过表达葡萄糖调节蛋白75的细胞对能量代谢应激的抵抗性
作者：郑东航 左伋 杨增杰 夏蓓莉 张克雄
单位：200032 上海医科大学遗传医学中心
关键词：
中华医学杂志000722 葡萄糖调节蛋白75(glucose-regulated proteins 75，grp75)是一类线粒体热休克蛋白(mthsp)[1]。生理情况下，grp75在细胞中有构成性表达；当细胞中葡萄糖水平下降时，该基因表达增高。因此grp75上调表达可被看作是细胞对能量代谢应激的某种应答。为研究grp75的功能，本室曾构建grp75的真核表达载体用以转染中国仓鼠肺(CHL)细胞，获得了过表达grp75的细胞克隆。在此基础上，作者拟研究过表达grp75的细胞对缺糖损伤的抵抗性，以证明grp75对处于能量代谢性应激下的细胞是否具有保护作用。
一、材料和方法
, 百拇医药
1.细胞：以过表达grp75的CHL细胞作为实验组，构成性表达grp75的CHL细胞作为对照组。
2.无糖培养： 无糖培养基购自Gibco公司，按其说明书配制，抽滤除菌。2组细胞均以无糖培养基换液，置于37℃，体积分数0.05 CO2条件下培养一定时间，进行以下测定。
3.细胞活率测定：在无糖培养5 h、10 h、20 h后，分别收集实验组和对照组细胞，台盼蓝染色计数，计算细胞活率。细胞活率=活细胞数÷细胞总数×100%。
4.乳酸脱氢酶(LDH)释放百分比： LDH检测试剂购自美国Sigma公司，依说明书进行检测操作和计算酶活力。在无糖培养4 h、7 h、10 h、15 h、20 h后，对实验组和对照组的每瓶细胞，分别收集其培养液并定容，测定其LDH总活力(代表因细胞膜通透性增高而释放的LDH的量)；以0.1% triton X-100裂解细胞，离心，收集上清液并定容，测定其LDH总活力(代表存留于细胞内的LDH的量)。LDH释放百分比=培养液LDH总活力÷(培养液LDH总活力+细胞内LDH总活力)×100%。
, 百拇医药
5.亚二倍体细胞比率： 分别收集经无糖培养5 h、10 h、20 h的实验组和对照组细胞，PI(碘化丙啶)染色，流式细胞仪检测细胞DNA含量。在DNA直方图上得到亚二倍体细胞百分比。
二、结果
1.细胞活率比较 2组细胞活率比较见表1。
表1 2组细胞活率比较 组别
无糖培养时间
5 h
10 h
20 h
实验组
608/635(95.75)
, 百拇医药
701/768(91.28)
229/431(53.13)
对照组
638/673(94.80)
578/786(73.54)
214/447(47.87)
u值
0.807 8
9.160 8*
1.565 5
注：*实验组细胞活率高于对照组细胞，P<0.05，括号内为百分比
, 百拇医药
2.LDH释放百分比比较：取各处理组LDH释放百分比的中位数绘成LDH释放百分比-无糖培养时间(图1)。
3.亚二倍体细胞比率：两组细胞(按培养时间、细胞数量配对)亚二倍体细胞百分比测定结果见表2。数据表明grp75可在一定程度上减轻缺糖所致DNA损伤。
三、讨论
实验组和对照组细胞经无糖培养4 h或5 h，它们的活率，亚二倍体细胞率，LDH释放百分比无明显差别，反映了一般细胞对早期缺糖具有一定的耐受力；随着无糖培养时间的延长，过表达grp75的细胞表现出强于对照组细胞的抗损伤能力，证明了grp75在对抗缺糖损伤中的保护作用；无糖培养至20 h，过表达grp75的细胞的受到损伤程度与对照组细胞相当。这提示grp75的保护作用具有一定极限，grp75能够减轻缺糖应激带来的一些损伤，但对缺糖损伤的原发因素—能量底物匮乏无能为力，而且grp75发挥保护作用可能也需要ATP供能，不断加重的缺糖损伤最终将超出grp75的对抗能力。本研究证明，grp75可在一定程度上减轻细胞所受的缺糖损伤，因此神经细胞在缺血时上调表达grp75应是对能量底物匮乏的一种保护性应答。
, 百拇医药
图1 LDH释放百分比-无糖培养时间曲线
表2 两组细胞亚二倍体细胞百分比比较(%) 组别
配对序号
T
1
2
3
4
5
6
5 h
实验组
6.75
, 百拇医药
10.44
0.58
0.25
1.12
0.34
9
对照组
49.21
0.28
1.19
0.13
1.41
0.02
, 百拇医药
10 h
实验组
24.71
1.89
1.19
15.83
15.37
20.43
3*
对照组
27.12
32.01
3.20
, 百拇医药
21.28
18.75
21.07
20 h
实验组
13.88
14.01
34.93
8.23
43.58
92.17
3
对照组
, http://www.100md.com
15.77
68.69
83.34
13.89
63.65
81.79
*注：实验组亚二倍体细胞比率低于对照组，P<0.05
grp75保护细胞功能的机制尚待探讨。对mthsp家族成员的研究表明，线粒体热休克蛋白在线粒体中行使伴侣蛋白的职能：协助胞浆中合成的线粒体蛋白肽链转运入线粒体[2-4]帮助肽链在线粒体中正确折叠和装配[2，4]，介导异常蛋白质的降解。grp75作为mthsp家族一员可能正是发挥上述某项作用而改善线粒体功能，从而增强细胞对能量代谢应激的抵抗能力。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670239)；美国中华医学基金资助项目(96-635)
参考文献
1，Massa SM，Zuo J, Longo FR, et al. Cloning of rat grp75, an hsp70 family member, and its expression in normal and ischemic brain. J Neurosci Res, 1995, 40: 807-819.
2，Kang P, Ostermann J. Requirement for hsp70 in the mitochondrial matrix for translocation and folding of precursor proteins. Nature, 1990, 348: 137-143.
3，Horst M, Azem A. What is the driving force for protein import into mitochondria? Biochim Biophs Acta, 1997, 1318: 71-78.
4，Ryan M T, Naylor D J. The role of molecular chaperons in mitochondrial protein import and folding. Int Rev Cytol., 1997, 174: 127-193.
收稿日期：1999-07-22, 百拇医药
单位：200032 上海医科大学遗传医学中心
关键词：
中华医学杂志000722 葡萄糖调节蛋白75(glucose-regulated proteins 75，grp75)是一类线粒体热休克蛋白(mthsp)[1]。生理情况下，grp75在细胞中有构成性表达；当细胞中葡萄糖水平下降时，该基因表达增高。因此grp75上调表达可被看作是细胞对能量代谢应激的某种应答。为研究grp75的功能，本室曾构建grp75的真核表达载体用以转染中国仓鼠肺(CHL)细胞，获得了过表达grp75的细胞克隆。在此基础上，作者拟研究过表达grp75的细胞对缺糖损伤的抵抗性，以证明grp75对处于能量代谢性应激下的细胞是否具有保护作用。
一、材料和方法
, 百拇医药
1.细胞：以过表达grp75的CHL细胞作为实验组，构成性表达grp75的CHL细胞作为对照组。
2.无糖培养： 无糖培养基购自Gibco公司，按其说明书配制，抽滤除菌。2组细胞均以无糖培养基换液，置于37℃，体积分数0.05 CO2条件下培养一定时间，进行以下测定。
3.细胞活率测定：在无糖培养5 h、10 h、20 h后，分别收集实验组和对照组细胞，台盼蓝染色计数，计算细胞活率。细胞活率=活细胞数÷细胞总数×100%。
4.乳酸脱氢酶(LDH)释放百分比： LDH检测试剂购自美国Sigma公司，依说明书进行检测操作和计算酶活力。在无糖培养4 h、7 h、10 h、15 h、20 h后，对实验组和对照组的每瓶细胞，分别收集其培养液并定容，测定其LDH总活力(代表因细胞膜通透性增高而释放的LDH的量)；以0.1% triton X-100裂解细胞，离心，收集上清液并定容，测定其LDH总活力(代表存留于细胞内的LDH的量)。LDH释放百分比=培养液LDH总活力÷(培养液LDH总活力+细胞内LDH总活力)×100%。
, 百拇医药
5.亚二倍体细胞比率： 分别收集经无糖培养5 h、10 h、20 h的实验组和对照组细胞，PI(碘化丙啶)染色，流式细胞仪检测细胞DNA含量。在DNA直方图上得到亚二倍体细胞百分比。
二、结果
1.细胞活率比较 2组细胞活率比较见表1。
表1 2组细胞活率比较 组别
无糖培养时间
5 h
10 h
20 h
实验组
608/635(95.75)
, 百拇医药
701/768(91.28)
229/431(53.13)
对照组
638/673(94.80)
578/786(73.54)
214/447(47.87)
u值
0.807 8
9.160 8*
1.565 5
注：*实验组细胞活率高于对照组细胞，P<0.05，括号内为百分比
, 百拇医药
2.LDH释放百分比比较：取各处理组LDH释放百分比的中位数绘成LDH释放百分比-无糖培养时间(图1)。
3.亚二倍体细胞比率：两组细胞(按培养时间、细胞数量配对)亚二倍体细胞百分比测定结果见表2。数据表明grp75可在一定程度上减轻缺糖所致DNA损伤。
三、讨论
实验组和对照组细胞经无糖培养4 h或5 h，它们的活率，亚二倍体细胞率，LDH释放百分比无明显差别，反映了一般细胞对早期缺糖具有一定的耐受力；随着无糖培养时间的延长，过表达grp75的细胞表现出强于对照组细胞的抗损伤能力，证明了grp75在对抗缺糖损伤中的保护作用；无糖培养至20 h，过表达grp75的细胞的受到损伤程度与对照组细胞相当。这提示grp75的保护作用具有一定极限，grp75能够减轻缺糖应激带来的一些损伤，但对缺糖损伤的原发因素—能量底物匮乏无能为力，而且grp75发挥保护作用可能也需要ATP供能，不断加重的缺糖损伤最终将超出grp75的对抗能力。本研究证明，grp75可在一定程度上减轻细胞所受的缺糖损伤，因此神经细胞在缺血时上调表达grp75应是对能量底物匮乏的一种保护性应答。
, 百拇医药
图1 LDH释放百分比-无糖培养时间曲线
表2 两组细胞亚二倍体细胞百分比比较(%) 组别
配对序号
T
1
2
3
4
5
6
5 h
实验组
6.75
, 百拇医药
10.44
0.58
0.25
1.12
0.34
9
对照组
49.21
0.28
1.19
0.13
1.41
0.02
, 百拇医药
10 h
实验组
24.71
1.89
1.19
15.83
15.37
20.43
3*
对照组
27.12
32.01
3.20
, 百拇医药
21.28
18.75
21.07
20 h
实验组
13.88
14.01
34.93
8.23
43.58
92.17
3
对照组
, http://www.100md.com
15.77
68.69
83.34
13.89
63.65
81.79
*注：实验组亚二倍体细胞比率低于对照组，P<0.05
grp75保护细胞功能的机制尚待探讨。对mthsp家族成员的研究表明，线粒体热休克蛋白在线粒体中行使伴侣蛋白的职能：协助胞浆中合成的线粒体蛋白肽链转运入线粒体[2-4]帮助肽链在线粒体中正确折叠和装配[2，4]，介导异常蛋白质的降解。grp75作为mthsp家族一员可能正是发挥上述某项作用而改善线粒体功能，从而增强细胞对能量代谢应激的抵抗能力。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670239)；美国中华医学基金资助项目(96-635)
参考文献
1，Massa SM，Zuo J, Longo FR, et al. Cloning of rat grp75, an hsp70 family member, and its expression in normal and ischemic brain. J Neurosci Res, 1995, 40: 807-819.
2，Kang P, Ostermann J. Requirement for hsp70 in the mitochondrial matrix for translocation and folding of precursor proteins. Nature, 1990, 348: 137-143.
3，Horst M, Azem A. What is the driving force for protein import into mitochondria? Biochim Biophs Acta, 1997, 1318: 71-78.
4，Ryan M T, Naylor D J. The role of molecular chaperons in mitochondrial protein import and folding. Int Rev Cytol., 1997, 174: 127-193.
收稿日期：1999-07-22, 百拇医药