黄芩素的化学发光测定
作者：方冶 张鲁勉 何小英 梁友竹
单位：汕头大学医学院化学教研室 515031
关键词：多羟基黄酮；黄芩素；化学发光法
中草药000811摘 要 以黄芩素进行试验，建立了黄芩素的化学发光测定法，并应用于市售制剂中有效成分的检测，RSD=0.65% (n=10)，回收率为 (98±3)%(n=6)；本法可用于其它多羟基黄酮化合物的检测，检测结果从本质上反映多羟基黄酮化合物生物活性和药理作用的强弱。
Detection of Scutellarein Derivative by Chemiluminescent Analysis
Fang Ye
(Department of Chemistry, Medical College of Shantou University Shantou 515031)
, http://www.100md.com
Zhang Lumian
(Department of Chemistry, Medical College of Shantou University Shantou 515031)
He Xiaoying
(Department of Chemistry, Medical College of Shantou University Shantou 515031)
Liang Youzhu
(Department of Chemistry, Medical College of Shantou University Shantou 515031)
Abstract A chemiluminescent analysis (CLA) for the detection of scutellarein derivatives was established. Results showed that the RSD=0.65% (n=10), the average rate of recovery was (98 ± 3)% (n=6). The CLA method may be applicable to other poly-hydroxy flavones, and to predict their biological and pharmacological potentials.
, 百拇医药
Key words poly-hydroxy flavone scutellarein chemiluminescent analysis
多羟基黄酮化合物是植物界分布最广泛的黄酮类化合物，具有多种生物活性和药理作用；如槲皮素是抗癌成分之一[1]。传统上多羟基黄酮化合物用比色法检测[2]；该法基于酚羟基的颜色反应，特异性差，干扰因素多，且多羟基黄酮化合物的多种生物活性和药理作用与其抗自由基氧化的作用密切相关[1，3，4]，比色法根本无法揭示这一作用的强弱。化学发光法因其灵敏度高，准确性好，重现性强，操作简便，近年来已在生物样品的检测中有较广泛的应用。本文以黄芩素进行试验，提出多羟基黄酮化合物的化学发光检测法，测定样品抗自由基氧化作用的能力，测定结果在本质上反映样品的生物活性和药理作用的强弱。
1 材料和方法
1.1 仪器和试剂： HF-1 化学发光仪；黄嘌呤氧化酶 (XOD，东风公司，1.938 U/mL,0.313 U/mL)，超氧化物歧化酶 (SOD，华东理工大学，6 000 U/mg),次黄嘌呤 (HX，Fluka),鲁米诺 (Luminol,Merck-Schuchardt),黄芩素 (SD，从市售黄芩中提取，重结晶法纯化后为黄褐色粉末)，其它试剂均为 AR 级。
, 百拇医药
XOD、HX 和 Luminol 分别用 pH 10.2 含 0.1 mmol/L EDTA 的 0.05 mol/L 碳酸盐缓冲液稀释；SOD 和 SD 分别以 pH 7.8 含 0.1 mmol/L EDTA 的 0.05 mol/L 磷酸盐缓冲液稀释。
1.2 实验方法：采用 XOD-HX-Luminol 化学发光体系[5]，用化学发光法进行检测。步骤：于 HF-1 化学发光仪的发光腔内，先加入 0.1 mL XOD (0.1 g/L),再加入 HX 与 Luminon1 的混合液 (10-4 mol/L,9∶1 混合) 1.90 mL 启动反应，最终反应体积为 2.00 mL。测量发光峰值进行计算。
2 结果与讨论
2.1 SD 活力的测定：SOD 是生物体内清除
的特异酶， 其它清除剂的活力，可折算为 SOD 的活力单位来表示。
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2.1.1 SOD 的活力测定：先加入一定的 SOD 溶液 (0.01 g/L)，按1.2 所述步骤和用量加入各试剂，测量发光峰值 (H，3 次取平均)，以不加 SOD 时的发光值为 100% 发光值计算 SOD 的抑制率：I%=[H(100%)-H(样品)]H(100%)。结果见图1。从图1得出 C50 为 21.5 μg/L。
图1 SOD对超氧阴离子自由基的抑制曲线
2.1.2 SD 活力的测定：以一定量的 SD 溶液 (0.1 g/L) 代替上述的 SOD，按同法测定发光峰值并计算相应的抑制率。结果见图2。从图2得出 C50为 0.31 mg/L。9
图2 黄芩素诱导体对超氧阴离子自由基抑制曲线
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2.1.3 SD 活力的表示：根据上述测得的 C50，SOD、C50，SD和 SOD 对照品的活力，可算出相应实验条件下，被测样品用 SOD 活力单位表示的活力大小。本文实验条件下C50，SOD=0.0215 mg/L, C50，SD=0.31 mg/L,已知 SOD 对照品的活力为 6 000 U/mg，因此，SD 的活力为：(C50，SOD/C50，SD)×6 000＝416 U/mg(U为 SOD 活力单位)。
以其它多羟基黄酮化合物的溶液代替 SD 溶液进行测定，即可得出该化合物以 SOD 活力单位表示的活力大小。
2.2 化学发光法测定 SD 的动力学公式：用HX-XOD-Luminol 化学发光体系测定 SOD 的动力学公式为[6]：V/VL＝1+k(SOD)，其中 VL 为 与 Luminol 反应的速度，V 为 的总反应速度，k 为比例常数，V/VL=100/(100-抑制百分数)。该式表明，V/VL与 SOD线性相关。由于 SD 与 SOD 有类似的清除 的性能，故推断以 HX-XOD-Luminol 化学发光体系测定 SD 的动力学公式为：V/VL＝1+k(SD)，即V/VL与SD成线性关系。实验结果 (表1，图3)证实了上述推断。
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表1 V/VL 与黄芩素的浓度 (SD) 的关系 SD(mg/L)
抑制率(%)
(V/VL)
0
0
1
0.125
27.5
1.40
0.25
42.7
1.40
, 百拇医药
0.50
66.3
2.97
0.75
78.0
4.20
图3 V/VL和SD浓度的关系
2.3 化学发光法测定样品中 SD 的浓度：依 2.1 中所述方法，测得不同浓度 SD 对发光的抑制百分数，按公式V/VL=100/(100-抑制百分数)算出V/VL，以V/VL对SD作图，可得线性关系的工作曲线，测出样品的V/VL即可从工作曲线得出样品中有效成分的浓度。
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我们用上述方法对市售含 SD 的制剂中的有效成分进行了测定，结果如表2所示。其它试样中有效成分的浓度可参照上述方法进行测定。
表2 市售制剂中 SD 的测定 制剂名称
厂家名称
SD 含量
(mg/mL,n=3)
茵栀黄注射注
山西太行制药
18.15±0.12
茵栀黄注射注
江苏武进制药厂
16.32±0.11
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2.4 可靠性和回收率试验：本法所测得的数据稳定，批内 RSD=0.65%(n=10)，批间 RSD 也只有 2.1% (n=8)，测验的回收率为 (98±3)% (n=6)。
3 小结
综上所述，化学发光法不仅可对多羟基黄酮化合物进行抗自由基氧化的活力测定，而且能够进行对样品中有效成分的浓度测定。用本法对多羟基黄酮的检测，不仅秉承了化学发光法快、准、灵的优点，而且提供了能在本质上对多羟基黄酮化合物生物活性和药理作用的强弱进行评价的数据。
致谢：在试验过程中得到沈文英教授的大力支持。
参考文献
1，刘诗平，陈尚猛，朱卫东.中草药，1991，22(4)：182
2，中国医科院药物研究所编.中草药有效成分的研究.北京：人民卫生出版社，1972：330
3，丁维功编.中国医学化学进展.上海：百家出版社，1996：72
4，方 冶.中草药，1999，30(7)：526
5，李益新，方允中.生物化学与生物物理进展，1983(2)：59
6，方允中，刘智峰，李益新，等.科学通报，1986，31(5)：356
(2000-01-18收稿), 百拇医药
单位：汕头大学医学院化学教研室 515031
关键词：多羟基黄酮；黄芩素；化学发光法
中草药000811摘 要 以黄芩素进行试验，建立了黄芩素的化学发光测定法，并应用于市售制剂中有效成分的检测，RSD=0.65% (n=10)，回收率为 (98±3)%(n=6)；本法可用于其它多羟基黄酮化合物的检测，检测结果从本质上反映多羟基黄酮化合物生物活性和药理作用的强弱。
Detection of Scutellarein Derivative by Chemiluminescent Analysis
Fang Ye
(Department of Chemistry, Medical College of Shantou University Shantou 515031)
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Zhang Lumian
(Department of Chemistry, Medical College of Shantou University Shantou 515031)
He Xiaoying
(Department of Chemistry, Medical College of Shantou University Shantou 515031)
Liang Youzhu
(Department of Chemistry, Medical College of Shantou University Shantou 515031)
Abstract A chemiluminescent analysis (CLA) for the detection of scutellarein derivatives was established. Results showed that the RSD=0.65% (n=10), the average rate of recovery was (98 ± 3)% (n=6). The CLA method may be applicable to other poly-hydroxy flavones, and to predict their biological and pharmacological potentials.
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Key words poly-hydroxy flavone scutellarein chemiluminescent analysis
多羟基黄酮化合物是植物界分布最广泛的黄酮类化合物，具有多种生物活性和药理作用；如槲皮素是抗癌成分之一[1]。传统上多羟基黄酮化合物用比色法检测[2]；该法基于酚羟基的颜色反应，特异性差，干扰因素多，且多羟基黄酮化合物的多种生物活性和药理作用与其抗自由基氧化的作用密切相关[1，3，4]，比色法根本无法揭示这一作用的强弱。化学发光法因其灵敏度高，准确性好，重现性强，操作简便，近年来已在生物样品的检测中有较广泛的应用。本文以黄芩素进行试验，提出多羟基黄酮化合物的化学发光检测法，测定样品抗自由基氧化作用的能力，测定结果在本质上反映样品的生物活性和药理作用的强弱。
1 材料和方法
1.1 仪器和试剂： HF-1 化学发光仪；黄嘌呤氧化酶 (XOD，东风公司，1.938 U/mL,0.313 U/mL)，超氧化物歧化酶 (SOD，华东理工大学，6 000 U/mg),次黄嘌呤 (HX，Fluka),鲁米诺 (Luminol,Merck-Schuchardt),黄芩素 (SD，从市售黄芩中提取，重结晶法纯化后为黄褐色粉末)，其它试剂均为 AR 级。
, 百拇医药
XOD、HX 和 Luminol 分别用 pH 10.2 含 0.1 mmol/L EDTA 的 0.05 mol/L 碳酸盐缓冲液稀释；SOD 和 SD 分别以 pH 7.8 含 0.1 mmol/L EDTA 的 0.05 mol/L 磷酸盐缓冲液稀释。
1.2 实验方法：采用 XOD-HX-Luminol 化学发光体系[5]，用化学发光法进行检测。步骤：于 HF-1 化学发光仪的发光腔内，先加入 0.1 mL XOD (0.1 g/L),再加入 HX 与 Luminon1 的混合液 (10-4 mol/L,9∶1 混合) 1.90 mL 启动反应，最终反应体积为 2.00 mL。测量发光峰值进行计算。
2 结果与讨论
2.1 SD 活力的测定：SOD 是生物体内清除
的特异酶， 其它清除剂的活力，可折算为 SOD 的活力单位来表示。, 百拇医药
2.1.1 SOD 的活力测定：先加入一定的 SOD 溶液 (0.01 g/L)，按1.2 所述步骤和用量加入各试剂，测量发光峰值 (H，3 次取平均)，以不加 SOD 时的发光值为 100% 发光值计算 SOD 的抑制率：I%=[H(100%)-H(样品)]H(100%)。结果见图1。从图1得出 C50 为 21.5 μg/L。
图1 SOD对超氧阴离子自由基的抑制曲线2.1.2 SD 活力的测定：以一定量的 SD 溶液 (0.1 g/L) 代替上述的 SOD，按同法测定发光峰值并计算相应的抑制率。结果见图2。从图2得出 C50为 0.31 mg/L。9
图2 黄芩素诱导体对超氧阴离子自由基抑制曲线
, http://www.100md.com
2.1.3 SD 活力的表示：根据上述测得的 C50，SOD、C50，SD和 SOD 对照品的活力，可算出相应实验条件下，被测样品用 SOD 活力单位表示的活力大小。本文实验条件下C50，SOD=0.0215 mg/L, C50，SD=0.31 mg/L,已知 SOD 对照品的活力为 6 000 U/mg，因此，SD 的活力为：(C50，SOD/C50，SD)×6 000＝416 U/mg(U为 SOD 活力单位)。
以其它多羟基黄酮化合物的溶液代替 SD 溶液进行测定，即可得出该化合物以 SOD 活力单位表示的活力大小。
2.2 化学发光法测定 SD 的动力学公式：用HX-XOD-Luminol 化学发光体系测定 SOD 的动力学公式为[6]：V/VL＝1+k(SOD)，其中 VL 为
与 Luminol 反应的速度，V 为 的总反应速度，k 为比例常数，V/VL=100/(100-抑制百分数)。该式表明，V/VL与 SOD线性相关。由于 SD 与 SOD 有类似的清除 的性能，故推断以 HX-XOD-Luminol 化学发光体系测定 SD 的动力学公式为：V/VL＝1+k(SD)，即V/VL与SD成线性关系。实验结果 (表1，图3)证实了上述推断。, http://www.100md.com
表1 V/VL 与黄芩素的浓度 (SD) 的关系 SD(mg/L)
抑制率(%)
(V/VL)
0
0
1
0.125
27.5
1.40
0.25
42.7
1.40
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0.50
66.3
2.97
0.75
78.0
4.20
图3 V/VL和SD浓度的关系
2.3 化学发光法测定样品中 SD 的浓度：依 2.1 中所述方法，测得不同浓度 SD 对发光的抑制百分数，按公式V/VL=100/(100-抑制百分数)算出V/VL，以V/VL对SD作图，可得线性关系的工作曲线，测出样品的V/VL即可从工作曲线得出样品中有效成分的浓度。
, http://www.100md.com
我们用上述方法对市售含 SD 的制剂中的有效成分进行了测定，结果如表2所示。其它试样中有效成分的浓度可参照上述方法进行测定。
表2 市售制剂中 SD 的测定 制剂名称
厂家名称
SD 含量
(mg/mL,n=3)
茵栀黄注射注
山西太行制药
18.15±0.12
茵栀黄注射注
江苏武进制药厂
16.32±0.11
, http://www.100md.com
2.4 可靠性和回收率试验：本法所测得的数据稳定，批内 RSD=0.65%(n=10)，批间 RSD 也只有 2.1% (n=8)，测验的回收率为 (98±3)% (n=6)。
3 小结
综上所述，化学发光法不仅可对多羟基黄酮化合物进行抗自由基氧化的活力测定，而且能够进行对样品中有效成分的浓度测定。用本法对多羟基黄酮的检测，不仅秉承了化学发光法快、准、灵的优点，而且提供了能在本质上对多羟基黄酮化合物生物活性和药理作用的强弱进行评价的数据。
致谢：在试验过程中得到沈文英教授的大力支持。
参考文献
1，刘诗平，陈尚猛，朱卫东.中草药，1991，22(4)：182
2，中国医科院药物研究所编.中草药有效成分的研究.北京：人民卫生出版社，1972：330
3，丁维功编.中国医学化学进展.上海：百家出版社，1996：72
4，方 冶.中草药，1999，30(7)：526
5，李益新，方允中.生物化学与生物物理进展，1983(2)：59
6，方允中，刘智峰，李益新，等.科学通报，1986，31(5)：356
(2000-01-18收稿), 百拇医药
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