节中起着重要作用，我们通过检测大肠癌Fas＼FasL系 统的表达、突变，探讨Fas＼FasL在大肠癌细胞逃避免疫系统监视和杀伤及发生肝转移中的作用。
1 资料与方法
1.1 一般资料
我院大肠癌患者86例，男46例，女40例，年龄28～85岁，平均55.6岁。均行手术治疗，经病 理组织学证实。其中高分化腺癌21例，中分化腺部23例，低分化腺癌22例，粘液腺癌20例。 术中发现肝转移者38例。
, 百拇医药 1.2 标本采集
取手术切除大肠癌新鲜标本原发灶、癌旁肠粘膜、肝转移灶组织。所有病例均于术中采集门 静脉血10ml，用Ficoll-Hypaque溶液分离门静脉血淋巴细胞。
1.3 检测Fas、FasL表达
采用RT-PCR方法检测大肠癌原发灶、癌旁肠粘膜、肝转移灶、门静脉血淋巴细胞中Fas、Fas L表达。Fas引物序列：5’-CTGTTACTACAGTTGAGACTC-3’，5’-CTTCCTGTACCGAATCTTC-3’， 扩增片段为225bp。FasL引物序列：5’-CTGGGGATGTTTCAGCTCTTC-3’，5’-CTTCACTCCAGAAA GCAGGAC-3’，扩增片段为210bp。用β-actin为内参照，引物序列：5’-ATCTGGCACCACACCC TTCTACAATGAG-3’，5’-CGTCATACTCCTGCTTCTACAATGAG-3’，扩增片段为838bp。
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1.4 Fas、FasL突变检测
采用PCR-SSCP方法[1]检测Fas、FasL突变情况。
1.5 统计学处理
应用SPSS统计软件对不同组别间Fas、FasL表达、突变检测结果行χ2检验。
2 结果
2.1 Fas、FasL表达、突变检测结果
86例大肠癌原发灶、癌旁肠粘膜、肝转移灶、门静脉血淋巴细胞中Fas、FasL表达、突变检 测结果见附表。在大肠癌原发灶中，高分化、中分化、低分化及粘液腺癌组织中Fas表达(χ2=0.357，P>0.05)，突变(χ2=1.546，P>0.05)均无显著性差别。但 在4 种不同病理类型中，FasL表达有显著性差别(χ2=7.325，P<0.05)。低分化腺癌和粘 液腺癌原发灶中FasL表达较高。FasL突变的差别无显著性意义(χ2=3.653，P>0.05) 。在38例肝转移组的原发灶中，检测出Fas表达24例，突变17例。在无肝转移组48例原发灶 中发现Fas表达34例，突变12例。两组原发灶中Fas表达(χ 2=1.33，P>0.05)、突变(χ2=1.59，P>0.05)无显著性差别。但FasL表达在 肝转移组原发灶中为44.7%(17/38)，而在无肝转移组原发病灶为10.4%(5/48)，两组的差别 有显著性意义(χ2=5.42，P<0.05)。肝转移组原发灶中FasL表达高于无肝转移组。
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附表 86例大肠癌Fas＼FasL系统表达、突变检测结果
例数
Fas
FasL
表达(+)
表达(-)
表达(+)
表达(-)
原发灶
86
58
29
20
, 百拇医药
5
高分化腺癌
21
19
6
2
0
中分化腺癌
23
16
7
3
1
低分化腺癌
, 百拇医药
22
12
8
8
2
粘液腺癌
20
11
8
7
2
癌旁肠粘膜
86
36
, 百拇医药
9
12
1
肝转移灶
38
24
17
38
4
血淋巴细胞
86
75
6
43
, 百拇医药
3
2.2 Fas、FasL表达、突变与大肠癌肝转移的关系
大肠癌原发灶、肝转移灶、癌旁肠粘膜及血淋巴细胞中的Fas表达阳性率分别为67.4 %，63.2 %，41.9%，87.2%，其差别无显著性意义(χ2=2.51，P>0.05)。Fas突变率分别 为50. 0%，70.8%，25.0%，8.0%，其差别有显著性意义(χ2=56.32，P<0.01)。原 发灶和肝 转移灶中Fas突变率较高。在原发灶、肝转移灶、癌旁肠粘膜和血淋巴细胞中FasL表达阳性 率分别为25.6%，100%，14.0%，50.0%，其表达有显著性差别(χ2=62.59，P<0. 01)。肝转移灶中FasL表达比其它组织高，但不同组中FasL突变无显著性差别(χ2=3.46， P>0.05)。3 讨论
大肠癌根治性术后失败的主要原因是出现肝转移。来自结直肠的恶性肿瘤细胞经门静脉途径 到达肝脏后，必须逃逸免疫系统监视和杀伤并适应肝脏的微环境才能生长、增殖，发展成 为临床转移病灶。免疫细胞的Fas＼FasL系统在清除肿瘤细胞，实现免疫防御和免疫监视方 面发挥着重要作用。有些肿瘤细胞可表达Fas，而CTL细胞被抗原激活后可迅速高表达FasL。 这样，被激活的CTL便以FasL与肿瘤细胞的Fas结合，通过不依赖穿孔素的Fas＼FasL途径使 肿瘤细胞死亡，这是免疫系统实现免疫监视与防御的机制之一[2]。
, http://www.100md.com
本实验结果表明，大肠癌原发灶、癌旁粘膜和门静脉血淋巴细胞中Fas表达无显著差别，但 在癌原发灶中Fas突变率较高。我们所设计的引物经RT-PCR扩增后得到的产物包括了Fas部分 胞外区、跨膜区和部分胞浆内信号传递区的cDNA序列，这些区域的突变可影响Fas的功能， 使得免疫细胞所表达的FasL不能与之结合，从而使肿瘤细胞对Fas＼FasL系统诱导的凋亡产 生抗性。虽然在大肠癌原发灶中Fas的表达、突变与病理组织学类型无关，但FasL表达与原 发灶癌细胞的分化程度有关。我们还发现在肝转移组原发灶中FasL表达比无肝转移组高。而 机体免疫细胞，包括T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞等均可表达Fas。这样，免疫细胞非 但不能杀伤肿瘤细胞，FasL+肿瘤细胞与免疫细胞Fas受体结合后，通过Fas＼FasL系统反 而诱导免疫细胞如CTL细胞凋亡，使肿瘤细胞能够逃避免疫系统杀伤而发生转移。
在肝转移灶中，Fas表达检测结果也表明其突变率较高。而且在肝转移灶中全部有FasL表达 。说明肿瘤细胞中FasL表达与大肠癌肝转移有密切关系。FasL属TNF家族成员，主要在淋巴 组织 中表达，T细胞活化后FasL表达增加，FasL表达于被激活的CD8+ CTL细胞表面，籍FasL 与肿瘤细胞的Fas结合，对肿瘤细胞发挥不依赖穿孔素的杀伤作用。FasL胞外区与Fas+细 胞结合后，可诱导Fas+细胞凋亡，而对Fas-细胞无作用[3]。经门静脉系统 到达肝脏的大肠癌细胞，在出现Fas突变和FasL表达后，不但可逃避免疫细胞Fas＼FasL系统 的 杀伤，而且可通过Fas＼FasL系统诱导机体免疫细胞的凋亡，从而使癌细胞得以生长、增殖 ，发展成临床转移病灶。
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细胞凋亡机制在肿瘤细胞免疫逸逃逸中起着重要作用。有些肿瘤如肝癌、乳腺癌在逃逸免疫 监 视和杀伤时表现为Fas表达下调或缺失[4]。但在大肠癌肝转移时出现的是Fas突变 和FasL高表达。这些都表明Fas＼FasL系统是肿瘤细胞逃避免疫监视，抗拒细胞凋亡的重要 途径。Fas＼FasL系统所诱导的细胞凋亡机制在机体与肿瘤细胞对抗中具有重要的生物学意 义。一方面，机体利用细胞凋亡机制清除肿瘤细胞，实现机体的抗肿瘤作用；另一方面， 肿瘤细胞也可利用细胞凋亡机制清除衰老肿瘤细胞和正常免疫细胞，维持肿瘤细胞的生长、 增殖，并促进转移。因此，检测大肠癌原发灶和门静脉血淋巴细胞Fas＼FasL系统改变对临 床预 测肝转移有重要意义。调节肝转移癌细胞Fas表达、以转移癌细胞FasL为靶标，可作为防治 大肠癌肝转移的一条新途径。
参 考 文 献
1，李世拥，于 波，安 萍，等.胆汁中的突变基因与大肠癌肝转移关系的研究.中 华外科杂志，1999；37：106～107
, 百拇医药
2，Lee RK,Spielman J,Zhao DY,et al.Perforin,Fas ligand,and tumor necrosis factor are the major cytoxic molecules used by lyphokine-activated killer cells .J Immunol,1996;157:1919～1925
3，Walker PR,Dietrich PY.Role of Fas ligand (CD95L) in immune escape:the tumor cell striks bak.J Immunol,1997;158:4521～4524
4，Keane MM,Ettenberg SA,Lowry GA,et al.Fas expression and function in no rmal and malignant breast cell lines.Cancer Res,1996;56:4791～4798, 百拇医药