人体外周血TGF-β1的检测及其在慢性肝病中的诊断价值
作者：金志刚 高春芳 孔宪涛
单位：金志刚(第二军医大学长征医院临床实验科，上海 200003)；高春芳(浙江省诸暨市人民医院检验科，诸暨 311800.)；孔宪涛(浙江省诸暨市人民医院检验科，诸暨 311800.)
关键词：转化生长因子-β1; 肝纤维化; 血清学
第二军医大学学报000830 [中图分类号] R 575.04 [文献标识码] B
[文章编号] 0258-879X(2000)08-0793-02
转化生长因子β1(transforming growth facthor β1, TGF-β1)是一种由两条多肽链组成的具有多种生物学活性的多功能生长因子，相对分子质量为2.5万。体内多种细胞如淋巴细胞、血小板、巨噬细胞等均可合成与分泌TGF-β1，其中以血小板内含量最多[1]。TGF-β1与多种疾病如肝纤维化、肿瘤等有关。在TGF-β1与肝纤维化的相关性研究中，国内外研究大多着重于TGF-β1的生物学作用以及体内肝脏局部组织器官TGF-β1 mRNA的表达[2]，而对血清、血浆中TGF-β1检测及其在肝纤维化诊断中的价值、标本不同存放条件对检测结果的影响等研究较少。我们应用ELISA法测定了正常人新鲜血清、血浆中的TGF-β1含量和血清不同存放条件对测定结果的影响，以及慢性肝病患者血清TGF-β1水平，结果报告如下。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 标本来源 抽取上海市各大医院30例慢性肝病患者空腹静脉血，快速分离血清，-20℃保存，并于3 d内送检。其中透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅳ型胶原(ColⅣ)、Ⅲ型前胶原氨基端肽(PⅢNP)均有1～3项指标高于正常。正常人血清、血浆来自中心血站70名健康献血员。
1.2 标本处理方法 对正常人血清、血浆标本分别作如下处理：(1)立即检测; (2)4℃保存24 h; (3)室温放置24 h; (4)-20℃冻融2次; (5)-20℃反复冻融6次。
1.3 TGF-β1检测方法 采用双抗体夹心ELISA法(深圳晶美生物工程公司提供)。血清、血浆标本经酸化激活后与标准品一起加入已包被抗人TGF-β1单抗的酶标板上，室温2 h，洗涤4次，加入生物素化的抗人TGF-β1抗体，室温2 h，洗涤4次，加入酶标抗体30 min，洗涤4次，加入底物A，B液显色5～15 min，加终止液，酶标仪450 nm比色。以上步骤均严格按操作规程进行。
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1.4 统计学处理 数据以
±s表示，进行t检验。
2 结 果
2.1 正常人血清、血浆TGF-β1检测 血清TGF-β1为(21.45±10.41) ng/ml (n =30), 非常显著高于血浆检测结果(4.79±3.01) ng/ml (n=20, P<0.01)。
2.2 正常人血清经不同处理后的TGF-β1 表1显示，标本不同存放条件下的检测结果与立即检测的结果有显著差异。其中以室温放置过夜TGF-β1下降数值最大，其次为4℃保存及-20℃保存并冻融(P<0.01, P<0.05)。
2.3 正常人与慢性肝病患者血清TGF-β1比较 血清TGF-β1在慢性肝病患者为(15.61±13.82) ng/ml (n=30),显著低于正常人水平(P<0.05)。
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表 1 正常人血清经不同处理后TGF-β1的检测结果 存放条件
例数
TGF-β1(ρB/ng.ml-1)
立即测定
30
21.45±10.41
4℃保存24 h
10
9.62±4.98**
室温放置24 h
, 百拇医药
10
5.74±2.46**
-20℃冻融2次
10
14.00±9.63*
-20℃冻融6次
10
12.80±10.50*
*P<0.05, ** P<0.01与立即测定组比较
3 讨 论
, 百拇医药 TGF-β1具有调节细胞生长和分化的作用，其在纤维化形成中较突出的作用是促进胶原等细胞外基质的形成，同时抑制其降解。此外，TGF-β1还通过抑制胶原酶和蛋白酶的产生而减少胶原的降解。在诸多肝纤维化相关细胞因子中，TGF-β1是核心因子。它在肝纤维化中的作用可概括为：(1)刺激细胞外基质的合成；(2)抑制细胞外基质蛋白酶活性，如胶原酶等，从而减少细胞外基质降解；(3)促进组织抑制因子，如金属蛋白酶抑制剂、α2巨球蛋白等的分泌，减少胶原降解[3]。
TGF-β1在体内以非活性状态存在,激活时TGF-β1活性部分释放。在体外，对TGF-β1的活化是使其酸化。本研究分别对同一份标本的血清、血浆TGF-β1水平进行检测，结果显示，正常人新鲜血清TGF-β1含量明显高于正常人血浆(P<0.01)，这主要系血小板是血清中TGF-β1的重要来源。由于不同人血小板数有差异，因此，我们认为血浆TGF-β1更能准确反映体内TGF-β1表达水平。本研究与Kropf等[4]检测结果一致。正常人新鲜血清经不同存放条件处理后的TGF-β1检测结果之间有显著差异(P<0.01,P<0.05)，其中立即检测者最高，室温放置过夜,4℃保存及-20℃保存并反复冻融者(2～6次)均可使TGF-β1检测值不同程度下降,提示标本保存条件对检测结果至关重要。
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本研究对30例慢性肝病患者血清TGF-β1检测后，发现患者血清TGF-β1水平明显低于正常人新鲜血清，这与文献报道的TGF-β1在肝纤维化形成初期表达水平上升这一结论不一致，分析患者血清TGF-β1水平下降的主要原因有：(1)患者血清系来自上海市各大医院送检的标本，送检标本的新鲜度显然受到影响，而标本新鲜度对TGF-β1检测结果影响已在本研究中得到证实。(2)选择的30例慢性肝病患者样品中4项细胞外基质(HA，LN，PⅢNP，ColⅣ)检测结果中至少有1～3项检测指标高于正常人，可能系肝纤维化进展至一定程度。而有研究报道肝纤维化中后期TGF-β1表达水平下降[5]，这可能是导致患者TGF-β1检测值较低的重要原因。(3)血小板是血清中TGF-β1的重要来源，肝病患者的血小板数量是影响其检测结果的不可忽视的重要因素。(4)本研究选择30例标本所进行的检测仅是我们对该指标在肝病诊断应用中的初步探索。综上所述，临床标本检测中采用血浆更能反映TGF-β1水平，送检标本应尽可能新鲜，严格保存，避免反复冻融，确保检测结果准确性。血清检测TGF-β1作为肝纤维化诊断指标应慎重对待。
, 百拇医药
[基金项目] 上海市重点课题资助项目 (99ZD001).
[作者简介] 金志刚(1971-)，男(汉族)，技师.
[参 考 文 献]
[1] Asian RK, Sporran MB. Type beta transforming growth factor in human platelets: release during platelet degranulation and action on vascular smooth muscle cells[J]. J Cell Biol， 1986，102():1217-1223.
[2] Jakowlew SB, Mead JE, Danielpour D, et al. Transforming growth factor isoforms in rat liver regeneration: messenger RNA expression and activation of latent TGF-beta[J]. Cell Regul， 1991，2( ):535-548.
, 百拇医药
[3] 高春芳. 细胞因子与肝纤维化. 见: 仲人前,孔宪涛,主编. 肝病免疫学[M] . 上海:上海科技文献出版社, 1996. 121-129.
[4] Kropf J, Schurek JO, Wollner A,et al. Immunological measurement of transforming growth factor-beta 1(TGF-β1) in blood assay development and comparison[J]. Clin Chem, 1997,43(10): 1965-1974.
[5] Nakatsukasa H, Nagy P, Evarts RP,et al. Cellular distribution of transforming growth factor-beta 1 and procollagen types Ⅰ, Ⅲ, and Ⅳ transcripts in carbon tetrachloride-induced rat liver fibrosis[J]. J Clin Invest, 1990,85(6): 1833-1843.
[收稿日期] 2000-04-13
[修回日期]2000-06-03, 百拇医药
单位：金志刚(第二军医大学长征医院临床实验科，上海 200003)；高春芳(浙江省诸暨市人民医院检验科，诸暨 311800.)；孔宪涛(浙江省诸暨市人民医院检验科，诸暨 311800.)
关键词：转化生长因子-β1; 肝纤维化; 血清学
第二军医大学学报000830 [中图分类号] R 575.04 [文献标识码] B
[文章编号] 0258-879X(2000)08-0793-02
转化生长因子β1(transforming growth facthor β1, TGF-β1)是一种由两条多肽链组成的具有多种生物学活性的多功能生长因子，相对分子质量为2.5万。体内多种细胞如淋巴细胞、血小板、巨噬细胞等均可合成与分泌TGF-β1，其中以血小板内含量最多[1]。TGF-β1与多种疾病如肝纤维化、肿瘤等有关。在TGF-β1与肝纤维化的相关性研究中，国内外研究大多着重于TGF-β1的生物学作用以及体内肝脏局部组织器官TGF-β1 mRNA的表达[2]，而对血清、血浆中TGF-β1检测及其在肝纤维化诊断中的价值、标本不同存放条件对检测结果的影响等研究较少。我们应用ELISA法测定了正常人新鲜血清、血浆中的TGF-β1含量和血清不同存放条件对测定结果的影响，以及慢性肝病患者血清TGF-β1水平，结果报告如下。
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1 材料和方法
1.1 标本来源 抽取上海市各大医院30例慢性肝病患者空腹静脉血，快速分离血清，-20℃保存，并于3 d内送检。其中透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅳ型胶原(ColⅣ)、Ⅲ型前胶原氨基端肽(PⅢNP)均有1～3项指标高于正常。正常人血清、血浆来自中心血站70名健康献血员。
1.2 标本处理方法 对正常人血清、血浆标本分别作如下处理：(1)立即检测; (2)4℃保存24 h; (3)室温放置24 h; (4)-20℃冻融2次; (5)-20℃反复冻融6次。
1.3 TGF-β1检测方法 采用双抗体夹心ELISA法(深圳晶美生物工程公司提供)。血清、血浆标本经酸化激活后与标准品一起加入已包被抗人TGF-β1单抗的酶标板上，室温2 h，洗涤4次，加入生物素化的抗人TGF-β1抗体，室温2 h，洗涤4次，加入酶标抗体30 min，洗涤4次，加入底物A，B液显色5～15 min，加终止液，酶标仪450 nm比色。以上步骤均严格按操作规程进行。
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1.4 统计学处理 数据以
±s表示，进行t检验。2 结 果
2.1 正常人血清、血浆TGF-β1检测 血清TGF-β1为(21.45±10.41) ng/ml (n =30), 非常显著高于血浆检测结果(4.79±3.01) ng/ml (n=20, P<0.01)。
2.2 正常人血清经不同处理后的TGF-β1 表1显示，标本不同存放条件下的检测结果与立即检测的结果有显著差异。其中以室温放置过夜TGF-β1下降数值最大，其次为4℃保存及-20℃保存并冻融(P<0.01, P<0.05)。
2.3 正常人与慢性肝病患者血清TGF-β1比较 血清TGF-β1在慢性肝病患者为(15.61±13.82) ng/ml (n=30),显著低于正常人水平(P<0.05)。
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表 1 正常人血清经不同处理后TGF-β1的检测结果 存放条件
例数
TGF-β1(ρB/ng.ml-1)
立即测定
30
21.45±10.41
4℃保存24 h
10
9.62±4.98**
室温放置24 h
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10
5.74±2.46**
-20℃冻融2次
10
14.00±9.63*
-20℃冻融6次
10
12.80±10.50*
*P<0.05, ** P<0.01与立即测定组比较
3 讨 论
, 百拇医药 TGF-β1具有调节细胞生长和分化的作用，其在纤维化形成中较突出的作用是促进胶原等细胞外基质的形成，同时抑制其降解。此外，TGF-β1还通过抑制胶原酶和蛋白酶的产生而减少胶原的降解。在诸多肝纤维化相关细胞因子中，TGF-β1是核心因子。它在肝纤维化中的作用可概括为：(1)刺激细胞外基质的合成；(2)抑制细胞外基质蛋白酶活性，如胶原酶等，从而减少细胞外基质降解；(3)促进组织抑制因子，如金属蛋白酶抑制剂、α2巨球蛋白等的分泌，减少胶原降解[3]。
TGF-β1在体内以非活性状态存在,激活时TGF-β1活性部分释放。在体外，对TGF-β1的活化是使其酸化。本研究分别对同一份标本的血清、血浆TGF-β1水平进行检测，结果显示，正常人新鲜血清TGF-β1含量明显高于正常人血浆(P<0.01)，这主要系血小板是血清中TGF-β1的重要来源。由于不同人血小板数有差异，因此，我们认为血浆TGF-β1更能准确反映体内TGF-β1表达水平。本研究与Kropf等[4]检测结果一致。正常人新鲜血清经不同存放条件处理后的TGF-β1检测结果之间有显著差异(P<0.01,P<0.05)，其中立即检测者最高，室温放置过夜,4℃保存及-20℃保存并反复冻融者(2～6次)均可使TGF-β1检测值不同程度下降,提示标本保存条件对检测结果至关重要。
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本研究对30例慢性肝病患者血清TGF-β1检测后，发现患者血清TGF-β1水平明显低于正常人新鲜血清，这与文献报道的TGF-β1在肝纤维化形成初期表达水平上升这一结论不一致，分析患者血清TGF-β1水平下降的主要原因有：(1)患者血清系来自上海市各大医院送检的标本，送检标本的新鲜度显然受到影响，而标本新鲜度对TGF-β1检测结果影响已在本研究中得到证实。(2)选择的30例慢性肝病患者样品中4项细胞外基质(HA，LN，PⅢNP，ColⅣ)检测结果中至少有1～3项检测指标高于正常人，可能系肝纤维化进展至一定程度。而有研究报道肝纤维化中后期TGF-β1表达水平下降[5]，这可能是导致患者TGF-β1检测值较低的重要原因。(3)血小板是血清中TGF-β1的重要来源，肝病患者的血小板数量是影响其检测结果的不可忽视的重要因素。(4)本研究选择30例标本所进行的检测仅是我们对该指标在肝病诊断应用中的初步探索。综上所述，临床标本检测中采用血浆更能反映TGF-β1水平，送检标本应尽可能新鲜，严格保存，避免反复冻融，确保检测结果准确性。血清检测TGF-β1作为肝纤维化诊断指标应慎重对待。
, 百拇医药
[基金项目] 上海市重点课题资助项目 (99ZD001).
[作者简介] 金志刚(1971-)，男(汉族)，技师.
[参 考 文 献]
[1] Asian RK, Sporran MB. Type beta transforming growth factor in human platelets: release during platelet degranulation and action on vascular smooth muscle cells[J]. J Cell Biol， 1986，102():1217-1223.
[2] Jakowlew SB, Mead JE, Danielpour D, et al. Transforming growth factor isoforms in rat liver regeneration: messenger RNA expression and activation of latent TGF-beta[J]. Cell Regul， 1991，2( ):535-548.
, 百拇医药
[3] 高春芳. 细胞因子与肝纤维化. 见: 仲人前,孔宪涛,主编. 肝病免疫学[M] . 上海:上海科技文献出版社, 1996. 121-129.
[4] Kropf J, Schurek JO, Wollner A,et al. Immunological measurement of transforming growth factor-beta 1(TGF-β1) in blood assay development and comparison[J]. Clin Chem, 1997,43(10): 1965-1974.
[5] Nakatsukasa H, Nagy P, Evarts RP,et al. Cellular distribution of transforming growth factor-beta 1 and procollagen types Ⅰ, Ⅲ, and Ⅳ transcripts in carbon tetrachloride-induced rat liver fibrosis[J]. J Clin Invest, 1990,85(6): 1833-1843.
[收稿日期] 2000-04-13
[修回日期]2000-06-03, 百拇医药