自发性高血压大鼠肝阳上亢证模型肾上腺组织的酪氨酸羟化酶基因表达研究
作者：鄢东红 金益强 唐发清 肖纯 胡随瑜 王勇华 张翔
单位：湖南医科大学湘雅医院中西医结合研究所 长沙 410008
关键词：自发性高血压大鼠；肝阳上亢证；酪氨酸羟化酶；基因表达
中国现代医学杂志000812 目的：研究自发性高血压大鼠(SHR)肝阳上亢证模型的酪氨酸羟化酶(TH)基因表达水平及潜阳方对其影响。方法：采用免疫组织化学方法和原位杂交法分别测定该模型肾上腺组织TH蛋白质及mRNA表达。结果：SHR肝阳上亢证模型TH蛋白质及mRNA表达均明显增强，经用具有平肝熄风作用的潜阳方治疗后，其表达水平下降。提示：SHR肝阳上亢证模型具有肾上腺组织TH表达增强的特点。
分类号 R-332
STUDY ON ADRENAL MEDULLA TYROSINE HYDROXYLASE
, 百拇医药
GENE EXPRESSION IN GAN YANG SHANG KANG SYNDROME MODEL
OF SPONTANEOUS HYPERTENDION RATS
Yan Donghong Jin Yiqiang Tang Faqing Xiao Chun
(Institute of Combined Traditional Chinese and Western Medicine, the Affiliated Xiangya Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410008)
[Abstract] Objective: To investigate the tyrosine hydroxylase (TH) gene expression in Gan Yang Shang Kang Syndrome (GYSKS) model of spontaneous hypertension rats (SHR) and the effects of Qian Yang Fang treatment. Methods: Adrenal medulla TH protein level was examined by immunohistochemistry and TH gene mRNA expression was determined by in situ hybridization. Results: TH protein level and mRNA expression in GYSKS model of SHR were obviously enhanced and with the treatment of Qian Yang Fang, the gene expression level decreased. Conclusions: Adrenal medulla TH gene expression enhanced is the character of GYSKS model of SHR.
, 百拇医药
Key words: Spontaneous Hypertension Rats; Gan Yang Shang Kang Syndrome; Tyrosine Hydroxylase; Gene Expression
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 正常Wistar大鼠10只，雌雄各半。3月龄，体重180～210g。由湖南医科大学实验动物中心提供；自发性高血压大鼠36只，雌雄各半，3月龄，体重180～210g，购自北京中国医学科学院阜外心血管医院实验动物中心。
1.1.2 主要仪器 超低温冰箱(SANYO牌，日本产)；恒温冷冻切片机(SLEEMAINZ型，德国产)；高速台式离心机(5415C型，德国产)；显微镜(Olympus型，日本产)；图像分析系统(MIAS-300型，美国产)。
, http://www.100md.com
1.1.3 主要试剂 酪氨酸羟化酶单克隆抗体(一抗，鼠抗)：购自德国宝灵曼公司；TH寡核苷酸探针：由上海生物工程公司合成，其序列为：5’-CCTGCTTGGCATCCTGCTCTGAGA-3’；即用型ABC试剂盒购自华美生物工程公司。中药材均由湖南医科大学附属湘雅医院药剂科提供。
1.1.4 附子汤 由单味制附子20g组成。煎2次后将药液浓缩为每毫升药液含0.1g生药。
1.1.5 潜阳方 由石决明、钩藤、黄芩、桑寄生、葛根、川牛膝等组成。功能：平肝潜阳，主治高血压病肝阳上亢证。煎2次后将药液浓缩为每毫升药液含1g生药。
1.2 分组与处理
正常对照组(简称正常组，n=10)；正常Wistar大鼠，普通饲养，自动饮水，不做任何处理。自发性高血压组(简称SHR组，n=8)；SHR大鼠，灌蒸馏水6周。附子汤造模组(简称肝阳上亢组，n=8)；SHR大鼠，灌服附子汤4周，不予治疗，从第5周开始灌服蒸馏水2周。潜阳方治疗组(简称潜阳方组，n=10)；SHR大鼠，灌服附子汤4周，第5周开始服中药潜阳方2周。每日灌服潜阳煎剂20ml/kg，相当于生药20g/kg.d，按动物表面积系数折算，相当于70kg成人临床剂量的1.9保。
, 百拇医药
1.3 方法
1.3.1 自发性高血压大肝鼠阳上亢证模型的复制 参照肖纯[2]的方法，选用自发性高血压大鼠加灌附子汤的方法造模，20ml/kg/d灌胃，相当生药2g/kg/d，共4周。
1.3.2 肾上腺组织TH蛋白质水平测定(免疫组织化学方法)[3] 将肾上腺组织先解冻，再固定，脱水，透明，浸蜡，组织包埋，切片(5μm)，然后脱蜡。将切片按ABC法进行免疫组织化学染色：严格按试剂盒说明书操作。结果用图象分析系统进行形态计量分析。
1.3.3 肾上腺组织TH基因mRNA表达检测(原位杂交法) 参照S.Dumas[4]等合成寡核苷酸探针，并参照姜泊[5]等编著的《分子生物学常用实验方法》进行。
1.3.4 形态计量分析 利用MIAS-300型图像分析系统，分别测定免疫组化染色阳性反应物和原位杂交信号的灰度值以反应各组标本产物的相对含量，每例随机选样10个高倍视野，约100个细胞的平均灰度值，则反映该例平均灰度值，它是用来表示图像透光率的参数，若细胞内阳性反应产物浓度(或杂交信号强度)越高(深)，透光率低则灰度值越低，反之则越大。
, 百拇医药
1.4 统计学分析
结果用均数±标准差(
±s)表示，各组间比较采用方差分析及q检验。
2 结果
2.1 各组大鼠TH免疫组化阳性产物灰度扫描结果 见表1
表1 各组TH免疫组化阳性产物
浓度值结果比较 (±s) 组别
n
TH免疫组化阳性产物浓度灰度值
, http://www.100md.com 正常组
5
6.67±6.48
SHR组
5
35.27±4.882)
肝阳上亢组
5
24.96±8.342)
潜阳方组
5
50.96±5.291)3)
, 百拇医药
注：1)与正常组比P<0.05
2)与正常组比P<0.01
3)与肝阳上亢组比P<0.01
肝阳上亢组灰度值最低，明显低于正常组及潜阳方组，差异均具有显著性意义(均P<0.05)。肝阳上组TH免疫组化阳性产物最浓，即抗TH强阳性，表明TH蛋白水平明显增高；而经潜阳方治疗后，TH免疫组化阳性产物降低，TH蛋白水平降低。
2.2 各组大鼠TH原位杂交信号灰度扫描结果 见表2
表2 各组大鼠TH原位杂交信号灰度值比较 (±s) 组别
n
, 百拇医药
TH原位杂志信号灰度值
正常组
5
72.85±6.17
SHR组
5
35.98±6.212)
肝阳上亢组
5
22.16±1.482)
潜阳方组
5
, http://www.100md.com
48.89±6.031)3)
注：1)与正常组比P<0.05
2)与正常组比P<0.01
3)与肝阳上亢组比P<0.05
肝阳上亢组TH基因原位杂交信号灰度值最低，明显低于正常组，SHR组及潜阳方组，差异均有显著性意义(P<0.05)；说明肝阳上亢组TH基因mRNA表达最强，TH基因mRNA明显上升，经中药潜阳方治疗后，THmRNA下降。
3 讨论
肝阳上亢证是中医肝病主要证型之一，常见于高血压病等。本所曾对肝阳上亢证进行层次、多系统的研究，发现其病理生理学基础为外周-交感肾上肾髓质功能亢进，主要病理环节为外周血浆去甲肾上腺素(NE)、肾上腺素(E)含量的增高[6]。但上述实验均着眼于整体水平的机能及生化研究，目前国内外尚未见有关阳上亢证的分子水平研究文献报道。本研究选择儿茶酚胺(CA)的特征性合成CA代谢的限速环节，调控CA整个代谢过程[7]。本研究采用用免疫组织化学方法和原位杂交法对各组大鼠肾上腺组织进行研究，分别从蛋白质水平和mRNA水平探讨所复制的SHR肝阳上亢证模型TH基因表达特点，以期从分子水平探讨自发性高血压大鼠肝阳上亢证的病理基础。
, 百拇医药
自发性高血压大鼠系从Wistar大鼠品系中筛选培育出来的，可形成稳定的高血压，并具有遗传倾向[8]。国外的研究已发现SHR肾上腺及脑内TH mRNA及TH活性较正常WKY大鼠高，认为SHR的高血压与TH mRNA增加导致TH活性升高而引起NE、E的增加有关[9]。而且，有人研究发现成年SHR大鼠交感神经节中交感神经元比WKY大鼠多25%，在新出生动物中，虽然交感神经细胞数目在SHR与WKY中无差别，但SHR中交感神经细胞凋亡数目减少[10]，进一步证实了效感神经系统在高血压中的作用。TH是高血压病因学的侯选基因[11]。
本研究结果显示：肝阳上亢组大鼠TH免疫组化阳性产物灰度值最低(24.96±8.34)，明显低于SHR组(35.27±4.88)及正常组(63.67±6.48)。说明SHR肝阳上亢证模型的TH蛋白水平明显增高；经中药潜阳方治疗后，TH免疫组化阳性产物灰度值较肝阳上亢组高，为(50.96±5.29)，说明TH蛋白水平有所下降，潜阳方可使其增加的TH蛋白水平降低；肝阳上亢组大鼠TH基因原位杂交信号最强，灰度值(22.16±1.48)最低，其信号明显强于SHR组(35.98±6.21)及正常组(72.85±6.17)，表明SHR肝阳上亢组TH基因mRNA表达增加；经中药潜方治疗后，其杂交信号灰度值上升，为(48.89±6.03)，说明潜阳方可使增加的TH mRNA水平下降。由此说明，SHR大鼠在灌服附子汤复制成肝阳上亢证模型时，其肾上腺组织TH mRNA及蛋白质均明显增加，经具有平肝潜阳作用的潜阳方治疗后上述指标下降。本研究从两个水平(mRNA及蛋白质)发现SHR大鼠肝阳上亢证模型具有肾上腺组织TH基因表达增加的特点，提示高血压肝阳上亢证的形成与TH基因高表达有关，TH基因的过度表达可能是肝阳上亢形成的分子机理之一，但仍有待进一步深入研究。(本文承黎杏群教授指导，特致谢意!)
, http://www.100md.com
国家自然科学科学基本重点资助项目部分内容(No39670840)
参 考 文 献
1，陈国林，潘基民，赵玉秋，等.中医肝癌证侯临床辩证标准的研究.中国医药学报，1990；5(1)：66～73
2，肖 纯，金益强，胡随瑜，等.潜阳方对高血压肝阳上亢证大鼠模型的实验研究.湖南中医学院学报，1999；19(2)：8～10
3，王 键，鞠 躬.大鼠垂体前叶中的TH-，ChAT-免疫阳性神经纤维.中国组织化学与细胞化学杂志，1997；6(2)：129～132
4，Dumas S,Pequignot J.M,Ghilini G,et al.Plasticity of tyrosine hydroxylase gene expression in the rat nucleus tractus after ventilatory acclimatization to hypoxia.Mol.Brain.Res,1996;40:188～194
, 百拇医药
5，姜 泊，张亚历，周殿元，主编.分子生物学常用实验方法.北京：人民军医出版社，1996：137～139
6，金益强，黎杏群，陈国林，等.肝胆上亢证本质研究.中西医结合杂志，1998；8(3)：136～140
7，薛启薰编著.神经系统的生理和病理化学.第2版，北京：科学出版社，1992；183～187
8，卢耀增主编.实验动物学.北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1995：251～252
9，Kumai T,Tanaka M,Watanabe M,et al.Influence of androgen on trrosine hydroxylase mRNA in adrenal medulla of spotaneously hypertensive rats.Hypertension,1995;26(1):208～212
, http://www.100md.com
10，Messina A,Bertram JF,Bakhle YS,et al.Decreased development cell death in sympathetic and spinal sensory nervous systems of the kyoto spontaneously hypertensive rat.J.Hypertens,1996;14(9):1111～1115
11，Shamrma P,Hingorani A,Jia H,et al.Possociation of tyrosine hydroxylase microsatelite marker to essential hyperension.Hypertension,1998;32(4):676～682
收稿：1999-08-12, 百拇医药
单位：湖南医科大学湘雅医院中西医结合研究所 长沙 410008
关键词：自发性高血压大鼠；肝阳上亢证；酪氨酸羟化酶；基因表达
中国现代医学杂志000812 目的：研究自发性高血压大鼠(SHR)肝阳上亢证模型的酪氨酸羟化酶(TH)基因表达水平及潜阳方对其影响。方法：采用免疫组织化学方法和原位杂交法分别测定该模型肾上腺组织TH蛋白质及mRNA表达。结果：SHR肝阳上亢证模型TH蛋白质及mRNA表达均明显增强，经用具有平肝熄风作用的潜阳方治疗后，其表达水平下降。提示：SHR肝阳上亢证模型具有肾上腺组织TH表达增强的特点。
分类号 R-332
STUDY ON ADRENAL MEDULLA TYROSINE HYDROXYLASE
, 百拇医药
GENE EXPRESSION IN GAN YANG SHANG KANG SYNDROME MODEL
OF SPONTANEOUS HYPERTENDION RATS
Yan Donghong Jin Yiqiang Tang Faqing Xiao Chun
(Institute of Combined Traditional Chinese and Western Medicine, the Affiliated Xiangya Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410008)
[Abstract] Objective: To investigate the tyrosine hydroxylase (TH) gene expression in Gan Yang Shang Kang Syndrome (GYSKS) model of spontaneous hypertension rats (SHR) and the effects of Qian Yang Fang treatment. Methods: Adrenal medulla TH protein level was examined by immunohistochemistry and TH gene mRNA expression was determined by in situ hybridization. Results: TH protein level and mRNA expression in GYSKS model of SHR were obviously enhanced and with the treatment of Qian Yang Fang, the gene expression level decreased. Conclusions: Adrenal medulla TH gene expression enhanced is the character of GYSKS model of SHR.
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Key words: Spontaneous Hypertension Rats; Gan Yang Shang Kang Syndrome; Tyrosine Hydroxylase; Gene Expression
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 正常Wistar大鼠10只，雌雄各半。3月龄，体重180～210g。由湖南医科大学实验动物中心提供；自发性高血压大鼠36只，雌雄各半，3月龄，体重180～210g，购自北京中国医学科学院阜外心血管医院实验动物中心。
1.1.2 主要仪器 超低温冰箱(SANYO牌，日本产)；恒温冷冻切片机(SLEEMAINZ型，德国产)；高速台式离心机(5415C型，德国产)；显微镜(Olympus型，日本产)；图像分析系统(MIAS-300型，美国产)。
, http://www.100md.com
1.1.3 主要试剂 酪氨酸羟化酶单克隆抗体(一抗，鼠抗)：购自德国宝灵曼公司；TH寡核苷酸探针：由上海生物工程公司合成，其序列为：5’-CCTGCTTGGCATCCTGCTCTGAGA-3’；即用型ABC试剂盒购自华美生物工程公司。中药材均由湖南医科大学附属湘雅医院药剂科提供。
1.1.4 附子汤 由单味制附子20g组成。煎2次后将药液浓缩为每毫升药液含0.1g生药。
1.1.5 潜阳方 由石决明、钩藤、黄芩、桑寄生、葛根、川牛膝等组成。功能：平肝潜阳，主治高血压病肝阳上亢证。煎2次后将药液浓缩为每毫升药液含1g生药。
1.2 分组与处理
正常对照组(简称正常组，n=10)；正常Wistar大鼠，普通饲养，自动饮水，不做任何处理。自发性高血压组(简称SHR组，n=8)；SHR大鼠，灌蒸馏水6周。附子汤造模组(简称肝阳上亢组，n=8)；SHR大鼠，灌服附子汤4周，不予治疗，从第5周开始灌服蒸馏水2周。潜阳方治疗组(简称潜阳方组，n=10)；SHR大鼠，灌服附子汤4周，第5周开始服中药潜阳方2周。每日灌服潜阳煎剂20ml/kg，相当于生药20g/kg.d，按动物表面积系数折算，相当于70kg成人临床剂量的1.9保。
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1.3 方法
1.3.1 自发性高血压大肝鼠阳上亢证模型的复制 参照肖纯[2]的方法，选用自发性高血压大鼠加灌附子汤的方法造模，20ml/kg/d灌胃，相当生药2g/kg/d，共4周。
1.3.2 肾上腺组织TH蛋白质水平测定(免疫组织化学方法)[3] 将肾上腺组织先解冻，再固定，脱水，透明，浸蜡，组织包埋，切片(5μm)，然后脱蜡。将切片按ABC法进行免疫组织化学染色：严格按试剂盒说明书操作。结果用图象分析系统进行形态计量分析。
1.3.3 肾上腺组织TH基因mRNA表达检测(原位杂交法) 参照S.Dumas[4]等合成寡核苷酸探针，并参照姜泊[5]等编著的《分子生物学常用实验方法》进行。
1.3.4 形态计量分析 利用MIAS-300型图像分析系统，分别测定免疫组化染色阳性反应物和原位杂交信号的灰度值以反应各组标本产物的相对含量，每例随机选样10个高倍视野，约100个细胞的平均灰度值，则反映该例平均灰度值，它是用来表示图像透光率的参数，若细胞内阳性反应产物浓度(或杂交信号强度)越高(深)，透光率低则灰度值越低，反之则越大。
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1.4 统计学分析
结果用均数±标准差(
±s)表示，各组间比较采用方差分析及q检验。2 结果
2.1 各组大鼠TH免疫组化阳性产物灰度扫描结果 见表1
表1 各组TH免疫组化阳性产物
浓度值结果比较 (
±s) 组别n
TH免疫组化阳性产物浓度灰度值
, http://www.100md.com 正常组
5
6.67±6.48
SHR组
5
35.27±4.882)
肝阳上亢组
5
24.96±8.342)
潜阳方组
5
50.96±5.291)3)
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注：1)与正常组比P<0.05
2)与正常组比P<0.01
3)与肝阳上亢组比P<0.01
肝阳上亢组灰度值最低，明显低于正常组及潜阳方组，差异均具有显著性意义(均P<0.05)。肝阳上组TH免疫组化阳性产物最浓，即抗TH强阳性，表明TH蛋白水平明显增高；而经潜阳方治疗后，TH免疫组化阳性产物降低，TH蛋白水平降低。
2.2 各组大鼠TH原位杂交信号灰度扫描结果 见表2
表2 各组大鼠TH原位杂交信号灰度值比较 (
±s) 组别n
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TH原位杂志信号灰度值
正常组
5
72.85±6.17
SHR组
5
35.98±6.212)
肝阳上亢组
5
22.16±1.482)
潜阳方组
5
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48.89±6.031)3)
注：1)与正常组比P<0.05
2)与正常组比P<0.01
3)与肝阳上亢组比P<0.05
肝阳上亢组TH基因原位杂交信号灰度值最低，明显低于正常组，SHR组及潜阳方组，差异均有显著性意义(P<0.05)；说明肝阳上亢组TH基因mRNA表达最强，TH基因mRNA明显上升，经中药潜阳方治疗后，THmRNA下降。
3 讨论
肝阳上亢证是中医肝病主要证型之一，常见于高血压病等。本所曾对肝阳上亢证进行层次、多系统的研究，发现其病理生理学基础为外周-交感肾上肾髓质功能亢进，主要病理环节为外周血浆去甲肾上腺素(NE)、肾上腺素(E)含量的增高[6]。但上述实验均着眼于整体水平的机能及生化研究，目前国内外尚未见有关阳上亢证的分子水平研究文献报道。本研究选择儿茶酚胺(CA)的特征性合成CA代谢的限速环节，调控CA整个代谢过程[7]。本研究采用用免疫组织化学方法和原位杂交法对各组大鼠肾上腺组织进行研究，分别从蛋白质水平和mRNA水平探讨所复制的SHR肝阳上亢证模型TH基因表达特点，以期从分子水平探讨自发性高血压大鼠肝阳上亢证的病理基础。
, 百拇医药
自发性高血压大鼠系从Wistar大鼠品系中筛选培育出来的，可形成稳定的高血压，并具有遗传倾向[8]。国外的研究已发现SHR肾上腺及脑内TH mRNA及TH活性较正常WKY大鼠高，认为SHR的高血压与TH mRNA增加导致TH活性升高而引起NE、E的增加有关[9]。而且，有人研究发现成年SHR大鼠交感神经节中交感神经元比WKY大鼠多25%，在新出生动物中，虽然交感神经细胞数目在SHR与WKY中无差别，但SHR中交感神经细胞凋亡数目减少[10]，进一步证实了效感神经系统在高血压中的作用。TH是高血压病因学的侯选基因[11]。
本研究结果显示：肝阳上亢组大鼠TH免疫组化阳性产物灰度值最低(24.96±8.34)，明显低于SHR组(35.27±4.88)及正常组(63.67±6.48)。说明SHR肝阳上亢证模型的TH蛋白水平明显增高；经中药潜阳方治疗后，TH免疫组化阳性产物灰度值较肝阳上亢组高，为(50.96±5.29)，说明TH蛋白水平有所下降，潜阳方可使其增加的TH蛋白水平降低；肝阳上亢组大鼠TH基因原位杂交信号最强，灰度值(22.16±1.48)最低，其信号明显强于SHR组(35.98±6.21)及正常组(72.85±6.17)，表明SHR肝阳上亢组TH基因mRNA表达增加；经中药潜方治疗后，其杂交信号灰度值上升，为(48.89±6.03)，说明潜阳方可使增加的TH mRNA水平下降。由此说明，SHR大鼠在灌服附子汤复制成肝阳上亢证模型时，其肾上腺组织TH mRNA及蛋白质均明显增加，经具有平肝潜阳作用的潜阳方治疗后上述指标下降。本研究从两个水平(mRNA及蛋白质)发现SHR大鼠肝阳上亢证模型具有肾上腺组织TH基因表达增加的特点，提示高血压肝阳上亢证的形成与TH基因高表达有关，TH基因的过度表达可能是肝阳上亢形成的分子机理之一，但仍有待进一步深入研究。(本文承黎杏群教授指导，特致谢意!)
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国家自然科学科学基本重点资助项目部分内容(No39670840)
参 考 文 献
1，陈国林，潘基民，赵玉秋，等.中医肝癌证侯临床辩证标准的研究.中国医药学报，1990；5(1)：66～73
2，肖 纯，金益强，胡随瑜，等.潜阳方对高血压肝阳上亢证大鼠模型的实验研究.湖南中医学院学报，1999；19(2)：8～10
3，王 键，鞠 躬.大鼠垂体前叶中的TH-，ChAT-免疫阳性神经纤维.中国组织化学与细胞化学杂志，1997；6(2)：129～132
4，Dumas S,Pequignot J.M,Ghilini G,et al.Plasticity of tyrosine hydroxylase gene expression in the rat nucleus tractus after ventilatory acclimatization to hypoxia.Mol.Brain.Res,1996;40:188～194
, 百拇医药
5，姜 泊，张亚历，周殿元，主编.分子生物学常用实验方法.北京：人民军医出版社，1996：137～139
6，金益强，黎杏群，陈国林，等.肝胆上亢证本质研究.中西医结合杂志，1998；8(3)：136～140
7，薛启薰编著.神经系统的生理和病理化学.第2版，北京：科学出版社，1992；183～187
8，卢耀增主编.实验动物学.北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1995：251～252
9，Kumai T,Tanaka M,Watanabe M,et al.Influence of androgen on trrosine hydroxylase mRNA in adrenal medulla of spotaneously hypertensive rats.Hypertension,1995;26(1):208～212
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10，Messina A,Bertram JF,Bakhle YS,et al.Decreased development cell death in sympathetic and spinal sensory nervous systems of the kyoto spontaneously hypertensive rat.J.Hypertens,1996;14(9):1111～1115
11，Shamrma P,Hingorani A,Jia H,et al.Possociation of tyrosine hydroxylase microsatelite marker to essential hyperension.Hypertension,1998;32(4):676～682
收稿：1999-08-12, 百拇医药