血清HBV DNA复制与慢性乙型肝炎肝脏损伤程度的研究
作者：周小辉 周元平 姚春兰 姚集鲁 高志良
单位：周小辉(汕头大学医学院第二附属医院内三科 515031)；周元平 姚春兰 姚集鲁 高志良(中山医科大学第三附属医院传染科 510630)
关键词：慢性乙型肝炎；HBV；DNA含量；荧光定量PCR；肝细胞损伤
中国现代医学杂志000808 目的：探讨慢性乙型肝炎急性发作时，HBV复制水平与肝脏组织损伤程度之间的关系。方法：对44例自发性发作的慢性乙型肝炎患者进行肝组织活检，并采用荧光定量多聚酶链反应测定血清HBV DNA含量。结果：血清HBV DNA含量与肝脏炎症程度(G1～G4)及纤维化程度(S1～S4)之间比较，无明显相关性(P>0.05)；与血清丙氨酸转氨酶(ALT)、门冬氨酸转氨酶(AST)及总胆红素(T-BILI)之间也无相关性。结论：肝细胞损伤程度与不同个体中的HBV复制的绝对数值没有关系。提示HBV不直接致肝细胞病变，不同个体复杂的免疫反应决定了肝脏的损伤程度。
, http://www.100md.com
分类号 R512.6+2
RESEARCH BETWEEN THE LEVEL OF
HBV DNA IN SERUM AND THE GRADE FO HISTOLIGICAL ACTIVITY
IN PATIENTS WITH CHRONIC HEPATITSB
Zhou Xiaohui Zhou Yuanping Yao Chunlan
(Department of Infectious Diseases, the Second Affiliated Hospital,Medical College of Shantou University, Shaotou 515031)
, http://www.100md.com
[Abstract] Objective: To clarify the relationship between the level of hepatitis B virus DNA (DNA) in serum and the grade of histological activity in the patients with chronic hepatitis B while the hepatic injury was activated. Methods: Forty-four patients proven as chronic hepatitis B patients by liver biopsy in episodes of acute exacerbation were placed into four groups according to their grade of hepatic histological activities. The serum HBV DNA copies were tested by the fluorogenic quantitative polymerize chain reaction (PCR). Results: There were no statistically significant differences in the levels of HBV DNA among G1～G4 groups (P>0.05) and among S1～S4 groups (P>0.05) respectively. Rank correlation was not found between the levels of HBV DNA and ALT or aspartate-aminotransferase (AST) or total bilirubin. Conclusions: The hepatitis B virus is not cytopathogenic. The absolute amount of the sera of HBV DNA in patients with chronic hepatitis B does not directly correlate with the grade of hepatitis histological. Complex immune responses in different individuals may determine the variable degree of hepatic injury.
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Key words: Chronic Hepatitis B; Serum HBV DNA; Histological Activity; Fluorogenic Quantitative PCR
目前认为，慢性乙型肝炎(CHB)肝脏的损伤并不是乙型肝炎病毒(HBV)直接导致，而是由于HBV的复制启动和激发机体的免疫反应的结果。那么，慢性乙型肝炎发作中，血清HBV的复制水平是否与肝脏损伤程度有关?我们对44例急性发作的慢性乙型肝炎患者的肝脏的形态学、生化学及病原学进行研究，以探讨其相互之间的关系。
1 材料和方法
1.1 一般资料
全部病例来自中山医科大学附属三医院传染住院部，共44例。男39例，女5例，平均年龄(29±7)岁(17～46岁)。
, http://www.100md.com 患者均进行穿刺。采用16或18G切割式自动活检针，在“B”超引导下进行。常规将肝组织标本以10%甲醛液固定，用石蜡包埋，连续切片分别进行苏木兰—伊红染色，光镜检查。肝活检前1月内，采集血清贮于-20℃冰箱中备测。
根据1995年5月北京第五次全国传染病寄生虫病学术会议——病毒性肝炎防治方案(试行)。44例患者诊断为慢性乙型肝炎。分别是：轻度15例；中度24例；重度5例(其中早期肝硬化3例)。
检测肝功能：谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)及总胆红素(T-BILI)等。44例患者中，33例ALT>正常2倍以上(ALT正常值<35u/L);8例ALT35～70u/L之间；3例患者入院时肝功能异常，至肝穿时已恢复正常。
所有患者HBsAg(+)，其中HBeAg(+)35例，抗-HBe(+)者9例。除乙型肝炎病毒标志外，均无其它肝炎病毒感染标志。
, 百拇医药
全部病例行腹部、肝脏、胆囊、脾脏及胰腺“B”超检查。
1.2 血清HBV DNA含量测定
采用荧光定量PCR方法测定血清HBV DNA。该方法将荧光标准探针结合在PCR扩增区的中间。探针5′端和3′端分别标记了荧光淬灭集体(R)和荧光报告集团(Q)。当探针完整时，R集团的荧光信号被Q集团淬灭。PCR反应开始后，随着链的延伸，Taq酶将荧光探针切断。此时，淬灭作用消失，R集团的荧光信号可被测定，其信号强弱与PCR产物数量成正比关系，从而测得HBV DNA的含量。检测灵敏度500拷贝/ml。
引物、探针和试剂等均由中山医科大学达安基因诊断中心提供。引物序列为：
PHBV1：5′ATCCTGCTGCTATGCCTCATCTT 3′
PHBV2：5′ ACAGTGGGGGAAAGCCCTACGAA 3′
, 百拇医药
荧光探针序列：
FPHBV：5′TGGCTAGTTTACTAGTGCCATTTG 3′
操作步骤：提取HBV DNA(达安诊断中心提供)；PCR扩增：预变性93℃120Sec,然后90℃45Sec、55℃150Sec共40个循环；依据纯化的HBV DNA建立的标准曲线，由PE7700全自动荧光定量PCR仪及计算机专用软件自动分析，读取HBV DNA模板数。
1.3 统计分析
数据转换为对数，采用均数±标准差表示。假设检验采用方差分析和相关分析等方法。检验水准a=0.05。所有统计学分析在SPSS软件完成。
2 结果
根据《病毒性肝炎防治方案》(试行)病理标准将肝脏炎症活动程度分为0～4级；肝脏纤维化程度分为0～4期。本组病例无0级和0度。
, 百拇医药
2.1 血清HBV DNA含量与肝脏炎症程度
本组病例共有4组，其血清HBV DNA含量(见表1)。经单因素方差分析G1～G4四组之间的血清HBV DNA含量无显著差异(F=0.5022,P>0.05)。血清HBV DNA含量与肝细胞的损伤程度没有相关关系。但血清HBV DNA含量有随肝细胞炎症程度的加重而降低趋势。
表1 血清HBV DNA含量与肝脏炎症程度关系 病例数
(n=44)
肝脏炎症程度
(G)
血清HBV DNA(对数值)
(
±s)
, 百拇医药
4
1
9.27±1.168
13
2
7.978±2.706
22
3
7.501±3.113
5
4
7.06±4.097
2.2 血清HBV DNA含量与肝脏纤维化程度的关系
, 百拇医药
本组病例共有4组，其血清HBV DNA含量及肝脏纤维化程度分级关系见表2。经单因素方差分析，S1～S4四组之间的血清HBV DNA含量无显著差异(F=1.3306,P>0.05)。血清HBV DNA含量与肝细胞的纤维化程度没有相关关系。但血清HBV DNA含量也有随肝脏纤维化程度的加重而减少的趋势。表2 血清HBV DNA含量与肝脏纤维化程度关系 病例数
(n=44)
肝脏纤维化程度
(G)
血清HBV DNA(对数值)
(±s)
, 百拇医药
12
1
9.132±0.849
9
2
7.428±3.137
19
3
7.311±3.298
4
4
7.458±4.468
2.3 血清HBV DNA含量与肝脏功能部分指标的关系
, http://www.100md.com
我们还分析了患者的血清HBV DNA含量、血清ALT、AST及T-BILI两两之间的相关关系，经双变量相关分析(Bivariate)统计学处理，斯皮尔曼(Spearman)秩相关系数均无显著性意义。
本实验中5例患者的HBV DNA含量低于检测敏感度。
3 讨论
我们对44例CHB患者肝组织炎症活动程度与血清HBV DNA含量的关系研究显示：血清HBV DNA 平均水平与肝脏炎症程度(G1～G4)及纤维化程度(S1～S4)没有显著性差异，与血清ALT、AST及STB也无数量上的相关关系，就不同个体的病者而言，他们的血清HBV DNA的复制水平与肝脏的炎症程度没有关系。此外，我们还观察到血清HBV DNA含量有随着肝脏炎症和纤维化程度的加重而降低的趋势。因素，HBV并不是直接致肝脏细胞病变的，须经宿主免疫应答，对在肝细胞表面的HBV抗原所引起的宿主免疫应答，一般认为是肝细胞损伤的决定的因素[1]。
, 百拇医药
有关于CHB免疫损伤，有以下支持依据：“健康”HBV携带者尽管在肝细胞内存在着病毒的表达，但几乎没有或没有肝脏损伤的证据[2]；慢性乙型肝炎坏死的肝细胞和单核细胞从形态学上的并列[3]；CHB患者在使用免疫抑制剂如肾上腺皮质激素及化疗药物等治疗和撤退后[4～5]，患者出现急性肝炎发作，这与免疫活性的恢复相关。而我们的研究结果也支持慢性乙型肝炎是免疫介导的肝损伤的发病机制。
慢性乙型肝炎中血清HBV DNA的水平与肝脏的组织学之间表现的多样化，说明了CHB发病机制的复杂性。通过我们的研究，我们认为HBV的复制可能启动了慢性乙型肝炎病情发作，但HBV复制的绝对数值与肝细胞损伤的程度没有关系，肝脏的损伤并不是HBV复制的直接结果，不同个体复杂的机体免疫反应决定了肝脏损伤的程度。临床观察表明：HBV感染的重度和结局，与机体的免疫应答密切相关[6]。
卫生部优秀青年人才基金(基金编号97018)及美国中华医学基金课题资助
, http://www.100md.com
参 考 文 献
1，骆抗先主编.乙型肝炎基础和临床.北京：北京出版社，1997：115
2，Gudat F,Bianchi L,Sonnabend W,et al.Pattern of core and surface expression in liver tissur e reflects state of specific immune response in hepatitis b.Lab Invest,1975;32:1～9
3，Gerbet MA,Thung SN.Biology of disease.Molecular and cellular pathology of hepatitis B.Lab Invest,1985;52:572～590
4，Hoofnagle JH,Dusheiko GM,Schafer D,et al.Reactivation of chronic hepatitis B virus infection by cancer chemotherapy.Ann Intern Med,1982;96:447～449
5，Nair PV,Tong MJ,Stevenson D,et al.A pilot study on the effects of prednisone withdrawal on serum hepatitis B virus DNA and HBeAg in chronic active hepatitis B.Hepatology,1986;6:1319～1324
6，汤正好，李 宜，常立非，等.聚合酶链式反应研究乙型肝炎患者血清HBV DNA与e系统的相关性.中国现代医学杂志，1997；7(8)：47～48
收稿：1999-12-25, http://www.100md.com
单位：周小辉(汕头大学医学院第二附属医院内三科 515031)；周元平 姚春兰 姚集鲁 高志良(中山医科大学第三附属医院传染科 510630)
关键词：慢性乙型肝炎；HBV；DNA含量；荧光定量PCR；肝细胞损伤
中国现代医学杂志000808 目的：探讨慢性乙型肝炎急性发作时，HBV复制水平与肝脏组织损伤程度之间的关系。方法：对44例自发性发作的慢性乙型肝炎患者进行肝组织活检，并采用荧光定量多聚酶链反应测定血清HBV DNA含量。结果：血清HBV DNA含量与肝脏炎症程度(G1～G4)及纤维化程度(S1～S4)之间比较，无明显相关性(P>0.05)；与血清丙氨酸转氨酶(ALT)、门冬氨酸转氨酶(AST)及总胆红素(T-BILI)之间也无相关性。结论：肝细胞损伤程度与不同个体中的HBV复制的绝对数值没有关系。提示HBV不直接致肝细胞病变，不同个体复杂的免疫反应决定了肝脏的损伤程度。
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分类号 R512.6+2
RESEARCH BETWEEN THE LEVEL OF
HBV DNA IN SERUM AND THE GRADE FO HISTOLIGICAL ACTIVITY
IN PATIENTS WITH CHRONIC HEPATITSB
Zhou Xiaohui Zhou Yuanping Yao Chunlan
(Department of Infectious Diseases, the Second Affiliated Hospital,Medical College of Shantou University, Shaotou 515031)
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[Abstract] Objective: To clarify the relationship between the level of hepatitis B virus DNA (DNA) in serum and the grade of histological activity in the patients with chronic hepatitis B while the hepatic injury was activated. Methods: Forty-four patients proven as chronic hepatitis B patients by liver biopsy in episodes of acute exacerbation were placed into four groups according to their grade of hepatic histological activities. The serum HBV DNA copies were tested by the fluorogenic quantitative polymerize chain reaction (PCR). Results: There were no statistically significant differences in the levels of HBV DNA among G1～G4 groups (P>0.05) and among S1～S4 groups (P>0.05) respectively. Rank correlation was not found between the levels of HBV DNA and ALT or aspartate-aminotransferase (AST) or total bilirubin. Conclusions: The hepatitis B virus is not cytopathogenic. The absolute amount of the sera of HBV DNA in patients with chronic hepatitis B does not directly correlate with the grade of hepatitis histological. Complex immune responses in different individuals may determine the variable degree of hepatic injury.
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Key words: Chronic Hepatitis B; Serum HBV DNA; Histological Activity; Fluorogenic Quantitative PCR
目前认为，慢性乙型肝炎(CHB)肝脏的损伤并不是乙型肝炎病毒(HBV)直接导致，而是由于HBV的复制启动和激发机体的免疫反应的结果。那么，慢性乙型肝炎发作中，血清HBV的复制水平是否与肝脏损伤程度有关?我们对44例急性发作的慢性乙型肝炎患者的肝脏的形态学、生化学及病原学进行研究，以探讨其相互之间的关系。
1 材料和方法
1.1 一般资料
全部病例来自中山医科大学附属三医院传染住院部，共44例。男39例，女5例，平均年龄(29±7)岁(17～46岁)。
, http://www.100md.com 患者均进行穿刺。采用16或18G切割式自动活检针，在“B”超引导下进行。常规将肝组织标本以10%甲醛液固定，用石蜡包埋，连续切片分别进行苏木兰—伊红染色，光镜检查。肝活检前1月内，采集血清贮于-20℃冰箱中备测。
根据1995年5月北京第五次全国传染病寄生虫病学术会议——病毒性肝炎防治方案(试行)。44例患者诊断为慢性乙型肝炎。分别是：轻度15例；中度24例；重度5例(其中早期肝硬化3例)。
检测肝功能：谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)及总胆红素(T-BILI)等。44例患者中，33例ALT>正常2倍以上(ALT正常值<35u/L);8例ALT35～70u/L之间；3例患者入院时肝功能异常，至肝穿时已恢复正常。
所有患者HBsAg(+)，其中HBeAg(+)35例，抗-HBe(+)者9例。除乙型肝炎病毒标志外，均无其它肝炎病毒感染标志。
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全部病例行腹部、肝脏、胆囊、脾脏及胰腺“B”超检查。
1.2 血清HBV DNA含量测定
采用荧光定量PCR方法测定血清HBV DNA。该方法将荧光标准探针结合在PCR扩增区的中间。探针5′端和3′端分别标记了荧光淬灭集体(R)和荧光报告集团(Q)。当探针完整时，R集团的荧光信号被Q集团淬灭。PCR反应开始后，随着链的延伸，Taq酶将荧光探针切断。此时，淬灭作用消失，R集团的荧光信号可被测定，其信号强弱与PCR产物数量成正比关系，从而测得HBV DNA的含量。检测灵敏度500拷贝/ml。
引物、探针和试剂等均由中山医科大学达安基因诊断中心提供。引物序列为：
PHBV1：5′ATCCTGCTGCTATGCCTCATCTT 3′
PHBV2：5′ ACAGTGGGGGAAAGCCCTACGAA 3′
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荧光探针序列：
FPHBV：5′TGGCTAGTTTACTAGTGCCATTTG 3′
操作步骤：提取HBV DNA(达安诊断中心提供)；PCR扩增：预变性93℃120Sec,然后90℃45Sec、55℃150Sec共40个循环；依据纯化的HBV DNA建立的标准曲线，由PE7700全自动荧光定量PCR仪及计算机专用软件自动分析，读取HBV DNA模板数。
1.3 统计分析
数据转换为对数，采用均数±标准差表示。假设检验采用方差分析和相关分析等方法。检验水准a=0.05。所有统计学分析在SPSS软件完成。
2 结果
根据《病毒性肝炎防治方案》(试行)病理标准将肝脏炎症活动程度分为0～4级；肝脏纤维化程度分为0～4期。本组病例无0级和0度。
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2.1 血清HBV DNA含量与肝脏炎症程度
本组病例共有4组，其血清HBV DNA含量(见表1)。经单因素方差分析G1～G4四组之间的血清HBV DNA含量无显著差异(F=0.5022,P>0.05)。血清HBV DNA含量与肝细胞的损伤程度没有相关关系。但血清HBV DNA含量有随肝细胞炎症程度的加重而降低趋势。
表1 血清HBV DNA含量与肝脏炎症程度关系 病例数
(n=44)
肝脏炎症程度
(G)
血清HBV DNA(对数值)
(
±s), 百拇医药
4
1
9.27±1.168
13
2
7.978±2.706
22
3
7.501±3.113
5
4
7.06±4.097
2.2 血清HBV DNA含量与肝脏纤维化程度的关系
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本组病例共有4组，其血清HBV DNA含量及肝脏纤维化程度分级关系见表2。经单因素方差分析，S1～S4四组之间的血清HBV DNA含量无显著差异(F=1.3306,P>0.05)。血清HBV DNA含量与肝细胞的纤维化程度没有相关关系。但血清HBV DNA含量也有随肝脏纤维化程度的加重而减少的趋势。表2 血清HBV DNA含量与肝脏纤维化程度关系 病例数
(n=44)
肝脏纤维化程度
(G)
血清HBV DNA(对数值)
(
±s), 百拇医药
12
1
9.132±0.849
9
2
7.428±3.137
19
3
7.311±3.298
4
4
7.458±4.468
2.3 血清HBV DNA含量与肝脏功能部分指标的关系
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我们还分析了患者的血清HBV DNA含量、血清ALT、AST及T-BILI两两之间的相关关系，经双变量相关分析(Bivariate)统计学处理，斯皮尔曼(Spearman)秩相关系数均无显著性意义。
本实验中5例患者的HBV DNA含量低于检测敏感度。
3 讨论
我们对44例CHB患者肝组织炎症活动程度与血清HBV DNA含量的关系研究显示：血清HBV DNA 平均水平与肝脏炎症程度(G1～G4)及纤维化程度(S1～S4)没有显著性差异，与血清ALT、AST及STB也无数量上的相关关系，就不同个体的病者而言，他们的血清HBV DNA的复制水平与肝脏的炎症程度没有关系。此外，我们还观察到血清HBV DNA含量有随着肝脏炎症和纤维化程度的加重而降低的趋势。因素，HBV并不是直接致肝脏细胞病变的，须经宿主免疫应答，对在肝细胞表面的HBV抗原所引起的宿主免疫应答，一般认为是肝细胞损伤的决定的因素[1]。
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有关于CHB免疫损伤，有以下支持依据：“健康”HBV携带者尽管在肝细胞内存在着病毒的表达，但几乎没有或没有肝脏损伤的证据[2]；慢性乙型肝炎坏死的肝细胞和单核细胞从形态学上的并列[3]；CHB患者在使用免疫抑制剂如肾上腺皮质激素及化疗药物等治疗和撤退后[4～5]，患者出现急性肝炎发作，这与免疫活性的恢复相关。而我们的研究结果也支持慢性乙型肝炎是免疫介导的肝损伤的发病机制。
慢性乙型肝炎中血清HBV DNA的水平与肝脏的组织学之间表现的多样化，说明了CHB发病机制的复杂性。通过我们的研究，我们认为HBV的复制可能启动了慢性乙型肝炎病情发作，但HBV复制的绝对数值与肝细胞损伤的程度没有关系，肝脏的损伤并不是HBV复制的直接结果，不同个体复杂的机体免疫反应决定了肝脏损伤的程度。临床观察表明：HBV感染的重度和结局，与机体的免疫应答密切相关[6]。
卫生部优秀青年人才基金(基金编号97018)及美国中华医学基金课题资助
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1，骆抗先主编.乙型肝炎基础和临床.北京：北京出版社，1997：115
2，Gudat F,Bianchi L,Sonnabend W,et al.Pattern of core and surface expression in liver tissur e reflects state of specific immune response in hepatitis b.Lab Invest,1975;32:1～9
3，Gerbet MA,Thung SN.Biology of disease.Molecular and cellular pathology of hepatitis B.Lab Invest,1985;52:572～590
4，Hoofnagle JH,Dusheiko GM,Schafer D,et al.Reactivation of chronic hepatitis B virus infection by cancer chemotherapy.Ann Intern Med,1982;96:447～449
5，Nair PV,Tong MJ,Stevenson D,et al.A pilot study on the effects of prednisone withdrawal on serum hepatitis B virus DNA and HBeAg in chronic active hepatitis B.Hepatology,1986;6:1319～1324
6，汤正好，李 宜，常立非，等.聚合酶链式反应研究乙型肝炎患者血清HBV DNA与e系统的相关性.中国现代医学杂志，1997；7(8)：47～48
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