人骨膜源性成骨细胞的体外培养
作者：王福生 王立德 张羽飞 祝恩豹
单位：王福生 王立德 张羽飞(大连医科大学附属第一医院116011)；祝恩豹(瓦房店市中医院骨科116033)
关键词：人骨膜源性成骨细胞；细胞培养；碱性磷酸酶(ALP)；骨钙；素(BGP)
中国现代医学杂志000702
目的：探索成骨细胞的体外培养方法，建立人骨膜源性成骨细胞体外实 验模型。方法：以人髂骨骨膜为材料，通过植块培养法进行细胞培养，通过形态学观察；细 胞的碱性磷酸酶(ALP)染色；培养液中骨钙素(BGP)的放免分析等进行细胞学鉴定。结果：成 骨细胞为成纤维细胞型，贴壁生长，形态多样化，HE染色细胞轮廓清晰，核内可见2-3个核 仁 ；细胞的ALP染色为阳性；培养液中可检测出较高浓度的BGP。结论：可以利用人骨膜为材料 进行成骨细胞的体外培养，本培养方法，简便易行，可靠。
, 百拇医药
分类号 R68
THE CULTURE OF PERIOSTEAL-DERIVED OSTEOBLAST (POB) IN VITRO
Wang Fusheng, Wang Lide, Gu Ling
(First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116011)
Song Shuyun, Hong Xin
(Basic Medical College of Dalian Medical University, Dalian 116027)
Li Shufeng
, 百拇医药
(Traditional Chinese Medicine Hospital of Liaoyang Country Town, Liaoyang 111200)
[Abstract] Objective: To explore the culture of periosteal- derived osteoblast (P OB) in vitro to establish an experimental model for the study of human bone meta bolism, growth control and environmental effects. Methods: Human osteoblasts wer e obtained by explanting the iliac periostenum culture in DMEM media. The cytomo rphological observation, the cytochemical staining of AKP and the detection of B GP (Bone Gla Protein or osteocalcin) in supernate were carried out to identify t he osteoblast. Results: The results of the cell culture in vitro and the cytolog ic identification show: (1) The periosteal-derived osteoblast (POB), a fibroblas t typed cell which grows by adhering to the culture flask, is spindle-shaped wit h 2-3 nucleoli in an oval nucleus. It has a few particulate matters in its trans parent cytoplasm; (2) The positive rate of osteoblast stained by AKP is over 80% . (3) The higher concentration of BGP can be detected in its supernate, while th ere is little BGP in DMEM medium without osteoblast culture. Conclusions : Human osteoblast can simply reliably be isolated and culture from periostenum in vitro .
, http://www.100md.com
Key words: Human Periosteal-derived Osteoblast; Cell culture; Alkaline P hosphatase (AKP); Bone Gla Protein or Osteocalcin (BGP)
本文以人髂骨骨膜为材料，通过 植块培养，成功地获得骨膜源性成骨细胞，以期对骨细胞生理代谢、骨细胞坏死等病理机制 的研究及治疗药物的筛选提供一种新的研究手段。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
胰蛋白酶(Promega公司)、胶原酶(Sigma公司，IV)、DMEM培养液(Gibco公司)、骨钙素(BGP) 放免试剂合(北京原子能研究所。)
1.2 骨膜源性成骨细胞的体外培养[1]
, 百拇医药
1.2.1 取材 实验材料取自先天髋脱位患者(男4例，女6例，年龄6～8岁) 经血、尿分析无代谢性骨病，手术中取其髂骨骨膜约2cm×2cm×2cm大小，置入装备DMEM培 养液的无菌瓶内，4℃保存备用。
1.2.2 原代细胞培养 骨膜的处理：从培养液中取出骨膜，用Hank's液冲 洗后，修整剔除骨膜外组织，100u/ml青链霉素冲洗，以眼科剪将其剪成1mm×1mm×1mm大小 碎块，0.25%胰酶消化30min(37℃水溶)、0.1%胶原酶消化2h，离心，清洗3遍，去除酶成份 。翻转干涸法培养细胞：将骨膜块置入培养瓶中，用弯头细管把细胞摆在瓶底，小块间相距 约0.5cm，每25ml培养瓶中约摆布25～30块，做翻转培养2h后加入DMEM培养液，使之淹没骨 膜块，置37℃，95%空气，5%CO2条件下继续培养，每3d全量更换培养液1次。
1.2.3 细胞的传代培养及骨膜再培养 当原代细胞融合成单层以后，取出 骨膜，然后以0.02%EDTA消化瓶中细胞8～10min后，弃消化液、培养液冲洗后，加培养液吹 打使细胞脱落，计数，以2×104个/cm2密度接种于新的培养瓶中进行传代培养，另 将消化前取下的骨膜块，重新按上述翻转干涸法进行再培养。
, 百拇医药
1.3 细胞的生物学鉴定
1.3.1 形态学观察 用倒置显微镜逐日观察活细胞的生长情况及形态特征 。并使细胞生长在载玻片上，采用HE染色，观察细胞的一般形态。
1.3.2 成骨细胞碱性磷酸酶(Alkaline phospharase,Alpase AKP)的细胞化 学染色，先使细胞生长在盖玻片上，采用改良Gomori钙钴法[2]测定细胞内AKP活 性。阳性细胞计数方法，每代细胞随机数片2张，每张片随机计数500个细胞[2]， 测出AKP阳性细胞百分比。
1.3.3 骨钙素的放射免疫学分析 选择生长活跃的第三代成 骨细胞，用0.25%胰酶消化10min，制成107个细胞/L的细胞悬液，按1ml/孔的密度接种于 24孔培养板。培养24h后，更换无血清的DMEM培养液，继续培养3d后取上清液，为A组；另取 无细胞培养的DMEM培养液为B组作空白对照，进行放射免疫测定。BGP放射免疫分析按试剂盒 说明操作(北京中国原子能研究所提供)，测量结果以
±s表示，统计学(SPS软 件，t检验)进行处理。
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 用骨膜分离培养的成骨细胞形态特点
骨膜块培养5～7d即有新生细胞长出，为成纤维细胞型，贴壁生长，初时细胞形态多样化， 但多为梭形，带有粗大突起，有些则为三角形、多角形，数日后变为长梭形、条索状，融合 成片，分界较为模糊。细胞经传代后，形态与原代细胞无明显差异。HE染色显色细胞轮廓清 晰，核内可见2～3核仁(见图1)。
图1 用骨膜分离培养的成骨细胞 形态特点
2.2 成骨细胞碱性磷酸酶的细胞化学染色
经AKP孵育液孵育及中性红复染后，多数细胞的胞质中可见棕褐色的细小颗粒，此为AKP阳性 细胞，阴性细胞则胞质均匀一致，未见棕褐色颗粒物质。第三、五代细胞的AKP染色，其阳 性率均在80%以上(见图2)。
, 百拇医药
图2 成骨细胞碱性磷酸酶的细胞 化学染色
2.3 骨钙素的放免测定结果
A组(实验组)：BGP浓度为(17.9±11.12)ng/ml，培养72h后上清液中可检出较高浓度的BGP。 B组(空白对照组)：未检出BGP(P<0.01)。
3 讨论
3.1 骨膜源性成骨细胞的体外培养
骨外膜分为内外二层，外层较厚，由致密结缔组织构成，细胞较少；内层疏松，含有较多的 骨原细胞和 成骨细胞为生发层。通过骨膜植块培养获得的细胞有成骨细胞，原血细胞和血管内皮细胞。 因为原血细胞和血管内皮细胞在没有生长因子的条件下不可能长期培养，所以通过长期培养 分离出成骨细胞[3]。成骨细胞培养按起源不同主要可分为骨内成骨细胞培养法和 骨膜内成骨细胞培养法，通过本文研究认为骨膜植块翻转培养法与碎骨片植块法相比，骨膜 取材和准备更简便，材料本身含有的成骨细胞更丰富，不仅是培养人成骨细胞的一个较好方 法，而且可以活体取材，自体植入(不必考虑免疫排斥问题)，便于临床应用。
, 百拇医药
3.2 细胞的生物学行为(细胞学鉴定)
本研究培养的细胞呈贴壁型生长，形态均匀一致，均为梭形或多角形，胞质透明颗粒少，单 个核，核仁2～3个，具有多数学者报道的成骨细胞的形态特征[4，5]。此外，还 具有较强的AKP(碱性磷酸酶)活性，且随传代次数的增加，AKP染色阳性细胞率无明显减少， 均在80%以上，这与Marrie[4]及Bettina等[5]报道的成骨细胞AKP阳性 率相当，碱性磷酸酶是成骨细胞的标记酶，可能参与骨基质成熟钙化过程的调节，促进Ca 2+在基质中的沉积，因此认为AKP染色强阳性是成骨细胞的重要特征之一。
骨钙素(Osteocalcin)又称r-羧基谷氨酸蛋白(Bone Gla Protein,BGP)对其确切功能尚不了 解，目前认为，其生理功能是保持骨的正常矿化，抑制由于异常的羟磷灰石结晶沉积所致的 发生软化骨矿化加速的作用，促进骨基质成熟[6，7]。骨钙素和AKP一样， 可以作为成骨细胞活性的标记物，亦为成骨细胞的重要特征之一[8]，本实验在 细胞培养72h后，上清液中测出较高的BGP，而无细胞的对照培养液中未检测出BGP。
, http://www.100md.com
本实验用骨膜分离培养出的细胞除具有典型的成骨细胞形态特征外，还具有较高的AKP活性 及BGP特性，因此符合了成骨细胞生物学行为。为成骨细胞病理、生理研究提供了较好的体 外实验模型。
参 考 文 献
1，鄂 征.基本培养操作技术.见：鄂征主编.组织培养和分子细胞学技术.第2版. 北京：北京出版社，1995：79～111
2，杨景山.医学细胞化学细胞生物技术.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合 出版社，1940：42
3，Marie PJ,Lomri A,Sabagh A,et al.Culture and behavior of asteoblastic c ells isolated from normal trabecular bone surface.In Vitro Cellular & Developmen tal Biology,1989;25:373
, http://www.100md.com
4，Marie PJ,Adberrahimomri.Aymansabbagin Culture and behavior of osteobla tic cells normal trabecular bone suface.In Vitro,1989
5，Bettina Auf'mkolk,Hauschka PV.Schwar Characterization of human bone ce lls in culture. Tissue Int,1985;37:228
6，Lian JB,Gundberg CM,Osfecoalci,Biochemical censiderations and clinica l applieations.lin Orthop Rel Res,1987;226:267
7，李青南，梁念慈，薛 延.影响骨形成和骨吸收的有关因子.见：刘忠厚主编. 骨质疏松学.北京：科学出版社，1998：121～122
8，马述壮，王石麟.骨骼系统的结构与形态.见刘忠厚主编：骨质疏松学.北京：科 学出版社，1998：121～123
(2000-01-20收稿), http://www.100md.com
单位：王福生 王立德 张羽飞(大连医科大学附属第一医院116011)；祝恩豹(瓦房店市中医院骨科116033)
关键词：人骨膜源性成骨细胞；细胞培养；碱性磷酸酶(ALP)；骨钙；素(BGP)
中国现代医学杂志000702
目的：探索成骨细胞的体外培养方法，建立人骨膜源性成骨细胞体外实 验模型。方法：以人髂骨骨膜为材料，通过植块培养法进行细胞培养，通过形态学观察；细 胞的碱性磷酸酶(ALP)染色；培养液中骨钙素(BGP)的放免分析等进行细胞学鉴定。结果：成 骨细胞为成纤维细胞型，贴壁生长，形态多样化，HE染色细胞轮廓清晰，核内可见2-3个核 仁 ；细胞的ALP染色为阳性；培养液中可检测出较高浓度的BGP。结论：可以利用人骨膜为材料 进行成骨细胞的体外培养，本培养方法，简便易行，可靠。
, 百拇医药
分类号 R68
THE CULTURE OF PERIOSTEAL-DERIVED OSTEOBLAST (POB) IN VITRO
Wang Fusheng, Wang Lide, Gu Ling
(First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116011)
Song Shuyun, Hong Xin
(Basic Medical College of Dalian Medical University, Dalian 116027)
Li Shufeng
, 百拇医药
(Traditional Chinese Medicine Hospital of Liaoyang Country Town, Liaoyang 111200)
[Abstract] Objective: To explore the culture of periosteal- derived osteoblast (P OB) in vitro to establish an experimental model for the study of human bone meta bolism, growth control and environmental effects. Methods: Human osteoblasts wer e obtained by explanting the iliac periostenum culture in DMEM media. The cytomo rphological observation, the cytochemical staining of AKP and the detection of B GP (Bone Gla Protein or osteocalcin) in supernate were carried out to identify t he osteoblast. Results: The results of the cell culture in vitro and the cytolog ic identification show: (1) The periosteal-derived osteoblast (POB), a fibroblas t typed cell which grows by adhering to the culture flask, is spindle-shaped wit h 2-3 nucleoli in an oval nucleus. It has a few particulate matters in its trans parent cytoplasm; (2) The positive rate of osteoblast stained by AKP is over 80% . (3) The higher concentration of BGP can be detected in its supernate, while th ere is little BGP in DMEM medium without osteoblast culture. Conclusions : Human osteoblast can simply reliably be isolated and culture from periostenum in vitro .
, http://www.100md.com
Key words: Human Periosteal-derived Osteoblast; Cell culture; Alkaline P hosphatase (AKP); Bone Gla Protein or Osteocalcin (BGP)
本文以人髂骨骨膜为材料，通过 植块培养，成功地获得骨膜源性成骨细胞，以期对骨细胞生理代谢、骨细胞坏死等病理机制 的研究及治疗药物的筛选提供一种新的研究手段。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
胰蛋白酶(Promega公司)、胶原酶(Sigma公司，IV)、DMEM培养液(Gibco公司)、骨钙素(BGP) 放免试剂合(北京原子能研究所。)
1.2 骨膜源性成骨细胞的体外培养[1]
, 百拇医药
1.2.1 取材 实验材料取自先天髋脱位患者(男4例，女6例，年龄6～8岁) 经血、尿分析无代谢性骨病，手术中取其髂骨骨膜约2cm×2cm×2cm大小，置入装备DMEM培 养液的无菌瓶内，4℃保存备用。
1.2.2 原代细胞培养 骨膜的处理：从培养液中取出骨膜，用Hank's液冲 洗后，修整剔除骨膜外组织，100u/ml青链霉素冲洗，以眼科剪将其剪成1mm×1mm×1mm大小 碎块，0.25%胰酶消化30min(37℃水溶)、0.1%胶原酶消化2h，离心，清洗3遍，去除酶成份 。翻转干涸法培养细胞：将骨膜块置入培养瓶中，用弯头细管把细胞摆在瓶底，小块间相距 约0.5cm，每25ml培养瓶中约摆布25～30块，做翻转培养2h后加入DMEM培养液，使之淹没骨 膜块，置37℃，95%空气，5%CO2条件下继续培养，每3d全量更换培养液1次。
1.2.3 细胞的传代培养及骨膜再培养 当原代细胞融合成单层以后，取出 骨膜，然后以0.02%EDTA消化瓶中细胞8～10min后，弃消化液、培养液冲洗后，加培养液吹 打使细胞脱落，计数，以2×104个/cm2密度接种于新的培养瓶中进行传代培养，另 将消化前取下的骨膜块，重新按上述翻转干涸法进行再培养。
, 百拇医药
1.3 细胞的生物学鉴定
1.3.1 形态学观察 用倒置显微镜逐日观察活细胞的生长情况及形态特征 。并使细胞生长在载玻片上，采用HE染色，观察细胞的一般形态。
1.3.2 成骨细胞碱性磷酸酶(Alkaline phospharase,Alpase AKP)的细胞化 学染色，先使细胞生长在盖玻片上，采用改良Gomori钙钴法[2]测定细胞内AKP活 性。阳性细胞计数方法，每代细胞随机数片2张，每张片随机计数500个细胞[2]， 测出AKP阳性细胞百分比。
1.3.3 骨钙素的放射免疫学分析 选择生长活跃的第三代成 骨细胞，用0.25%胰酶消化10min，制成107个细胞/L的细胞悬液，按1ml/孔的密度接种于 24孔培养板。培养24h后，更换无血清的DMEM培养液，继续培养3d后取上清液，为A组；另取 无细胞培养的DMEM培养液为B组作空白对照，进行放射免疫测定。BGP放射免疫分析按试剂盒 说明操作(北京中国原子能研究所提供)，测量结果以
±s表示，统计学(SPS软 件，t检验)进行处理。, http://www.100md.com
2 结果
2.1 用骨膜分离培养的成骨细胞形态特点
骨膜块培养5～7d即有新生细胞长出，为成纤维细胞型，贴壁生长，初时细胞形态多样化， 但多为梭形，带有粗大突起，有些则为三角形、多角形，数日后变为长梭形、条索状，融合 成片，分界较为模糊。细胞经传代后，形态与原代细胞无明显差异。HE染色显色细胞轮廓清 晰，核内可见2～3核仁(见图1)。
图1 用骨膜分离培养的成骨细胞 形态特点
2.2 成骨细胞碱性磷酸酶的细胞化学染色
经AKP孵育液孵育及中性红复染后，多数细胞的胞质中可见棕褐色的细小颗粒，此为AKP阳性 细胞，阴性细胞则胞质均匀一致，未见棕褐色颗粒物质。第三、五代细胞的AKP染色，其阳 性率均在80%以上(见图2)。
, 百拇医药
图2 成骨细胞碱性磷酸酶的细胞 化学染色
2.3 骨钙素的放免测定结果
A组(实验组)：BGP浓度为(17.9±11.12)ng/ml，培养72h后上清液中可检出较高浓度的BGP。 B组(空白对照组)：未检出BGP(P<0.01)。
3 讨论
3.1 骨膜源性成骨细胞的体外培养
骨外膜分为内外二层，外层较厚，由致密结缔组织构成，细胞较少；内层疏松，含有较多的 骨原细胞和 成骨细胞为生发层。通过骨膜植块培养获得的细胞有成骨细胞，原血细胞和血管内皮细胞。 因为原血细胞和血管内皮细胞在没有生长因子的条件下不可能长期培养，所以通过长期培养 分离出成骨细胞[3]。成骨细胞培养按起源不同主要可分为骨内成骨细胞培养法和 骨膜内成骨细胞培养法，通过本文研究认为骨膜植块翻转培养法与碎骨片植块法相比，骨膜 取材和准备更简便，材料本身含有的成骨细胞更丰富，不仅是培养人成骨细胞的一个较好方 法，而且可以活体取材，自体植入(不必考虑免疫排斥问题)，便于临床应用。
, 百拇医药
3.2 细胞的生物学行为(细胞学鉴定)
本研究培养的细胞呈贴壁型生长，形态均匀一致，均为梭形或多角形，胞质透明颗粒少，单 个核，核仁2～3个，具有多数学者报道的成骨细胞的形态特征[4，5]。此外，还 具有较强的AKP(碱性磷酸酶)活性，且随传代次数的增加，AKP染色阳性细胞率无明显减少， 均在80%以上，这与Marrie[4]及Bettina等[5]报道的成骨细胞AKP阳性 率相当，碱性磷酸酶是成骨细胞的标记酶，可能参与骨基质成熟钙化过程的调节，促进Ca 2+在基质中的沉积，因此认为AKP染色强阳性是成骨细胞的重要特征之一。
骨钙素(Osteocalcin)又称r-羧基谷氨酸蛋白(Bone Gla Protein,BGP)对其确切功能尚不了 解，目前认为，其生理功能是保持骨的正常矿化，抑制由于异常的羟磷灰石结晶沉积所致的 发生软化骨矿化加速的作用，促进骨基质成熟[6，7]。骨钙素和AKP一样， 可以作为成骨细胞活性的标记物，亦为成骨细胞的重要特征之一[8]，本实验在 细胞培养72h后，上清液中测出较高的BGP，而无细胞的对照培养液中未检测出BGP。
, http://www.100md.com
本实验用骨膜分离培养出的细胞除具有典型的成骨细胞形态特征外，还具有较高的AKP活性 及BGP特性，因此符合了成骨细胞生物学行为。为成骨细胞病理、生理研究提供了较好的体 外实验模型。
参 考 文 献
1，鄂 征.基本培养操作技术.见：鄂征主编.组织培养和分子细胞学技术.第2版. 北京：北京出版社，1995：79～111
2，杨景山.医学细胞化学细胞生物技术.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合 出版社，1940：42
3，Marie PJ,Lomri A,Sabagh A,et al.Culture and behavior of asteoblastic c ells isolated from normal trabecular bone surface.In Vitro Cellular & Developmen tal Biology,1989;25:373
, http://www.100md.com
4，Marie PJ,Adberrahimomri.Aymansabbagin Culture and behavior of osteobla tic cells normal trabecular bone suface.In Vitro,1989
5，Bettina Auf'mkolk,Hauschka PV.Schwar Characterization of human bone ce lls in culture. Tissue Int,1985;37:228
6，Lian JB,Gundberg CM,Osfecoalci,Biochemical censiderations and clinica l applieations.lin Orthop Rel Res,1987;226:267
7，李青南，梁念慈，薛 延.影响骨形成和骨吸收的有关因子.见：刘忠厚主编. 骨质疏松学.北京：科学出版社，1998：121～122
8，马述壮，王石麟.骨骼系统的结构与形态.见刘忠厚主编：骨质疏松学.北京：科 学出版社，1998：121～123
(2000-01-20收稿), http://www.100md.com