离子通道在卵母细胞中的表达及电生理实验方法
蒋学俊 李晓艳 Randall L Rasmusson
关键词：离子通道 卵母细胞 表达 电生理 编者按：将分子生物学技术和电生理技术结合起来研究离子通道的方法一直是大家普遍看好的发展方向，在国内至今尚未能系统地开展研究。为促进这一技术在国内的推广、应用，我们将分期(2000年4期)系统介绍相关技术的实验方法，内容包括卵母细胞分离培养技术、mRNA微注射技术、双微电极电压钳制技术、cut-open实验技术、macro-patch及giant-patch实验技术、DNA提取纯化技术、RNA转录技术和定点突变技术。内容注重实用性，目标是使有意从事有关课题的读者阅读有关文章后能开展实验研究。
结合分子生物学技术，从基因的角度研究离子通道的实验方法，在国外已被普遍采用，并且被广泛应用于心血管学、药理学及神经生物学等领域，使通道的研究深入到了基因水平。本文从分子生物学到通道电流的记录系统地介绍该项研究所采用的基本技术方法，希望能对大家有所帮助。
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Ⅰ 卵母细胞的分离和培养
1 非洲蟾蜍的喂养
饲料：非洲蟾蜍本产于南美，学名为Xenopus laevis(简称青蛙)，主要分为野生及人工繁殖两种，均可用于实验。一般来说，野生青蛙个体较大，极少患病，但不食用人工合成的饲料，须用切碎的动物内脏(如牛肝)或动物内脏及鱼类混合制成的特殊饲料喂养。人工繁殖的青蛙则个体小，可用人工合成饲料喂养。中国科学院发育所有售。
环境：青蛙可耐受的温度范围很宽，但建议将环境温度保持在20℃～23℃为佳，同时采用人工照明的方法使青蛙每天各有12 h处于“白天”及“黑夜”，目的在于尽可能减少季节对卵母细胞的影响。一般而言，夏季卵母细胞的质量相对较差。因此，保持稳定的外环境有利于实验室正常地开展研究工作，此对于野生型青蛙尤为重要。
喂养方法：青蛙喜静水，应喂养于下部涂黑的水箱中，水深10～13 cm，每只青蛙大致需液体2～3升，1～2天换水1次。每周仅需喂食2～3次，每次每只青蛙约需饲料5～10 g，喂食4～6 h后换水。每周清洁水箱2～3次。饲养青蛙的常用溶液配方为：溶液A，87.5% NaCl及1.75% CaCl2；溶液B，0.25% NaHCO3；将溶液A和溶液B各20 ml加入到5L的蒸馏水中，即可使用。
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常见疾病：最常见的疾病为红腿病(red leg)，系由水中的气单胞菌属菌、假单胞菌属菌、变形杆菌等引起的败血症。首先在青蛙的后肢及腹部出现点状皮下出血，表现为局部的“红”、“肿”，肢体溃烂，常可致命。在液体中加入青、链霉素500 mg/ml，治疗数日可能有帮助。
2 卵母细胞的分离
手术：常用麻醉药为tricaine，有效浓度为0.15%～0.35%，过高浓度会损伤青蛙。将青蛙置入麻醉液中，约15 min后取出，腹部向上平放，若青蛙不能翻身，即可进行手术。低温状态下麻醉效果更好。tricaine可保存于4℃环境，反复使用。最后一次手术时可过量麻醉青蛙，术后直接放入冰箱中处死。
麻醉完全后，将青蛙背部向下平放，于下腹部正中偏外0.5 cm左右纵向切开一长约1 cm的切口，切开筋膜即可见卵母细胞。青蛙皮肤较厚且硬，表面滑腻，可先用针头穿刺皮肤，以方便手术。取出足量的卵母细胞组织，置入溶液OR2中(参见附录)，以5-0丝线缝合皮肤。术后青蛙尚未完全恢复，须在空气中呼吸，将其放入小盆中，水面不要淹没其头部。约1小时后，待青蛙完全清醒再放回原处。
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青蛙对抗生素极为敏感，其皮肤表面可分泌一种名为爪蟾抗菌肽(magainin)的肽类物质，具有很强的抗菌作用，因此，术后一般不需使用抗生素。卵母细胞可分多次取出，依每次所需的数量而定。但多次手术后卵母细胞的质量会有所下降。为便于跟踪青蛙，可用不同方法进行标记。如在清醒前用4N HCl在其背部写上号码，1～2 min后放入水中，因这种方法增加感染机会，现已少用。也可在青蛙背部缝上不同颜色的小珠作为记号。
卵母细胞的消化：卵母细胞的好坏直接影响通道电流的记录，应予高度重视。我们一般采用两步消化法分离单个卵母细胞。将含卵母细胞的组织取出并剪成1 cm3大小的小块，放入不含钙离子的OR2溶液中(钙离子可增加酶的活性而破坏细胞)并多次清洗去除残存血液。然后将卵母细胞置入含1 mg/ml胶原酶的OR2液中，室温下(20℃左右)缓慢振摇，建议用塑料离心管放在旋转器(rotator)上振摇，约1 h后取出，经OR2清洗数遍，再放入新的含1 mg/ml胶原酶的OR2中再次消化30～60 min，待大多细胞呈单个细胞时终止消化。用OR2反复仔细清洗，并及时挑选出健康细胞(一方面可避免液体中可能含有残存的酶继续消化细胞，另一方面可避免部分坏死细胞释放出的物质影响健康细胞)，保存于MBI或ND96溶液中，数小时后，经再次筛选再进行RNA注射，当天分离的细胞最好当天注射。每批胶原酶的质量不完全一致，消化时间亦不尽相同。
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卵母细胞的选择：显微镜下状态好的细胞外形较圆，色泽清晰，有一定张力。轻晃平皿，细胞会在平皿中滚动。细胞表面清洁光滑，不应残留纤维组织及毛细血管，否则会影响mRNA的注射及细胞的钳制。根据卵母细胞的成熟状况，将其分为6级，第Ⅰ级为最早期，直径在50～100 μm，呈透明状；第Ⅱ级细胞直径为350～450 μm，呈半透明或白色；第Ⅲ级直径在450～600 μm左右，可见细胞表面部分着色；第Ⅳ级直径600～1 000 μm，细胞分成着色深浅不同的两个半球；第Ⅴ级直径达1 000～1 200 μm，两部分分界明显，深色部分中央颜色稍浅；第Ⅵ级细胞最为成熟，直径1 200～1 300 μm，两半球中有明显的非着色带。
根据实验需要决定选用哪一级细胞。对大多数实验而言，第Ⅴ级最为适用，一方面此级细胞个体较大，可注射多达100 nl的溶液，另一方面也易于记录电流时的实验操作。但此级细胞膜电容达100～200 nF，因此钳制时电容电流可有1～2 ms。第Ⅱ级和第Ⅲ级的小细胞电容电流较小，也可用于实验，但细胞容量也相对较小，只能注入20 nl左右的液体。对于刚刚开展此项工作的单位，建议选用第Ⅴ级细胞为好。
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3 mRNA的注射方法
设备：用于卵母细胞微注射的微注射仪要求精确到nl级，以Drummond公司的微注射仪(nanoj
ect,Drummond,Cat.No.3-00-203-XV)为例，注射容量为4.6～73.65 nl，以每级4.6 nl递增。设备配用专用毛细管以保证注射容量的准确。用常规电极拉制方法拉制注射用针。因mRNA较为粘稠，若针尖太小则不易流出。因此，使用前应将拉制好的注射用针在干净的薄面巾纸上刺一下，使针尖破裂。也可在电极抛光仪上用熔点较低的玻璃球切去针尖头端，这样处理后的针尖更为平整光滑。一般而言，针尖的直径在20～40 μm较为适宜。安装注射用针之前，先在针内注入矿物油(light mineral oil)以润滑管壁。
根据mRNA的浓度以及卵母细胞的需要量，取相应体积的mRNA，小心滴在干净的parafilm上，用微注射仪将RNA吸入到注射用针中。要注意严防RNA酶的污染，严防空气被吸入到注射用针中，这两点均会影响mRNA在细胞中的有效表达。
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每隔一段时间，应注意检查“O”环是否紧密，以保证注射容量的准确。
注射方法：将挑选好的卵母细胞置入60 mm的培养皿中，底部粘上塑料网格或用刀片将底部划成小格，以防止注射时卵母细胞在平皿中滑动。仔细调节三维微操纵器，使针尖接触细胞表面。若细胞状态良好，针尖接触细胞膜时会感觉到一定的阻力，同时可见细胞膜上因张力形成的皱褶。穿刺细胞不宜过深，以针尖刚刚穿过细胞膜为宜，注射后细胞会轻微鼓胀。若针尖极易刺入细胞，无明显张力，表明细胞状态不佳，意味着此细胞可能无法钳制到所需电位，建议放弃注射。
成熟的卵母细胞一般可容纳100 nl的液体，但根据我们的经验，不要超过50～70 nl，否则细胞在孵化过程中容易破裂。注射容量也不宜过小，当容量过小时，即使在显微镜下也难以观察到细胞体积的变化，从而无法判断mRNA是否成功注入了细胞。因此，建议调整mRNA浓度，使注射容积在10～50 nl之间。由于不同mRNA的表达效率不同，每开始新的实验前，应按浓度梯度注射mRNA以选择合适的剂量。
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4 卵母细胞的培养
注射后的卵母细胞应置于含抗生素的MB1或ND96中，常用抗生素为100 U/ml的青霉素和100 μg/ml的链霉素，一周内不需换液。卵母细胞可置于35或60 mm的培养皿中孵化。我们常规应用96孔培养板培养，好处在于即使有个别细胞破裂，流出的胞内物质也不会污染或损害其他细胞。最适宜的培养温度为18～21℃，温度过低影响mRNA的表达，温度过高则影响卵母细胞的存活，因此建议用温度控制器控制冰箱或温箱内的温度以保证细胞的良好状态及mRNA通道蛋白的表达。注射后第2～7天的卵母细胞可用于实验。状态好的细胞形态上应与注射前无明显差别。用于卵母细胞培养的冰箱或温箱应定期清洁。
附录：常用液体的配方
OR2溶液(不含钙离子)：82.5 mM NaCl、2 mM KCl、1 mM MgCl2、5 mM HEPES，用NaOH调节pH值至7.4。
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ND96溶液：96 mM NaCl、2 mM KCl、1.8 mM CaCl2、1 mM MgCl2、5 mM HEPES，用NaOH调节pH值至7.4。
MB1溶液：88 mM NaCl、1 mM KCl、2.4 mM NaHCO3、20 mM HEPES(pH值7.5)、0.82 mM MgSO4、0.33 mM Ca(NO3)2、0.41 mM CaCl2
Ringer＇s 液：115 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.8 mM CaCl2、10 mM HEPES(pH值7.2)。
作者简介：蒋学俊(1967— )，男(汉族)，湖北武汉人，博士后，现从事心血管的临床及基础研究。
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作者单位：蒋学俊(Penn State College of Medicine,Department of Cellular and Molecular Physiology)
李晓艳(湖北医科大学附属第一医院心内科)(Penn State College of Medicine,Department of Cellular and Molecular Physiology)
Randall L Rasmusson(Penn State College of Medicine,Department of Cellular and Molecular Physiology)
(待续), 百拇医药
关键词：离子通道 卵母细胞 表达 电生理 编者按：将分子生物学技术和电生理技术结合起来研究离子通道的方法一直是大家普遍看好的发展方向，在国内至今尚未能系统地开展研究。为促进这一技术在国内的推广、应用，我们将分期(2000年4期)系统介绍相关技术的实验方法，内容包括卵母细胞分离培养技术、mRNA微注射技术、双微电极电压钳制技术、cut-open实验技术、macro-patch及giant-patch实验技术、DNA提取纯化技术、RNA转录技术和定点突变技术。内容注重实用性，目标是使有意从事有关课题的读者阅读有关文章后能开展实验研究。
结合分子生物学技术，从基因的角度研究离子通道的实验方法，在国外已被普遍采用，并且被广泛应用于心血管学、药理学及神经生物学等领域，使通道的研究深入到了基因水平。本文从分子生物学到通道电流的记录系统地介绍该项研究所采用的基本技术方法，希望能对大家有所帮助。
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Ⅰ 卵母细胞的分离和培养
1 非洲蟾蜍的喂养
饲料：非洲蟾蜍本产于南美，学名为Xenopus laevis(简称青蛙)，主要分为野生及人工繁殖两种，均可用于实验。一般来说，野生青蛙个体较大，极少患病，但不食用人工合成的饲料，须用切碎的动物内脏(如牛肝)或动物内脏及鱼类混合制成的特殊饲料喂养。人工繁殖的青蛙则个体小，可用人工合成饲料喂养。中国科学院发育所有售。
环境：青蛙可耐受的温度范围很宽，但建议将环境温度保持在20℃～23℃为佳，同时采用人工照明的方法使青蛙每天各有12 h处于“白天”及“黑夜”，目的在于尽可能减少季节对卵母细胞的影响。一般而言，夏季卵母细胞的质量相对较差。因此，保持稳定的外环境有利于实验室正常地开展研究工作，此对于野生型青蛙尤为重要。
喂养方法：青蛙喜静水，应喂养于下部涂黑的水箱中，水深10～13 cm，每只青蛙大致需液体2～3升，1～2天换水1次。每周仅需喂食2～3次，每次每只青蛙约需饲料5～10 g，喂食4～6 h后换水。每周清洁水箱2～3次。饲养青蛙的常用溶液配方为：溶液A，87.5% NaCl及1.75% CaCl2；溶液B，0.25% NaHCO3；将溶液A和溶液B各20 ml加入到5L的蒸馏水中，即可使用。
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常见疾病：最常见的疾病为红腿病(red leg)，系由水中的气单胞菌属菌、假单胞菌属菌、变形杆菌等引起的败血症。首先在青蛙的后肢及腹部出现点状皮下出血，表现为局部的“红”、“肿”，肢体溃烂，常可致命。在液体中加入青、链霉素500 mg/ml，治疗数日可能有帮助。
2 卵母细胞的分离
手术：常用麻醉药为tricaine，有效浓度为0.15%～0.35%，过高浓度会损伤青蛙。将青蛙置入麻醉液中，约15 min后取出，腹部向上平放，若青蛙不能翻身，即可进行手术。低温状态下麻醉效果更好。tricaine可保存于4℃环境，反复使用。最后一次手术时可过量麻醉青蛙，术后直接放入冰箱中处死。
麻醉完全后，将青蛙背部向下平放，于下腹部正中偏外0.5 cm左右纵向切开一长约1 cm的切口，切开筋膜即可见卵母细胞。青蛙皮肤较厚且硬，表面滑腻，可先用针头穿刺皮肤，以方便手术。取出足量的卵母细胞组织，置入溶液OR2中(参见附录)，以5-0丝线缝合皮肤。术后青蛙尚未完全恢复，须在空气中呼吸，将其放入小盆中，水面不要淹没其头部。约1小时后，待青蛙完全清醒再放回原处。
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青蛙对抗生素极为敏感，其皮肤表面可分泌一种名为爪蟾抗菌肽(magainin)的肽类物质，具有很强的抗菌作用，因此，术后一般不需使用抗生素。卵母细胞可分多次取出，依每次所需的数量而定。但多次手术后卵母细胞的质量会有所下降。为便于跟踪青蛙，可用不同方法进行标记。如在清醒前用4N HCl在其背部写上号码，1～2 min后放入水中，因这种方法增加感染机会，现已少用。也可在青蛙背部缝上不同颜色的小珠作为记号。
卵母细胞的消化：卵母细胞的好坏直接影响通道电流的记录，应予高度重视。我们一般采用两步消化法分离单个卵母细胞。将含卵母细胞的组织取出并剪成1 cm3大小的小块，放入不含钙离子的OR2溶液中(钙离子可增加酶的活性而破坏细胞)并多次清洗去除残存血液。然后将卵母细胞置入含1 mg/ml胶原酶的OR2液中，室温下(20℃左右)缓慢振摇，建议用塑料离心管放在旋转器(rotator)上振摇，约1 h后取出，经OR2清洗数遍，再放入新的含1 mg/ml胶原酶的OR2中再次消化30～60 min，待大多细胞呈单个细胞时终止消化。用OR2反复仔细清洗，并及时挑选出健康细胞(一方面可避免液体中可能含有残存的酶继续消化细胞，另一方面可避免部分坏死细胞释放出的物质影响健康细胞)，保存于MBI或ND96溶液中，数小时后，经再次筛选再进行RNA注射，当天分离的细胞最好当天注射。每批胶原酶的质量不完全一致，消化时间亦不尽相同。
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卵母细胞的选择：显微镜下状态好的细胞外形较圆，色泽清晰，有一定张力。轻晃平皿，细胞会在平皿中滚动。细胞表面清洁光滑，不应残留纤维组织及毛细血管，否则会影响mRNA的注射及细胞的钳制。根据卵母细胞的成熟状况，将其分为6级，第Ⅰ级为最早期，直径在50～100 μm，呈透明状；第Ⅱ级细胞直径为350～450 μm，呈半透明或白色；第Ⅲ级直径在450～600 μm左右，可见细胞表面部分着色；第Ⅳ级直径600～1 000 μm，细胞分成着色深浅不同的两个半球；第Ⅴ级直径达1 000～1 200 μm，两部分分界明显，深色部分中央颜色稍浅；第Ⅵ级细胞最为成熟，直径1 200～1 300 μm，两半球中有明显的非着色带。
根据实验需要决定选用哪一级细胞。对大多数实验而言，第Ⅴ级最为适用，一方面此级细胞个体较大，可注射多达100 nl的溶液，另一方面也易于记录电流时的实验操作。但此级细胞膜电容达100～200 nF，因此钳制时电容电流可有1～2 ms。第Ⅱ级和第Ⅲ级的小细胞电容电流较小，也可用于实验，但细胞容量也相对较小，只能注入20 nl左右的液体。对于刚刚开展此项工作的单位，建议选用第Ⅴ级细胞为好。
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3 mRNA的注射方法
设备：用于卵母细胞微注射的微注射仪要求精确到nl级，以Drummond公司的微注射仪(nanoj
ect,Drummond,Cat.No.3-00-203-XV)为例，注射容量为4.6～73.65 nl，以每级4.6 nl递增。设备配用专用毛细管以保证注射容量的准确。用常规电极拉制方法拉制注射用针。因mRNA较为粘稠，若针尖太小则不易流出。因此，使用前应将拉制好的注射用针在干净的薄面巾纸上刺一下，使针尖破裂。也可在电极抛光仪上用熔点较低的玻璃球切去针尖头端，这样处理后的针尖更为平整光滑。一般而言，针尖的直径在20～40 μm较为适宜。安装注射用针之前，先在针内注入矿物油(light mineral oil)以润滑管壁。
根据mRNA的浓度以及卵母细胞的需要量，取相应体积的mRNA，小心滴在干净的parafilm上，用微注射仪将RNA吸入到注射用针中。要注意严防RNA酶的污染，严防空气被吸入到注射用针中，这两点均会影响mRNA在细胞中的有效表达。
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每隔一段时间，应注意检查“O”环是否紧密，以保证注射容量的准确。
注射方法：将挑选好的卵母细胞置入60 mm的培养皿中，底部粘上塑料网格或用刀片将底部划成小格，以防止注射时卵母细胞在平皿中滑动。仔细调节三维微操纵器，使针尖接触细胞表面。若细胞状态良好，针尖接触细胞膜时会感觉到一定的阻力，同时可见细胞膜上因张力形成的皱褶。穿刺细胞不宜过深，以针尖刚刚穿过细胞膜为宜，注射后细胞会轻微鼓胀。若针尖极易刺入细胞，无明显张力，表明细胞状态不佳，意味着此细胞可能无法钳制到所需电位，建议放弃注射。
成熟的卵母细胞一般可容纳100 nl的液体，但根据我们的经验，不要超过50～70 nl，否则细胞在孵化过程中容易破裂。注射容量也不宜过小，当容量过小时，即使在显微镜下也难以观察到细胞体积的变化，从而无法判断mRNA是否成功注入了细胞。因此，建议调整mRNA浓度，使注射容积在10～50 nl之间。由于不同mRNA的表达效率不同，每开始新的实验前，应按浓度梯度注射mRNA以选择合适的剂量。
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4 卵母细胞的培养
注射后的卵母细胞应置于含抗生素的MB1或ND96中，常用抗生素为100 U/ml的青霉素和100 μg/ml的链霉素，一周内不需换液。卵母细胞可置于35或60 mm的培养皿中孵化。我们常规应用96孔培养板培养，好处在于即使有个别细胞破裂，流出的胞内物质也不会污染或损害其他细胞。最适宜的培养温度为18～21℃，温度过低影响mRNA的表达，温度过高则影响卵母细胞的存活，因此建议用温度控制器控制冰箱或温箱内的温度以保证细胞的良好状态及mRNA通道蛋白的表达。注射后第2～7天的卵母细胞可用于实验。状态好的细胞形态上应与注射前无明显差别。用于卵母细胞培养的冰箱或温箱应定期清洁。
附录：常用液体的配方
OR2溶液(不含钙离子)：82.5 mM NaCl、2 mM KCl、1 mM MgCl2、5 mM HEPES，用NaOH调节pH值至7.4。
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ND96溶液：96 mM NaCl、2 mM KCl、1.8 mM CaCl2、1 mM MgCl2、5 mM HEPES，用NaOH调节pH值至7.4。
MB1溶液：88 mM NaCl、1 mM KCl、2.4 mM NaHCO3、20 mM HEPES(pH值7.5)、0.82 mM MgSO4、0.33 mM Ca(NO3)2、0.41 mM CaCl2
Ringer＇s 液：115 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.8 mM CaCl2、10 mM HEPES(pH值7.2)。
作者简介：蒋学俊(1967— )，男(汉族)，湖北武汉人，博士后，现从事心血管的临床及基础研究。
, 百拇医药
作者单位：蒋学俊(Penn State College of Medicine,Department of Cellular and Molecular Physiology)
李晓艳(湖北医科大学附属第一医院心内科)(Penn State College of Medicine,Department of Cellular and Molecular Physiology)
Randall L Rasmusson(Penn State College of Medicine,Department of Cellular and Molecular Physiology)
(待续), 百拇医药