6－羟基多巴胺和MK－801对脊髓水肿抑制作用的实验研究
作者：陈百成 张为 张静 陈燕 葛丽
单位：石家庄，河北医科大学第三医院骨科 050051
关键词：脊髓损伤；水肿；去甲肾上腺素；兴奋性氨基酸药
中华骨科杂志000810
【摘要】目的研究与探讨去甲肾上腺素(NE)和兴奋性氨基酸(EAA)在脊髓遭受急性损伤后 发生急性水肿时的作用及其机制。方法采用静力加载技术于Wistar大鼠T13椎体水平造成急 性脊髓损伤。对照组大鼠不予治疗，6-羟基多巴胺(6-OHDA)组和MK-801(5-甲基二氢二 苯并环庚烯亚胺马来酸)组大鼠分别采用蛛网膜下腔注射6-OHDA和尾静脉注射MK-801的方 法治疗。应用神经学功能评分，组织含水量测定及光镜、电镜观察来直观地比较三组间水肿 程度的差别。结果(1)6-OHDA组，伤后对水肿的有效抑制达24h，伤后12h即可观察到明显的 神经功能恢复，血管源性水肿表现最轻。(2)MK-801组，伤后24h才表现出对水肿的抑制， 神经功能在伤后24h有明显的恢复，细胞毒性水肿表现最轻。结论(1)NE及EAA在脊髓水肿的 发生、发展中起重要作用。(2)NE主要引起伤后早期发生的血管源性水肿。EAA则影响稍后发 生的细胞毒性水肿。
, 百拇医药
An experimental study of the suppressive effect of 6- OHDA and MK- 801 in spinal cord edema
CHEN Baicheng ZHANG Wei ZHANG Jing et al
( Department of Orthopaedics, The Thrid Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050051, China)
【 Abstract】 Objective To study the role and their possible mechanism of norepinephrine (NE) and excitatory amino acids(EAA) in the formation and development of edema after acute spinal cord injury (ASCI) in rats. Methods Spinal cord injury at the level of thirteen thoracic segment was created by the static load technique according to Black et al. The control group received no treatment. 6- OHDA was injected into the subarachnoid space in one group, and MK- 801 was
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administered intravenously in another group. The extent of edema was compared in the three groups by means of neurologic scoring, water content measurement, light and electron microscopy. Results 1) In 6- OHDA treated rats, significant recovery
of motor paralysis was found 12 hours after injury. Edema of the spinal cord was significantly suppressed for up to 24 hours after injury. The degree of vasogenic edema was lightest. 2)In MK- 801 treated rats, there was no significant suppression of the edema until 24 hours after injury, and a significant recovery was found. The degree of cytotoxic edema was lightest. Conclusion 1)NE and EAA play important roles in the formation and development of edema after ASCI. 2) NE is primarily
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involved in the formation of vasogenic edema, which develop in the early stages after injury. Whereas, EAA affect the formation of cytotoxic edema, which develop at a relatively later stage.
【 Key words】 Spinal cord injuries; Edema;Norepinephrine; Excitatory amino acid agents
脊髓遭受急性损伤(acutespinalcordinjury，ASCI)后，受损的神经组织将出现出血、水肿，神经元变性、坏死等一系列病理过程，这个过程就是所谓继发性脊髓损伤(secondaryspinalcordinjury,SSCI)。脊髓水肿是引发和加重脊髓组织病理改变的重要因素。髓内微循环的改变[1]、组织内的阳离子[2]、脂质水解所致的膜损伤[3]都是引起脊髓水肿的重要原因，但其确切机制迄今仍不明了。去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)在损伤后立即引起微血管的收缩、内皮损伤、动脉通透性的增加，被认为是参与水肿形成的重要因素。近年来许多研究发现，兴奋性氨基酸(excitatoryaminoacids,EAA)与细胞水肿有关[4]。因此，我们使用6-羟基多巴胺(6-OHDA)和MK-801抑制NE和EAA的作用，探讨研究这两种因子在脊髓水肿发生中的作用。
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材料与方法
一、动物的分组与给药方法
Wistar大鼠160只，体重300～350g,平均330g，雌雄不限，随机分为3组。6-OHDA组55只，MK-801组50只，对照组55只。各组采用Black静力加载技术[5]造成脊髓损伤。6-OHDA组经T13椎体切除术后，由蛛网膜下腔注射2.5×10-4kg/L6-OHDA(美国Sigma)20μl,给药后48h制成脊髓损伤模型(此时药物的效能最大)。MK-801组动物致伤后，立即经尾静脉注入5×10-5kg/LMK-801氢化苹果酸酯(美国Sigma)5mg/kg体重。对照组无特殊处理。
二、动物模型的制作
0.02kg/L戊巴比妥钠(30mg/kg体重)腹腔注射麻醉。以T13椎体为中心做后正中切口，切除T13椎板及T12部分椎板，暴露硬膜约3mm×5mm大小。在硬膜中心2mm×3mm面积上加载60g压力持续1min。造成可恢复性脊髓损伤。
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三、观察指标
1.髓内单胺类递质含量的测定6-OHDA组及对照组动物各5只，蛛网膜下腔给药后48h用断头法处死。切取T13脊髓节段，称重后加入0.4molHClO4制成匀浆。加入0.05mol/LEDTA·2Na50ml，于4℃、1600r/min条件下离心20min，过滤后取上清液20μl于高效液相色谱仪上测定NE、多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)的含量。
2.神经功能评分
每组动物各取10只，于伤后2周内，对各组动物的双下肢运动功能按照Tarlov-Klinger神经功能评分系统进行评定，记录双下肢评分的均值。
3.脊髓组织含水量的测定
每组动物各取20只，分别于伤后1、6、24、48h断头、放血处死，每时段5只动物。切取T13脊髓节段，在高灵敏度分析天平(METTLERAE260)上称重，然后置于100℃烤箱中烘干，再次称重，计算含水量。含水量=(湿重-干重)/湿重×100%。
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4.光镜、电镜标本的制作
每组动物各取10只，于伤后48h活体切取损伤区中心的脊髓组织，立即置于体积分数为10%的福尔马林液中固定，石蜡包埋，HE染色后光镜观察。每组动物各取10只，伤后48h于损伤中心切取电镜标本，立即用体积分数为3%的戊二醛固定，梯度丙酮脱水，环氧树脂618包埋，超薄切片，醋酸铀柠檬酸铅染色后用透射电镜观察。
四、统计学分析
采用非配对资料的t检验比较单胺类递质含量的变化。采用成组设计的多个样本的秩和检验(Kruskal-Wallis法)和多个样本两两比较的秩和检验(Nemenyi法)进行运动功能的比较。脊髓含水量的差异采用单因素方差分析(ANOVA)和最小显著差法(FisherPLSD)进行检验。
结果
一、脊髓内单胺类递质的含量变化
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给予6-OHDA后48h,脊髓组织内NE的含量明显下降，由217.450ng/g降为29.368ng/g,差异有非常显著性意义(P<0.01)；而DA和5-HT含量变化不显著，差异无显著性意义(表1)。
表1 用药前后脊髓组织内NE、DA、5-HT浓度的变化(
±s，ng/g)
检测项目
用药前
用药后24h
NE
217.450±4.3
29.368±2.6*
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DA
37.750±2.1
36.316±1.8
5-HT
307.108±9.7
303.382±13.0
*P<0.01
二、运动功能的恢复
在此实验条件下，损伤所造成的肢体瘫痪可逐渐恢复，对照组这个过程可持续1～2周时间。在6-OHDA组，伤后6h运动功能已明显恢复(P<0.01)，伤后12h、24h、2d、3d表现为连续而显著的恢复过程(P<0.01)。MK-801治疗组伤后早期的恢复情况较对照组差异无显著性意义(P>0.05)；伤后24h开始出现明显的功能恢复(P<0.05)；伤后3d，两治疗组的双下肢运动功能接近正常水平(表2)。
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三、脊髓含水量的测定
伤后1h，各组动物脊髓受伤节段的含水量均有增加。6-OHDA组受伤节段含水量在伤后1～24h明显低于对照组，差异有非常显著性意义(P<0.01)；伤后48h含水量明显增加，与对照组相比差异无显著性意义(P>0.05)。而MK-801组伤后1～6h含水量较对照组变化不大，伤后24、48h含水量低于对照组，差异有非常显著性意义(P<0.01)(表3)。
表2 三组动物损伤后不同时间运动功能的恢复情况(Tarlov评分，±s)
分组
6h
12h
24h
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2d
3d
5d
7d
14d
6-OHDA组 1.90±0.47**
2.50±0.58**
2.90±0.52**
3.60±0.32**
4.00±0.00**
4.00±0.00**
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4.00±0.00**
4.00±0.00
MK-801组 1.00±0.24
1.40±0.39
2.30±0.54*
3.10±0.44**
3.90±0.20**
3.95±0.15**
4.00±0.00**
4.00±0.00
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对照组 0.80±0.48
1.00±0.67
1.20±0.63
1.60±0.39
2.20±0.42
2.60±0.50
3.40±0.24
3.95±0.14
*与对照组比较，P<0.05，*与对照组比较，P<0.01
表3三组动物损伤后不同时间脊髓组织含水量的比较(±s，%)
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分组 1h 6h 24h 48h 6-OHDA组 67.014±1.9* 68.715±1.8* 70.536±2.1* 70.778±1.5 MK-801组 69.599±1.5 70.195±1.3 70.768±1.4* 72.792±1.7* 对照组 70.736±1.1 71.435±1.4 73.375±1.9 73.610±1.6
*与对照组相比P<0.01
四、形态学观察结果
伤后48h的光镜观察显示三组动物脊髓损伤中心横断面均可见小片状出血，白质结构疏松，6-OHDA组表现最轻，对照组出血情况严重(图1～3)。6-OHDA组和对照组的神经细胞发生了不同程度的肿胀，肿胀的神经细胞着色浅淡，细胞外间隙减小或消失。MK-801组神经细胞形态基本正常。
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伤后48h的电镜观察示对照组可见毛细血管内皮肿胀，吞饮小泡增多，线粒体肿胀、空化，细胞间连接分离，内皮细胞与基底膜分离等血管源性水肿的表现(图4)。神经纤维内线粒体肿胀呈球形，雪旺细胞严重变性(图5)。在MK-801组，亦可见内皮损伤肿胀现象(图6)，但其神经纤维及雪旺细胞形态基本正常，仅见髓鞘板层紊乱(图7)。在6-OHDA组，毛细血管内皮结构尚完整(图8)，但其神经纤维及雪旺细胞仍可见明显的损伤和变性(图9)。
讨论
1972年，Osterholm等[6]提出继发性脊髓损伤的NE学说，认为损伤后NE在损伤区的过度释放与SSCI直接相关。但组织内NE的浓度对外界的刺激极为敏感，实验动物麻醉的深浅，致伤能量的大小，髓内NE合成的生理节律的变化，血压、血流、温度、组织内氧浓度的不同均会对髓内NE浓度造成影响[7]。由于没有一种实验模型可以完全消除这些因素的影响，所以目前学术界对NE在SSCI中的具体作用仍存有争议。6-OHDA是一种近年来应用较多的选择性酚胺能神经元破坏剂，它可被儿茶酚胺能神经元摄取，在神经元内代谢产生有毒的酚类、自由基之类的小分子，从而选择性地破坏儿茶酚胺能神经元，有效地降低组织内的NE水平，破坏其再合成NE的能力，而对其他神经递质的影响较小。本研究于动物蛛网膜下腔注射6-OHDA，48h后髓内的NE浓度由原来的217.450ng/g降到29.368ng/g，而DA和5-HT的浓度无明显改变(表1)。这样，通过髓内应用6-OHDA抑制NE的作用，避免测定组织中NE浓度的繁琐与不准确，可直接观察内源性NE在SSCI中的作用。
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本研究在脊髓损伤前48h经蛛网膜下腔注射6-OHDA，伤后获得满意的功能恢复。在本实验条件下，对照组全部动物的下肢功能在伤后2周内基本恢复，6-OHDA治疗组的恢复速度明显快于对照组。伤后6h，双下肢的Tarlov评分高于对照组，差异有非常显著性意义(P<0.01)；伤后12h～3d表现为一个连续而显著的恢复过程(表2)。说明6-OHDA组动物的继发性损伤程度较轻。与此相对应，受伤节段的组织含水量在伤后1h便明显低于对照组(P<0.01)，虽然随着时间的发展，含水量有逐步增加的趋势，但增加的速度明显慢于对照组，6-OHDA对水肿的有效抑制达24h(表3)。从形态学上观察，伤后48h，6-OHDA治疗组受伤节段的出血、水肿情况明显轻于对照组(图1，3)。毛细血管内皮结构完整，内皮细胞轻度肿胀，而对照组毛细血管内线粒体肿胀、嵴断裂，细胞间连接分离，毛细血管内皮细胞与基底膜间的血管周围间隙加大。说明损伤后过度释放的NE可以损伤内皮细胞导致血管源性水肿(图4，8)。6-OHDA对神经细胞及神经纤维的损伤无明显保护作用，提示神经功能的损害还与其他机制有关。
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图16-OHDA组伤后48h脊髓横断面，示小片状出血，范围较小，中央导水管完整2.5×4图2MK-801组伤后48h脊髓横断面，示小片状出血，相互融合，中央导水管破裂2.5×4图3对照组伤后48h脊髓横断面，示小片状出血严重，相互融合，中央导水管破裂2.5×4
图4对照组伤后48h，示毛细血管与基底膜分离较广泛，内皮周围间隙加大透射电镜×15000图5对照组伤后48h，神经纤维内的线粒体明显肿胀呈球形，嵴断裂透射电镜×10000图6MK-801组伤后48h，毛细血管与基底膜之间有分离透射电镜×15000图7MK-801组伤后48h，神经纤维结构基本正常，仅髓鞘板层有所紊乱透射电镜×15000图86-OHDA组伤后48h，毛细血管内皮轻度肿胀，结构完整透射电镜×15000图96-OHDA组伤后48h，雪旺细胞和髓鞘组织内神经纤维中的线粒体肿胀,嵴断裂透射电镜×12000
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EAA是一组中枢神经系统的主要兴奋性神经递质。脊髓损伤后，损伤区细胞外EAA积聚，此时EAA可通过(1)Na+、Cl-、H2O过度内流，导致神经细胞急性肿胀。(2)激动EAA受体(EAAsR)，启动电压依赖性钙通道，使Ca2+大量内流。Na+-Ca2+交换减弱，胞内过多的三磷酸肌醇(IP3)使胞内贮存的Ca2+释放增加，而发挥其神经毒性作用。近年来的研究表明，氧自由基、NO、血小板活化因子也参与EAA介导的神经毒性作用。EAAsR在脊髓组织中主要分布于后角及背侧神经根。其中天门冬氨酸受体(NMDAR)与Ca2+通道耦联，与脊髓损伤直接相关。MK-801是NMDAR的竞争性拮抗剂，可作用于NMDAR的b位点，拮抗EAA的作用。
在本次实验中，我们使用MK-801抑制EAA的作用，虽然对伤后早期脊髓水肿的形成没有明显的抑制作用，但在伤后24h，水肿的程度明显减轻，而且可抑制其进行性的发展(表3)。同时MK-801组动物的下肢运动功能在伤后24h恢复明显加快(表2)。在组织学切片上观察，MK-801组伤后早期脊髓的出血、水肿情况并不明显优于对照组(图2，3)，但神经细胞的形态基本正常，未发生明显肿胀。电镜观察发现，对照组伤后48h神经纤维内的线粒体明显肿胀、呈球形、嵴全部断裂(图5)，雪旺细胞严重变性，可见染色质大部分消失，仅剩核仁突出。而此时的MK-801组，神经纤维结构基本正常，仅见髓鞘板层紊乱(图7)，雪旺细胞染色质轻度边集。这说明，MK-801可以有效抑制脊髓损伤后发生的细胞毒性水肿，从而发挥其保护性治疗作用。于明琨等[8]认为NMDAR介导的脑水肿主要为细胞毒性水肿。Yanase等[9]使用MK-801抑制EAA的作用，可以明显减轻脊髓损伤区水肿的程度，而对血流和血管的通透性没有影响。这从另一个侧面证实了我们的观点。
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对比6-OHDA组和MK-801组不难发现，虽然6-OHDA和MK-801都能有效抑制水肿的发生和促进功能的恢复，但起效时间是不同的。在6-OHDA组，伤后早期即可获得明显的功能恢复，而MK-801组，伤后24h恢复的速度才加快，在伤后2～3d表现为明显的恢复过程(表2)。从水肿形成的情况来看，6-OHDA组伤后1h组织含水量明显低于对照组及MK-801组，但随着时间的发展还有进一步加重的趋势；在MK-801组，伤后1～6h含水量较对照组无明显减少，但伤后24～48h含水量基本稳定，未进一步加重，而此时对照组含水量仍在进一步增加(表3)。这提示NE和EAA在脊髓水肿的不同时相中起着不同的作用。
Klatzo[10]将脑水肿分为血管源性水肿和细胞毒性水肿两种，我们的实验证明，这一观点同样适用于脊髓。Tengvar[11]观察到伤后24h神经元对horseradish过氧化物酶的摄取增加了，并由此认为细胞毒性水肿发生于伤后24h。事实上，单独的血管源性水肿和细胞毒性水肿是不存在的。我们在实验中观察到，6-OHDA可以明显减轻血管的损伤，对伤后早期的水肿有明显的抑制作用。而MK-801可以减轻细胞毒性水肿的表现，组织含水量在伤后24h才稳定。因此我们推测，血管源性水肿在伤后早期发生，虽然此时可发生神经细胞的肿胀，但血管源性水肿是此时脊髓水肿的主要形式，随着微循环的改变趋于稳定，细胞毒性水肿逐渐加重，并成为损害神经功能的主要因素。6-OHDA和MK-801正是由于抑制了不同形式的水肿而表现为疗效上的时间差异。
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虽然NE与EAA在脊髓水肿发生过程中的确切机制还有待于进一步探讨，但通过实验研究可以证明：(1)NE、EAA在脊髓水肿的发生、发展中起着重要作用，拮抗它们的作用可以有效抑制水肿，从而达到治疗SSCI的目的。(2)NE、EAA在水肿发生中的作用机制是不同的。NE主要影响伤后早期的血管源性水肿，EAA则影响稍后发生的细胞毒性水肿。针对多种损伤因子的全面治疗是目前临床治疗SSCI的基本观点。既然不同的损伤因子在损伤后的不同时相内有不同的作用，正确合理地选择药物来防治脊髓损伤后的病理破坏，值得进一步探讨。
参考文献
1，Tator CH, Fehlings MG. Review of the secondary injury theory of acute spinal cord trauma with emphasis on vascular mechanism. J Neurosurg, 1991, 75:15- 26.
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2，Young W, Kore I. Potassium and calcium changes in injured spinal cord. Brain Res, 1986, 365:42- 53.
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4，Nag S. Vascular changes in the spinal cord in N- methyl- D- aspartate- induced excitotoxity:morphological and permeability studies. Acta Neuropathol(Berl), 1992, 84:471- 477.
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5，Black P, Markowitz RS, Cooper V, et al. Models of spinal cord injury:static load technique. Neurosurgery, 1986, 19:752-762. Osterholm JL, Mathews GJ. Altered norepinephrine metabolism following experimental spinal cord injury:relationship to
hemorrhagic necrosis and post wounding neurological deficits. J Neurosurg， 1972,36:386- 394.
6，Hedeman LS, Shellenberger MK, Gordon JH. Studies in experimental spinal cord trauma:alterations in catecholamine levels. JNeurosurg， 1974, 40:37- 43.
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7，明琨，朱诚，张光霁.N-甲基-D-天门冬氨酸受体拮抗剂对猫创伤性脑水肿的影响. 中华神经外科杂志,1994,10：79-82.
8，Yanase M, Sakou T, Fukuda T. Role of N- methyl- D- aspartate receptor in acute spinal cord injury. J Neurosurg,1995, 83:884- 888.
9，Klatzo I. Presidental address. Neuropathological aspects of brain edema. J Neuropathol Exp Neurol, 1967, 26:1- 14.
10，Tengvar C. Extensive intraneuronal spread of horseradish peroxidase from a focus of vasogenic edema into remote areas of central nervous system:observations on mouse central nervous system subjected to cortical cold injury. Acta Neuropathol(Berl), 1986, 71:177- 189.
(收稿日期:2000-02-02), 百拇医药
单位：石家庄，河北医科大学第三医院骨科 050051
关键词：脊髓损伤；水肿；去甲肾上腺素；兴奋性氨基酸药
中华骨科杂志000810
【摘要】目的研究与探讨去甲肾上腺素(NE)和兴奋性氨基酸(EAA)在脊髓遭受急性损伤后 发生急性水肿时的作用及其机制。方法采用静力加载技术于Wistar大鼠T13椎体水平造成急 性脊髓损伤。对照组大鼠不予治疗，6-羟基多巴胺(6-OHDA)组和MK-801(5-甲基二氢二 苯并环庚烯亚胺马来酸)组大鼠分别采用蛛网膜下腔注射6-OHDA和尾静脉注射MK-801的方 法治疗。应用神经学功能评分，组织含水量测定及光镜、电镜观察来直观地比较三组间水肿 程度的差别。结果(1)6-OHDA组，伤后对水肿的有效抑制达24h，伤后12h即可观察到明显的 神经功能恢复，血管源性水肿表现最轻。(2)MK-801组，伤后24h才表现出对水肿的抑制， 神经功能在伤后24h有明显的恢复，细胞毒性水肿表现最轻。结论(1)NE及EAA在脊髓水肿的 发生、发展中起重要作用。(2)NE主要引起伤后早期发生的血管源性水肿。EAA则影响稍后发 生的细胞毒性水肿。
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CHEN Baicheng ZHANG Wei ZHANG Jing et al
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【 Abstract】 Objective To study the role and their possible mechanism of norepinephrine (NE) and excitatory amino acids(EAA) in the formation and development of edema after acute spinal cord injury (ASCI) in rats. Methods Spinal cord injury at the level of thirteen thoracic segment was created by the static load technique according to Black et al. The control group received no treatment. 6- OHDA was injected into the subarachnoid space in one group, and MK- 801 was
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administered intravenously in another group. The extent of edema was compared in the three groups by means of neurologic scoring, water content measurement, light and electron microscopy. Results 1) In 6- OHDA treated rats, significant recovery
of motor paralysis was found 12 hours after injury. Edema of the spinal cord was significantly suppressed for up to 24 hours after injury. The degree of vasogenic edema was lightest. 2)In MK- 801 treated rats, there was no significant suppression of the edema until 24 hours after injury, and a significant recovery was found. The degree of cytotoxic edema was lightest. Conclusion 1)NE and EAA play important roles in the formation and development of edema after ASCI. 2) NE is primarily
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involved in the formation of vasogenic edema, which develop in the early stages after injury. Whereas, EAA affect the formation of cytotoxic edema, which develop at a relatively later stage.
【 Key words】 Spinal cord injuries; Edema;Norepinephrine; Excitatory amino acid agents
脊髓遭受急性损伤(acutespinalcordinjury，ASCI)后，受损的神经组织将出现出血、水肿，神经元变性、坏死等一系列病理过程，这个过程就是所谓继发性脊髓损伤(secondaryspinalcordinjury,SSCI)。脊髓水肿是引发和加重脊髓组织病理改变的重要因素。髓内微循环的改变[1]、组织内的阳离子[2]、脂质水解所致的膜损伤[3]都是引起脊髓水肿的重要原因，但其确切机制迄今仍不明了。去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)在损伤后立即引起微血管的收缩、内皮损伤、动脉通透性的增加，被认为是参与水肿形成的重要因素。近年来许多研究发现，兴奋性氨基酸(excitatoryaminoacids,EAA)与细胞水肿有关[4]。因此，我们使用6-羟基多巴胺(6-OHDA)和MK-801抑制NE和EAA的作用，探讨研究这两种因子在脊髓水肿发生中的作用。
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材料与方法
一、动物的分组与给药方法
Wistar大鼠160只，体重300～350g,平均330g，雌雄不限，随机分为3组。6-OHDA组55只，MK-801组50只，对照组55只。各组采用Black静力加载技术[5]造成脊髓损伤。6-OHDA组经T13椎体切除术后，由蛛网膜下腔注射2.5×10-4kg/L6-OHDA(美国Sigma)20μl,给药后48h制成脊髓损伤模型(此时药物的效能最大)。MK-801组动物致伤后，立即经尾静脉注入5×10-5kg/LMK-801氢化苹果酸酯(美国Sigma)5mg/kg体重。对照组无特殊处理。
二、动物模型的制作
0.02kg/L戊巴比妥钠(30mg/kg体重)腹腔注射麻醉。以T13椎体为中心做后正中切口，切除T13椎板及T12部分椎板，暴露硬膜约3mm×5mm大小。在硬膜中心2mm×3mm面积上加载60g压力持续1min。造成可恢复性脊髓损伤。
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三、观察指标
1.髓内单胺类递质含量的测定6-OHDA组及对照组动物各5只，蛛网膜下腔给药后48h用断头法处死。切取T13脊髓节段，称重后加入0.4molHClO4制成匀浆。加入0.05mol/LEDTA·2Na50ml，于4℃、1600r/min条件下离心20min，过滤后取上清液20μl于高效液相色谱仪上测定NE、多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)的含量。
2.神经功能评分
每组动物各取10只，于伤后2周内，对各组动物的双下肢运动功能按照Tarlov-Klinger神经功能评分系统进行评定，记录双下肢评分的均值。
3.脊髓组织含水量的测定
每组动物各取20只，分别于伤后1、6、24、48h断头、放血处死，每时段5只动物。切取T13脊髓节段，在高灵敏度分析天平(METTLERAE260)上称重，然后置于100℃烤箱中烘干，再次称重，计算含水量。含水量=(湿重-干重)/湿重×100%。
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4.光镜、电镜标本的制作
每组动物各取10只，于伤后48h活体切取损伤区中心的脊髓组织，立即置于体积分数为10%的福尔马林液中固定，石蜡包埋，HE染色后光镜观察。每组动物各取10只，伤后48h于损伤中心切取电镜标本，立即用体积分数为3%的戊二醛固定，梯度丙酮脱水，环氧树脂618包埋，超薄切片，醋酸铀柠檬酸铅染色后用透射电镜观察。
四、统计学分析
采用非配对资料的t检验比较单胺类递质含量的变化。采用成组设计的多个样本的秩和检验(Kruskal-Wallis法)和多个样本两两比较的秩和检验(Nemenyi法)进行运动功能的比较。脊髓含水量的差异采用单因素方差分析(ANOVA)和最小显著差法(FisherPLSD)进行检验。
结果
一、脊髓内单胺类递质的含量变化
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给予6-OHDA后48h,脊髓组织内NE的含量明显下降，由217.450ng/g降为29.368ng/g,差异有非常显著性意义(P<0.01)；而DA和5-HT含量变化不显著，差异无显著性意义(表1)。
表1 用药前后脊髓组织内NE、DA、5-HT浓度的变化(
±s，ng/g)检测项目
用药前
用药后24h
NE
217.450±4.3
29.368±2.6*
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DA
37.750±2.1
36.316±1.8
5-HT
307.108±9.7
303.382±13.0
*P<0.01
二、运动功能的恢复
在此实验条件下，损伤所造成的肢体瘫痪可逐渐恢复，对照组这个过程可持续1～2周时间。在6-OHDA组，伤后6h运动功能已明显恢复(P<0.01)，伤后12h、24h、2d、3d表现为连续而显著的恢复过程(P<0.01)。MK-801治疗组伤后早期的恢复情况较对照组差异无显著性意义(P>0.05)；伤后24h开始出现明显的功能恢复(P<0.05)；伤后3d，两治疗组的双下肢运动功能接近正常水平(表2)。
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三、脊髓含水量的测定
伤后1h，各组动物脊髓受伤节段的含水量均有增加。6-OHDA组受伤节段含水量在伤后1～24h明显低于对照组，差异有非常显著性意义(P<0.01)；伤后48h含水量明显增加，与对照组相比差异无显著性意义(P>0.05)。而MK-801组伤后1～6h含水量较对照组变化不大，伤后24、48h含水量低于对照组，差异有非常显著性意义(P<0.01)(表3)。
表2 三组动物损伤后不同时间运动功能的恢复情况(Tarlov评分，
±s)分组
6h
12h
24h
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2d
3d
5d
7d
14d
6-OHDA组 1.90±0.47**
2.50±0.58**
2.90±0.52**
3.60±0.32**
4.00±0.00**
4.00±0.00**
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4.00±0.00**
4.00±0.00
MK-801组 1.00±0.24
1.40±0.39
2.30±0.54*
3.10±0.44**
3.90±0.20**
3.95±0.15**
4.00±0.00**
4.00±0.00
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对照组 0.80±0.48
1.00±0.67
1.20±0.63
1.60±0.39
2.20±0.42
2.60±0.50
3.40±0.24
3.95±0.14
*与对照组比较，P<0.05，*与对照组比较，P<0.01
表3三组动物损伤后不同时间脊髓组织含水量的比较(
±s，%), http://www.100md.com
分组 1h 6h 24h 48h 6-OHDA组 67.014±1.9* 68.715±1.8* 70.536±2.1* 70.778±1.5 MK-801组 69.599±1.5 70.195±1.3 70.768±1.4* 72.792±1.7* 对照组 70.736±1.1 71.435±1.4 73.375±1.9 73.610±1.6
*与对照组相比P<0.01
四、形态学观察结果
伤后48h的光镜观察显示三组动物脊髓损伤中心横断面均可见小片状出血，白质结构疏松，6-OHDA组表现最轻，对照组出血情况严重(图1～3)。6-OHDA组和对照组的神经细胞发生了不同程度的肿胀，肿胀的神经细胞着色浅淡，细胞外间隙减小或消失。MK-801组神经细胞形态基本正常。
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伤后48h的电镜观察示对照组可见毛细血管内皮肿胀，吞饮小泡增多，线粒体肿胀、空化，细胞间连接分离，内皮细胞与基底膜分离等血管源性水肿的表现(图4)。神经纤维内线粒体肿胀呈球形，雪旺细胞严重变性(图5)。在MK-801组，亦可见内皮损伤肿胀现象(图6)，但其神经纤维及雪旺细胞形态基本正常，仅见髓鞘板层紊乱(图7)。在6-OHDA组，毛细血管内皮结构尚完整(图8)，但其神经纤维及雪旺细胞仍可见明显的损伤和变性(图9)。
讨论
1972年，Osterholm等[6]提出继发性脊髓损伤的NE学说，认为损伤后NE在损伤区的过度释放与SSCI直接相关。但组织内NE的浓度对外界的刺激极为敏感，实验动物麻醉的深浅，致伤能量的大小，髓内NE合成的生理节律的变化，血压、血流、温度、组织内氧浓度的不同均会对髓内NE浓度造成影响[7]。由于没有一种实验模型可以完全消除这些因素的影响，所以目前学术界对NE在SSCI中的具体作用仍存有争议。6-OHDA是一种近年来应用较多的选择性酚胺能神经元破坏剂，它可被儿茶酚胺能神经元摄取，在神经元内代谢产生有毒的酚类、自由基之类的小分子，从而选择性地破坏儿茶酚胺能神经元，有效地降低组织内的NE水平，破坏其再合成NE的能力，而对其他神经递质的影响较小。本研究于动物蛛网膜下腔注射6-OHDA，48h后髓内的NE浓度由原来的217.450ng/g降到29.368ng/g，而DA和5-HT的浓度无明显改变(表1)。这样，通过髓内应用6-OHDA抑制NE的作用，避免测定组织中NE浓度的繁琐与不准确，可直接观察内源性NE在SSCI中的作用。
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本研究在脊髓损伤前48h经蛛网膜下腔注射6-OHDA，伤后获得满意的功能恢复。在本实验条件下，对照组全部动物的下肢功能在伤后2周内基本恢复，6-OHDA治疗组的恢复速度明显快于对照组。伤后6h，双下肢的Tarlov评分高于对照组，差异有非常显著性意义(P<0.01)；伤后12h～3d表现为一个连续而显著的恢复过程(表2)。说明6-OHDA组动物的继发性损伤程度较轻。与此相对应，受伤节段的组织含水量在伤后1h便明显低于对照组(P<0.01)，虽然随着时间的发展，含水量有逐步增加的趋势，但增加的速度明显慢于对照组，6-OHDA对水肿的有效抑制达24h(表3)。从形态学上观察，伤后48h，6-OHDA治疗组受伤节段的出血、水肿情况明显轻于对照组(图1，3)。毛细血管内皮结构完整，内皮细胞轻度肿胀，而对照组毛细血管内线粒体肿胀、嵴断裂，细胞间连接分离，毛细血管内皮细胞与基底膜间的血管周围间隙加大。说明损伤后过度释放的NE可以损伤内皮细胞导致血管源性水肿(图4，8)。6-OHDA对神经细胞及神经纤维的损伤无明显保护作用，提示神经功能的损害还与其他机制有关。
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图16-OHDA组伤后48h脊髓横断面，示小片状出血，范围较小，中央导水管完整2.5×4图2MK-801组伤后48h脊髓横断面，示小片状出血，相互融合，中央导水管破裂2.5×4图3对照组伤后48h脊髓横断面，示小片状出血严重，相互融合，中央导水管破裂2.5×4
图4对照组伤后48h，示毛细血管与基底膜分离较广泛，内皮周围间隙加大透射电镜×15000图5对照组伤后48h，神经纤维内的线粒体明显肿胀呈球形，嵴断裂透射电镜×10000图6MK-801组伤后48h，毛细血管与基底膜之间有分离透射电镜×15000图7MK-801组伤后48h，神经纤维结构基本正常，仅髓鞘板层有所紊乱透射电镜×15000图86-OHDA组伤后48h，毛细血管内皮轻度肿胀，结构完整透射电镜×15000图96-OHDA组伤后48h，雪旺细胞和髓鞘组织内神经纤维中的线粒体肿胀,嵴断裂透射电镜×12000
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EAA是一组中枢神经系统的主要兴奋性神经递质。脊髓损伤后，损伤区细胞外EAA积聚，此时EAA可通过(1)Na+、Cl-、H2O过度内流，导致神经细胞急性肿胀。(2)激动EAA受体(EAAsR)，启动电压依赖性钙通道，使Ca2+大量内流。Na+-Ca2+交换减弱，胞内过多的三磷酸肌醇(IP3)使胞内贮存的Ca2+释放增加，而发挥其神经毒性作用。近年来的研究表明，氧自由基、NO、血小板活化因子也参与EAA介导的神经毒性作用。EAAsR在脊髓组织中主要分布于后角及背侧神经根。其中天门冬氨酸受体(NMDAR)与Ca2+通道耦联，与脊髓损伤直接相关。MK-801是NMDAR的竞争性拮抗剂，可作用于NMDAR的b位点，拮抗EAA的作用。
在本次实验中，我们使用MK-801抑制EAA的作用，虽然对伤后早期脊髓水肿的形成没有明显的抑制作用，但在伤后24h，水肿的程度明显减轻，而且可抑制其进行性的发展(表3)。同时MK-801组动物的下肢运动功能在伤后24h恢复明显加快(表2)。在组织学切片上观察，MK-801组伤后早期脊髓的出血、水肿情况并不明显优于对照组(图2，3)，但神经细胞的形态基本正常，未发生明显肿胀。电镜观察发现，对照组伤后48h神经纤维内的线粒体明显肿胀、呈球形、嵴全部断裂(图5)，雪旺细胞严重变性，可见染色质大部分消失，仅剩核仁突出。而此时的MK-801组，神经纤维结构基本正常，仅见髓鞘板层紊乱(图7)，雪旺细胞染色质轻度边集。这说明，MK-801可以有效抑制脊髓损伤后发生的细胞毒性水肿，从而发挥其保护性治疗作用。于明琨等[8]认为NMDAR介导的脑水肿主要为细胞毒性水肿。Yanase等[9]使用MK-801抑制EAA的作用，可以明显减轻脊髓损伤区水肿的程度，而对血流和血管的通透性没有影响。这从另一个侧面证实了我们的观点。
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对比6-OHDA组和MK-801组不难发现，虽然6-OHDA和MK-801都能有效抑制水肿的发生和促进功能的恢复，但起效时间是不同的。在6-OHDA组，伤后早期即可获得明显的功能恢复，而MK-801组，伤后24h恢复的速度才加快，在伤后2～3d表现为明显的恢复过程(表2)。从水肿形成的情况来看，6-OHDA组伤后1h组织含水量明显低于对照组及MK-801组，但随着时间的发展还有进一步加重的趋势；在MK-801组，伤后1～6h含水量较对照组无明显减少，但伤后24～48h含水量基本稳定，未进一步加重，而此时对照组含水量仍在进一步增加(表3)。这提示NE和EAA在脊髓水肿的不同时相中起着不同的作用。
Klatzo[10]将脑水肿分为血管源性水肿和细胞毒性水肿两种，我们的实验证明，这一观点同样适用于脊髓。Tengvar[11]观察到伤后24h神经元对horseradish过氧化物酶的摄取增加了，并由此认为细胞毒性水肿发生于伤后24h。事实上，单独的血管源性水肿和细胞毒性水肿是不存在的。我们在实验中观察到，6-OHDA可以明显减轻血管的损伤，对伤后早期的水肿有明显的抑制作用。而MK-801可以减轻细胞毒性水肿的表现，组织含水量在伤后24h才稳定。因此我们推测，血管源性水肿在伤后早期发生，虽然此时可发生神经细胞的肿胀，但血管源性水肿是此时脊髓水肿的主要形式，随着微循环的改变趋于稳定，细胞毒性水肿逐渐加重，并成为损害神经功能的主要因素。6-OHDA和MK-801正是由于抑制了不同形式的水肿而表现为疗效上的时间差异。
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虽然NE与EAA在脊髓水肿发生过程中的确切机制还有待于进一步探讨，但通过实验研究可以证明：(1)NE、EAA在脊髓水肿的发生、发展中起着重要作用，拮抗它们的作用可以有效抑制水肿，从而达到治疗SSCI的目的。(2)NE、EAA在水肿发生中的作用机制是不同的。NE主要影响伤后早期的血管源性水肿，EAA则影响稍后发生的细胞毒性水肿。针对多种损伤因子的全面治疗是目前临床治疗SSCI的基本观点。既然不同的损伤因子在损伤后的不同时相内有不同的作用，正确合理地选择药物来防治脊髓损伤后的病理破坏，值得进一步探讨。
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7，明琨，朱诚，张光霁.N-甲基-D-天门冬氨酸受体拮抗剂对猫创伤性脑水肿的影响. 中华神经外科杂志,1994,10：79-82.
8，Yanase M, Sakou T, Fukuda T. Role of N- methyl- D- aspartate receptor in acute spinal cord injury. J Neurosurg,1995, 83:884- 888.
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(收稿日期:2000-02-02), 百拇医药