芸香科植物飞龙掌血愈伤组织细胞培养物生物碱成分的研究
作者：司书毅 生田安喜良
单位：司书毅(中国医学科学院 中国协和医科大学 医药生物技术研究所 北京 100050)；生田安喜良(日本国东京理科大学综合研究所)
关键词：飞龙掌血；愈伤组织；细胞培养；生物碱
中草药000806 摘 要 目的：为研究芸香科各亚科及属之间的亲缘关系及化学分类基础。方法：对药用植物飞龙掌血(Toddalia asiatica)愈伤组织进行诱导生长和继代培养，收获培养7周的组织块，甲醇和乙酸乙酯提取物通过多次硅胶柱层析和Sephadex LH-20凝胶柱层析等方法进行生物碱等化学成分的分离与结构鉴定。结果：为采用药用植物飞龙掌血愈伤组织细胞培养的方法制备喹啉呋喃类药用生物碱提供依据。
芸香科植物飞龙掌血为产于亚洲、非洲及澳洲等地的一种药用植物[1，2]，其有效成分主要为生物碱和香豆素等。本科植物中所含的生物碱已被用来作为化学分类的重要依据。利用愈伤组织进行培养，对于研究生物碱等成分的生物合成途径以及用简单培养方法获得有效成分都是很有意义的。
1 实验材料与仪器
愈伤组织的诱生与继代培养：将新采集的原植物的茎与叶无菌操作下用刀片切成小块，经10%次氯酸钠消毒后，植于含有生长激素NAA(3 mg/L)和Kin(0.1 mg/L)或2，4-D(3 mg/L)和Kin(0.1 mg/L)的MS培养基上，在26 ℃下无菌孵育诱生约4 周后，将新生愈伤组织转植于含有2，4-D(1 mg/L)和Kin(0.1 mg/L)的MS培养基上进行继代培养，经数次继代扩大培养后收获(每一代培养周期为6～7周)。
JEOL JMS-SX102A质谱仪；GSX-500核磁共振仪，CDCl3为溶液，TMS为内标。层析用硅胶(日本产，100～160 目和160～200 目)，纯化用Sephadex LH-20凝胶(瑞典Pharmacia公司)；薄层层析板(Merck产，Kieselgel 60 F254，Art. 5715)。显色剂：Dragendorff显色剂。
2 提取与分离
将收获的愈伤组织块(湿重2.77 kg，干重约140 g)首先用冷甲醇4 000 mL浸泡一夜，去糖苷类成分，滤渣强力搅拌后依次用甲醇(4 000 mL×2)、甲醇-乙酸乙酯(1∶1)(4 000 mL×3)、乙酸乙酯(4 000 mL×2)加热回流提取，冷却后过滤，滤液经减压浓缩后得黄棕色油状物，油状物分别加氯仿和水各600 mL进行萃取，分层后，水层再用氯仿萃取3 次，合并氯仿中，减压浓缩至干得约6 g油状物。
将3.5 g提取物溶于10 mL氯仿中，上样于150 g硅胶柱(200 目)，分别用正己烷-乙酸乙酯(50∶1；20∶1；10∶1)、氯仿、氯仿-乙酸乙酯(5∶1)、氯仿-甲醇(20∶1；10∶1；1∶1)和甲醇等梯度洗脱。其中，氯仿-乙酸乙酯(5∶1)洗脱的第8组分和第9～12组分经薄层层析分析发现有生物碱成分存在。氯仿-乙酸乙酯(5∶1)洗脱的第8组分经两次Sephadex LH-20凝胶柱分离得到化合物Ⅰ纯品。氯仿-乙酸乙酯(5∶1)洗脱的第9～12组分经再一次硅胶柱层析，用苯-乙酸乙酯(20∶1；12∶1；10∶1)梯度洗脱，根据薄层层析分析结果，将苯-乙酸乙酯(20∶1)洗脱的第6组分和苯-乙酸乙酯(12∶1)洗脱的第1组分合并，再经1 次Sephadex LH-20凝胶柱层析纯化得到化合物Ⅱ纯品。
3 鉴定
化合物Ⅰ：无色结晶，EI-MS：259(M+)，244(M-CH3)+，230。UV，λmax(MeOH)：218，316，319 (sh)，337 nm。1HNMR(CDCl3) δ：4.03(3H，s，-OCH3)，4.11(3H，s，-OCH3)，4.44(3H，s，-OCH3)，7.05(1H，d，J=3.0 Hz)，7.23(1H，d，J=9.0 Hz)，7.59(1H，d，J=3.0 Hz)，8.02(1H，d，J=9.0 Hz)。分析以上数据，将化合物Ⅰ鉴定为茵芋碱(skimmianine)。
化合物Ⅱ：白色结晶，229(M+)，214(M-CH3)+，200。1HNMR(CDCl3) δ：4.09(3H，s，-OCH3)，4.46(3H，s，-OCH3)，7.06(1H，dd，J=1.0，7.5 Hz)，7.09(1H，d，J=3.0 Hz)，7.36(1H，dd，J=8.5，7.5 Hz)，7.66(1H，d，J=3.0 Hz)，7.86(1H，dd，J=1.0，8.5 Hz)。根据以上数据，并与文献对照[3]，化合物Ⅱ鉴定为γ-崖椒碱(γ-fagarine)。
4 结果与讨论
本文对芸香科植物飞龙掌血的愈伤组织进行了诱导生长和继代培养，对培养7周的组织块的主要成分进行了化学提取与结构鉴定研究，发现两个常见喹啉呋喃类生物碱茵芋碱和γ-崖椒碱。另外，还分离得到若干甾醇类化合物，而未能检测到香豆素类衍生物。这表明愈伤组织的培养物与原植物的主要化学成分是有区别的[1]。但从生物碱成分来讲，至少可以肯定飞龙掌血愈伤组织的培养，可以产生喹啉呋喃类生物碱。能否产生其他类型的生物碱，还需要做进一步的大量实验，以便为利用愈伤组织细胞培养物的生物碱成分作为原植物的化学分类依据奠定基础。
司书毅 男，1961年生，博士，副研究员，国家微生物新药筛选实验室(筹)副主任，主要从 事天然药物化学和微生物药物筛选工作。1982年1月毕业于南京药学院。1989年8月获得中国 协和医科大学生物及微生物药物学专业硕士学位。曾先后参加了亚胺硫霉素的研究、降胆固 醇新药F400的研究及云南土壤微生物资源前期开发等摪恕の鍞攻关项目，并获得过中国 医学科学院科技进步奖一、二等奖各一次。1995年6月至1998年5月曾留学日本，从事心血管 药物的筛选和药用植物化学等工作。
参考文献
1，石井永，小林纯一，石川宗一，等.药学杂志(日)，1991，111：365
2，《全国中草药汇编》编写组编写.全国中草药汇编.上册.北京：人民卫生出版社，1992：70
3，Narasimhan N S， Mali R S. Tetrahedron, 1974,30:4153
(1999-10-08收稿)
参见：首页 > 中医药 > 中药专业 > 中草药汇编 > 中药大典 > 根类 > 飞龙掌血 濠电姷鏁告慨鐑藉极閹间礁纾块柟瀵稿Т缁躲倝鏌﹀Ο渚＆婵炲樊浜濋崑鎰版偣閸ヮ亜鐨烘い锔诲幖閳规垿鎮╃紒妯婚敪濠电偛鐪伴崐婵嬨€佸鑸电劶鐎广儱妫涢崢鍗炩攽閻愭潙鐏ョ€规洦鍓熷鎼佸Χ閸℃劒绨婚梺鍐叉惈閸燁偊宕㈤幘顔界厸閻忕偛澧介埥澶愭煃閽樺妯€鐎规洩绻濋幃娆忣啅椤斾粙鐛庨梻鍌欑閹碱偊藝椤愶箑鐤炬繝濠傚悩濞戙垹绀冩い鏃囧閹芥洖鈹戦悙鏉戠仸閼裤倝鏌＄€ｎ亪鍙勯柣鎿冨亰瀹曞爼濡搁敃鈧惃鎴︽⒑缁嬫鍎愰柟姝屽吹缁骞掗弬鍝勪壕闁挎繂绨肩花浠嬫煕閺冩挾鐣辨い顏勫暣婵″爼宕卞Δ鈧ḿ鎴︽⒑缁嬫鍎愰柟鐟版喘瀵鈽夐姀鈥充汗閻庤娲栧ú銏ゅ焵椤掍礁绗氬ǎ鍥э躬瀹曪絾寰勬繝鍌ゆ綋闂備礁鐤囬～澶愬垂閸喚鏆﹂柛顐ｆ礀閻撴﹢鏌ｉ幇闈涘濞存粍鐟╁铏规嫚閺屻儺鈧绱掗悩鑼х€规洘娲熷畷锟犳倷瀹ュ棛鈽夐柍钘夘樀婵偓闁绘﹢娼ф慨锔戒繆閻愵亜鈧牜鏁幒妞濆洭顢涢悙鏉戔偓鍫曟煥閺冨倻鎽傛繛鍫滅矙閺岋綁骞囬浣叉灆闂佺ǹ瀛╁褰掋€冮妷鈺傚€烽柛娆忣槸閺嬬姴顪冮妶鍐ㄧ仾婵☆偄鍟悾鐑藉Ω閳哄﹥鏅ｉ梺缁樺姍濞佳囧箹缁嬪簱鏀介柣妯虹仛閺嗏晠鏌涚€ｎ剙鈻堟鐐存崌椤㈡棃宕卞Δ鍐摌闂備浇顕栭崹濂告倶閹邦優娲敂閸曨収鍚呴梻浣虹帛閿氶柛姘ｅ亾缂備焦顨呴ˇ闈涱潖濞差亜绠伴幖杈剧悼閻ｇ敻姊洪悷鏉挎Щ妞ゆ垵顦悾鐑芥偨缁嬪潡鍞跺┑鐘焺娴滄繂螞閸愵喖鏋侀柛灞剧矌妞规娊鎮楅敐搴濈盎濠碘€炽偢濮婄粯鎷呴崨濠冨枑闂佺ǹ顑囬崑銈夌嵁閹版澘绠柦妯侯槼閹芥洟姊洪崫鍕偍闁搞劌缍婇悰顕€濮€閵堝棛鍘搁梺鎼炲劗閺呮稑鐡┑鐘殿暯閳ь剝灏欓惌娆撴煛瀹€瀣М濠殿喒鍋撻梺瀹犳〃閼宠埖绂掗埡鍐＝闁稿本姘ㄥ瓭闂佹寧娲︽禍顏堟偘椤旂晫绡€闁搞儯鍔嶅▍銏ゆ⒑缂佹〒鍦焊濞嗘挻鍋柍褜鍓氭穱濠囨倷椤忓嫧鍋撻弽顓炵濡わ絽鍟壕濠氭煟閺傛寧鎲告い鈺冨厴閺岀喖骞嶉纰辨毉闂佹娊鏀遍崹鍧楀蓟濞戙垺鏅滈悹鍥ㄥ絻缁楀矂姊洪懡銈呮瀾闁革絾娼欑叅妞ゅ繐瀚€瑜旈弻娑㈠Ψ椤旀儳甯ュ┑鐐跺亹閸犳牕顫忓ú顏勭闁告瑥顦伴崕鎾绘⒑閻熸澘鏆辨慨姗堝閹广垹顫濋懜纰樻嫽婵炶揪绲介幊娆掋亹閹烘垵鐝樺銈嗗笒閸婂鎯屽▎鎾寸厵闁绘垶锕╁▓鏇㈡煕婵犲倻浠涢柕鍥у瀵剟宕归瑙勫瘱缂備胶鍋撻崕鎶藉Χ閹间礁钃熼柨鐔哄Т缁€鍐煏婵炲灝鍔楅柛瀣尵缁瑩骞愭惔銏㈡婵犵數濮烽弫鍛婃叏椤撱垹绠柛鎰靛枛缁€瀣煕椤垵浜為柡澶婄秺閺岋絾鎯旈姀鈺佹櫛闂佸摜濮甸悧鐘诲箖閵夆晜鍋傞幖杈剧稻濞堟儳鈹戦濮愪粶闁稿鎸搁埞鎴﹀焺閸愵亝鎲欏銈忛檮婵炲﹪寮诲☉銏犵闁哄鍨规禒鍝ョ磽娴ｈ櫣甯涚紒瀣崌閸┾偓妞ゆ帊鑳堕埊鏇炵暆閿濆懏鍋ラ柟顖氭湰缁绘繈宕戦懞銉︻棃闁诡喒鏅犲畷锝嗗緞鐎ｎ亝鐎鹃梻鍌欐祰濡椼劎娆㈤敓鐘查棷闁挎繂顦埀顑跨窔瀵挳濮€閳╁啯鐝曢梻浣藉Г閿氭い锔跨矙閸┾偓妞ゆ帊鑳堕埥澶愭煃鐟欏嫬鐏撮柡浣哥Ч瀹曠喖顢曢敍鍕礋婵犵數濮幏鍐川椤旂晫褰х紓鍌欑贰閸犳鎮烽敂鐐床婵犻潧顑呴悙濠囨煏婵炑冨暙缁犵増绻濋悽闈浶為柛銊у帶閳绘柨鈽夐姀鈩冩珖闂侀潧鐗嗛ˇ顖毿ч弻銉︾厸闁搞儮鏅涢弸鎴︽煕濞嗗繒绠婚柡宀嬬秮閹垽鎮℃惔婵嗘瀳婵犵妲呴崹顏堝磻閹剧粯鈷掑ù锝堝Г閵嗗啰绱掗埀顒佹媴閾忓湱鐓嬮梺鍦檸閸犳宕戦埡鍌滅瘈闂傚牊渚楅崕蹇曠磼閳ь剟宕橀埞澶哥盎濡炪倖鎸鹃崰搴ㄦ倶閿濆鐓欓悗鐢登归崢瀛樻叏婵犲嫮甯涢柟宄版噽缁數鈧綆浜濋悾浼存⒒娴ｅ憡鎲稿┑顔炬暬楠炴垿宕惰閺嗭附绻濋棃娑冲姛闁汇倐鍋撴繝鐢靛仦閸ㄥ吋銇旈幖浣哥柧闁挎繂娲ㄧ壕浠嬫煕鐏炲墽鎳呴柛鏂跨Т閻ｆ繈鏁愰崨顔间淮闂佺硶鏂傞崹钘夘嚕椤曗偓瀹曞ジ鎮㈤崫鍕闂傚倷鑳堕幊鎾活敋椤撱垹纾块柟瀵稿仧閻熻绻涢幋娆忕仾闁绘挻娲熼弻锟犲磼濮樺彉铏庨梺鍝勬４缂嶄線寮婚垾宕囨殕閻庯綆鍓涢惁鍫ユ倵鐟欏嫭绀冮悽顖涘浮閿濈偛鈹戠€ｅ灚鏅ｉ梺缁橈耿濞佳囩嵁閳ь剛绱撻崒姘偓鎼佸磹閻戣姤鍊块柨鏇炲€堕埀顒€鍟村畷銊ヮ潰閵堝懏鍠橀柡灞芥椤撳ジ宕ㄩ姘曞┑锛勫亼閸婃牜鏁幒妤€绐楁慨姗嗗厳缂傛岸鏌熼柇锕€鏋ょ痪鎯у悑閵囧嫰寮崶褌姹楃紓浣哄Т椤兘寮婚妸銉㈡斀闁割偅绻€濡叉劙姊烘潪鎵槮闁哥喐娼欓悾鐑藉箳閹搭厽鍍甸梺鍛婎殘閸嬬偤骞夐姀銈嗏拻濞达綀妫勯崥鐟扳攽閻愨晛浜剧紓鍌氬€搁崐褰掓嚌妤ｅ啫鐓濈€广儱顦伴弲鏌ユ煕閵夈垺娅囬柣鎾愁儔濮婃椽宕滈懠顒€甯ラ梺鍝ュУ閹瑰洭宕洪埀顒併亜閹哄秶顦︾紒妤佸笚閵囧嫰顢曢敐鍥╃杽濡炪們鍨洪敃銏ゅ箖閳哄拋鏁冮柨婵嗗缂嶅矂姊婚崒姘偓椋庢濮橆兗缂氱憸宥囧弲闂侀潧鐗嗛幃鍨洪鍕庘晠鏌嶆潪鎷屽厡闁告棑绠戦—鍐Χ閸℃鐟ㄩ梺绋款儏濡繂顕ｉ妸鈺傚亱闁割偁鍨婚鏇熺節閵忥絾纭炬い鎴濇搐鐓ら悗鐢电《閸嬫挾鎲撮崟顒傦紭闂佹悶鍔忔慨銈嗙┍婵犲洤閱囬柡鍥╁仧閸婄偤姊洪棃娴ㄥ綊宕曢悜妯侯嚤闁哄洢鍨洪悡鐔兼煟閺傛寧鎲搁柣顓炶嫰椤儻顦虫い銊ョ墦瀵偊顢欓崲澶嬫瀹曨亪宕橀鍡忔（婵犵數濮伴崹濂稿春閺嶎厼绀夐柡宥庡幖绾惧鏌ㄥ┑鍡╂Ч闁绘挻娲熼弻鏇熷緞濡櫣浠╁銈傛櫓閸撴瑩鍩ユ径鎰闁荤喐澹嗗В銏㈢磽娴ｄ粙鍝洪悽顖涱殔宀ｈ儻绠涘☉妯溾晝鎲歌箛娑欏仼濠靛倸鎲￠埛鎴犳喐閻楀牆淇俊顐ｅ灥閳规垿鎮欓埡浣峰闂傚倷娴囬鏍窗濡ゅ啫鍨濋柟鎹愵嚙缁犳澘鈹戦悩鎻掓殭缂佸墎鍋涢…璺ㄦ崉閾忓湱浼囧┑顔硷功閸嬫挾鎹㈠┑瀣仺闂傚牊绋愮划璺侯渻閵堝棙澶勯柛妯圭矙楠炲牓濡搁敂鍝勪簼闂佸憡鍔戦崝宥呂ｉ鍕拺闁告繂瀚埢澶愭煕濡亽鍋㈢€规洖缍婂畷鎺楁倷鐎电ǹ甯惧┑鐘垫暩閸嬬喖宕戦幘鏂ユ瀺闁糕剝绋掗悡鏇㈡倵閿濆啫濡煎┑鈥炽偢濡焦寰勯幇顓犲弳濠电娀娼уΛ娆撳闯瑜版帗鐓涢柛鈩冪懃閺嬫垵菐閸パ嶈含妞ゃ垺绋戦～婵嬪础閻愨晛寰嶅┑鐘愁問閸犳牠鏁冮妷銉富濞寸姴顑冮埀顑跨窔瀵挳濮€閳╁啯鐝抽梻浣虹《閸撴繈鎮烽敃鍌ゆ晣濠电姵纰嶉埛鎺懨归敐鍫燁仩閻㈩垱鐩弻鐔哄枈閸楃偘绨介梺鐟扮畭閸ㄥ綊鍩為幋鐘亾閿濆骸澧紒渚婄畵閺岋絾鎯旈婊呅ｉ梺鍝ュУ閻楁粎鍒掓繝姘櫜闁糕剝鐟ч惁鍫熺節閻㈤潧孝闁稿﹥鎮傞、鏃堫敃閿旂晫鍘甸梺鍝勵儛閸嬪嫭鎱ㄩ崒娑欏弿濠电姴鍟妵婵囶殽閻愭潙濮堥柟顖涙閺佹劙宕掑☉杈ㄧ秾闂傚倸鍊风粈渚€骞栭锔藉亱婵犲﹤鐗嗙粈鍫ユ煟閺冨牜妫戦柡鍡畵閺岋綁鎮㈢粙娆炬闂佸壊鍋掓禍顏堝蓟濞戙垹鍗抽柕濞垮劚鐎涳絽鈹戦悙瀛樼稇閻庢凹鍓熼垾鏃堝礃椤斿槈褔鏌涢埄鍐炬畼闁荤喐鍔欏铏圭磼濡椽鍤嬬紓浣哄У閹告悂顢氶敐澶婄缂佹稑顑嗛弲婊堟⒑閸撴彃浜為柛鐘虫崌瀹曘垽鏌嗗鍡忔嫼闂佽崵鍠撴晶妤呭箚閸垻纾煎璺侯儐缂嶆垿鏌ｉ敐鍥ㄦ毈鐎规洖宕埥澶娾枎閹存繂绗氶梺鑽ゅ枑缁秶鍒掗幘宕囨殾婵犲﹤鍠氬ḿ鈺傘亜閹烘埈妲归柛宥囨暬濮婃椽妫冨ù銉ョ墦瀵彃饪伴崼婵堬紱闂佺ǹ鐬奸崑鐐烘偂閵夆晜鐓熼柡鍌涘閹牏鈧稒绻堥弻锝夋偄閸濄儲鍤傜紓浣哄У閹瑰洭鎮伴鈧浠嬵敇閻愭鍟囨俊鐐€栭幐楣冨磻閻斿摜顩锋い鏍ㄧ矌绾捐棄霉閿濆棗绲诲ù婊呭亾缁绘繈濮€閿濆棛銆愰梺鎰佸灡濞叉繈濡甸幇鏉跨闁瑰濯Σ顖炴⒒娴ｅ懙鍦崲濡ゅ懎纾婚柟閭﹀厴閺嬫棃鏌曢崼婵愭Ч闁抽攱鍨圭槐鎾存媴鐠愵垳绱扮紓浣哄У閻楃娀寮婚敐澶婄厸濠电姴鍊绘禒鈺呮⒑娴兼瑧鎮奸柛蹇旓耿瀵偊骞樼紒妯轰汗闂佽偐鈷堥崜锕€危娴煎瓨鈷掑ù锝堟娴滃綊鏌嶅畡鎵ⅵ鐎规洘绮岄～婵囷紣濠靛洦娅撻梻浣侯攰閹活亪姊介崟顖氱厱闁硅揪闄勯崑锝夋煕閵夘垳宀涢柛瀣崌閹煎綊顢曢妶鍕寜闂傚倸鍊风粈渚€骞夐敓鐘茶摕闁靛⿵瀵屽▓浠嬫煙闂傚顦﹂柣鎾寸箞閺岀喖骞戦幇闈涙缂備胶濯寸紞渚€寮婚敐澶婄疀妞ゆ挾鍠撶粙鍥ь渻閵堝懎顒㈤柟鍛婃倐閸╃偤骞嬮敂钘変汗闁荤姴娉ч崘褏鐭楅梻鍌欑閹芥粓宕抽妷鈺佸瀭闁割偅娲滃畵渚€鏌涢埄鍐槈缁炬儳鍚嬮幈銊╂晲鎼粹€崇缂傚倸绉撮敃顏堢嵁閸愵喖鐓涢柛娑卞幘椤斿矂姊洪崷顓炲妺缂佽鍊规穱濠囨煥鐎ｎ剛鐦堥梺姹囧灲濞佳嗏叴闂備胶枪椤戝棝骞戦崶顒€钃熼柣鏂跨殱閺嬫棃鏌涢…鎴濇灍闁诲繑鎸剧槐鎺撱偅閸愵亞鏆紓浣哄У閻楃姴顕ｆ繝姘亜閻炴稈鈧厖澹曢梺姹囧灮濞呫儵鎮烽悧鍫熺槑闂備浇宕甸崰鎰垝鎼淬垺娅犳俊銈呮噺閸嬪倿鏌ㄩ悢鍝勑㈤柦鍐枑缁绘盯骞嬪▎蹇曚患缂備胶濮垫繛濠囧蓟閿熺姴纾兼慨妯块哺閻ㄦ垿姊洪崫鍕靛剰闁瑰啿閰ｉ崺鐐哄箣閿旇棄鈧兘鏌涘▎蹇ｆЦ婵炲拑缍佸缁樻媴缁嬭法鐩庣紓浣藉皺閸嬫挾绮氭潏銊х瘈闁搞儜鍜佸晪婵＄偑鍊栧Λ浣规叏閵堝應鏋嶉柕蹇嬪€栭埛鎴︽偣閹帒濡兼繛鍛姍閺岀喖宕欓妶鍡楊伓