抗CD4单克隆抗体可变区基因克隆及测序
作者：朱志刚 沈关心 朱惠芬 王晓林 张悦 龚非力 毛平
单位：朱志刚(广东省广州市第一人民医院血液内科 510180)；沈关心(同济医科大学免疫学教研室 430032)；朱惠芬(同济医科大学免疫学教研室 430032)；王晓林(同济医科大学免疫学教研室 430032)；张悦(同济医科大学免疫学教研室 430032)；龚非力(同济医科大学免疫学教研室 430032)；毛平(广东省广州市第一人民医院血液内科 510180)
关键词：单克隆抗体；可变区；基因克隆；序列分析
广东医学000806
【摘要】 目的 获取抗CD4单克隆抗体(McAb)可变区基因,为构建抗CD4嵌合抗体打下基础。方 法 从分泌抗人CD4 McAb的杂交瘤细胞系中提取总RNA，用家族特异性引物进行逆转录多聚 酶链 反应(RT-PCR)，分别扩增出重链可变区(VH)基因及轻链可变区(VL)基因。将PCR产物克隆至p GEM-T载体,然后转化JM109细菌。并用全自动DNA序列分析仪对VH及VL基因序列进行测定。结 果 VH基因为351bp,编码117aa残基；VL基因为333bp,编码111aa残基。根据K abat分类 体系，VH隶属小鼠免疫球蛋白(Ig)重链Ⅱ(A)亚组，VL隶属小鼠Ig κ链Ⅲ亚组。结 论 从推导出的氨基酸序列证实，所获取的VH和VL序列均符合小鼠Ig可变区的氨基酸序列特征。
, http://www.100md.com
Cloning and sequencing of the VH/VL genes of anti-CD4 McAb
Zhu Zhigang Shen Guanxin Zhu Huifen et al
(Department of Hematology, Guangzho u First Municipal People's Hospital,Guangzhou 510180)
【Abstract】 Objective To acquire variable region gene of anti-CD4 monoclonal an tib ody(McAb) for construction of anti-CD4 chimeric antibody.Methods From the mouse hybr idoma cell line that secreting antibody against CD4,total RNA was prepared .Th e VH and VL genes were amplified by RT-PCR with family specific primer pairs,r espectively. The PCR products were cloned into pGEM-T vectors,then transfected i nto JM109. The VH and VL genes were analysed by auto-matic DNA seqencer. Results The results showed that VH of the anti-CD4 McAb consists of 351bp encoding 11 7 a mino acid residues, and VL of the anti-CD4 McAb contains 333bp encoding 111 ami no acid residues. According to Kabat classified method,the VH and VL genes belon g to the mouse Ig heavy chain subgroup Ⅱ(A) and κ chain subgroup Ⅲ, respe ctively.Conclusion The deduced amino acid sequences of the VH/VL ar e in agreemen t with the characterization of the amino acid present in the mouse Ig variable region.
, 百拇医药
【Key words】 Monoclonal antibody Variable region Gene cloning Sequencin
CD4+T细胞与TCR/CD3识别的MHC Ⅱ类分子相互作用,参与T细胞激活，在 大多数自身免疫疾病 的发病过程中起中心作用。在人类,抗CD4单抗已被成功地用来治疗类风湿性关节炎[1]、系 统性红斑狼疮[2]等自身免疫性疾病和肾移植患者的急性和慢性排斥反应[3 ]。但鼠源性单抗 在人体可引起中和性人抗鼠抗体(HAMA)的产生而使其应用受到限制。构建将鼠单抗的可变区 (V)和人免疫球蛋白(Ig)的恒定区(C)相连的人-鼠嵌合抗体，可减少鼠单抗的免疫原性 ，同时保持与 抗原特异结合的能力。抗CD4抗体的VH和VL基因的克隆成功为其嵌合抗体的构建、表达和 应用奠定了基础。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 细胞系 小鼠抗CD4 McAb杂交瘤细胞系由同济医科大学免疫学 教研室收藏; JM109 细菌购自Promega公司; XL2 -Blue细菌购自Stratagen公司。
1.2 工具酶和试剂 限制 性内切酶Sal I，Not I和T4 DNA连接酶(USB),TRIzol试剂和Super SCRIP cDNA合成试剂(G IB co CRL),碱性磷酸酶、RNA酶、Taq DNA聚合酶和dNTPs(Boehringer Mannheim), Triton-X-1 00(Serva), QIAprep 8 plasmid kit，QIAprep plasmid mini prep kit和QIAEXⅡ
本课题受国家自然科学基金资助(编号：39370628)
, 百拇医药
DNA pr ification kit(Diagen), Wizard PCR preps DNA purification system和克隆载体pGEM-T( P romega),DNA序列测定试剂ABI PRISM dye terminator cycle seqencing ready reaction kit(Perkin Elmer)。
1.3 RNA提取 参照TRIzol reagent kit说明书,从分泌抗人CD4 McA b的杂交瘤细胞系中提取总RNA。
1.4 RT-PCR 参照Super SCRIP cDNA合成试剂说明书,合成cDNA第1条链。 PCR引物 由Eurogen公司合成,VH for(Not I) 5′-d(GCC TGC GGC CGC GAG AGG TTT T AA GGA CTC ACC TGA GGA GAC TGT GAG AGT G)-3′和VL for(Not I) 5′-d(GGC CTG CGG CCG C TT TAA ATT C TA CTC ACG TTT [G/T] AT TTC CAG CTT GGT)-3′分别与鼠Ig的重链和轻链恒定区mRNA 的5′端 互补;VH back(Sal I) 5′-d(GGG GTC GAC CTC ACC ATG G[A/G]A TG[C /G] AGC TG[T/G] GT[C /A] AT[C/G] CTC TT)-3′和VL back(Sal I) 5′-d(GGG GTC GAC CTC AC C ATG GAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA)-3′分别与反义cDNA保守的N端互补。在50 μl反应体积中,分别取合成的 cDNA第 1条链 2μl作模板,其中一管加入10 μmol/L VH for和VH back引物各2 μl,另一管加 入 10 μmol/L VL for和VL back引物各2 μl,然后每管加入10×PCR 缓冲液 5 μl、10 mmol/ L dNTP s 5 μl、10 mmol/L MgCl2 3 μl、Taq DNA聚合酶1 μl。PCR反应条件:95℃预变性 5 min后 , 94℃ 30 s,42℃ 30 s,72 ℃ 1 min(末次为10 min),共30个循环。取5～10 μl PC R产物进行2%琼脂糖电泳。
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1.5 VH和VL DNA的克隆 按Wizard PCR preps DNA purificati on system说明书纯 化PCR产物,并用紫外分光光度计测定纯化的VH和VL的DNA浓度。以pGEM-T作为克隆载体, 分 别将VH和VL与pGEM-T连接。反应体系如下:10×T4 DNA连接酶缓冲液1 μl, pGEM-T载体( 50 ng)1 μl, VH或VL DNA 数ng (按插入片段/载体摩尔比为3∶1 ), T4 DNA连接酶 (5 u/μl)1 μl,用三蒸水补足体积至10 μl。将反应管置25℃水浴3 h。每管取2 μl 用来转化处于感受态的 JM109受体菌,然后涂布于含X-gal,IPTG和100 μg/ml Amp的LB平板上 ,37℃过夜。
1.6 菌落PCR鉴定 用无菌牙签挑取单个白色菌落,接种至另一LB平板上 有编号的方格内保种 ,然后将此牙签置20 μl 0.1% Triton X-100液中煮沸2 min ,取2 μl作模板DNA, 以V 引物进行PCR。引物序列如下: V for 5′-AAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCG-3′;V back 5′-GCT T CCGGCTCGTATGTTGTGTG-3′。反应条件: 94℃预变性5 min, 94℃ 1 min, 60 ℃ 3 0 s, 72℃ 1 min(最后一个循环10 min), 共25个循环。然后取10 μl PCR反应产物, 2%琼脂糖电泳鉴定阳性克隆。
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1.7 VH和VL DNA序列测定 分别取VH和VL菌落PCR产物10 μl,用2u Exo I(Perki n Elmer)消化,37℃ 15 min, 80℃ 15 min, 然后加入碱性磷酸酶2 u, 37℃ 1 5 min,80℃ 15 min。测序引物:M13 (-20Universal):5′-GTAAAACGACGGCCAGT-3′; M13( -40):5′-GTT TTCCCAGTCACGAC-3′; SP6:5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATACT-3′;T7:5′-TAATACGAC TCACTATA GGGCGA-3′。使用ABI PRISM dye terminator cycle seqencing ready reaction kit(Perk in Elmer),在PE 310型全自动DNA序列分析仪上进行序列测定。
1. 8 核酸序列的计算机分析 经Internet网进入美国NCBI(全国生物技术信息中 心),使用BLA ST(basic local alignment search tool)将VH和VL DNA序列输入，与GenBank和EMBL数据库 中 已发表序列进行碱基局部同源性比较,然后在微机上用核酸蛋白分析软件DNASIS 7.0 versio n(Hitachi)进行开放阅读框分析和翻译，并与Kabat等总结的已知鼠抗体可变区氨基酸序 列分类进行对比。
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2 结果
2.1 VH和VL基因的扩增 PCR产物进行2%琼脂糖电泳,可观察到430 bp左右 的含VH条带和410 bp左右的含VL条带。直接从PCR产物中纯化得到VH和VL。
2.2 VH和VL基因扩增产物的克隆和鉴定 分别将VH-pGEM-T连接产物和VL-pGEM-T 连接产 物转化JM109感受态细菌,得到数十个白色菌落,经过菌落PCR,取10 μl PCR产物进行2% 琼脂糖电泳。VH得到6个阳性克隆,VL得到7个阳性克隆。
2.3 VH和VL基因的核苷酸序列分析 VH和VL均符合小鼠Ig可变区框架结 构，VH DNA序列共408bp,其中信号肽57bp,编码区351bp、编码117aa,隶属小鼠Ig重链可变 区Ⅱ(A)组；VL DNA序列共393bp,其中信号肽60bp,编码区333bp、编码111氨基酸残基,隶 属小鼠Ig κ链可变区Ⅲ组，分别见图1和图2。
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sequence region: 1-408
translation region: 58-408
图1 抗CD4单抗重链可变区DNA和氨基酸序列
signal peptide: 1～57 bp， FR1： 58～147 bp， CDR1：148～162 bp， FR2: 163～204 bp， CDR2：205～255 bp， FR3: 256～351 bp， CDR3：352～375 bp， FR4: 376～408 bp
signal peptide：信号肽序列, FR：骨架区, CDR：互补决定区
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3 讨论
免疫抑制药物在治疗自身免疫病和进行器官移植术时得到广泛的应用，但由于引起非抗原特 异性的免疫抑制、需要长期持续使用和承受感染的风险及其令人讨厌的药物副作用，至今 取得的成功是有限的。理想的免疫抑制治疗是短期治疗达到长期对特定抗原的免疫无反应 性，且不损害机体抵抗感染的能力[4]。抗CD4+ T细胞的单抗已用于免疫 抑制治疗，预防或 治疗器官移植排斥反应和改善人类的自身免疫性疾病。但鼠源性单抗在人体使用时，因其引 起HAMA的产生而受到限制。随着基因工程技术的发展，可对鼠源性单抗进行改造，构建人- 鼠嵌合抗体。 嵌合抗体的构建，首先需获取鼠源性的VH和VL基因，可采用不同的技术路线。 第1条途径是从杂交瘤细胞中提取出大分子量的DNA，然后经过酶切、与噬菌体连接， 连接 产物用包装蛋白包装后感染大肠杆菌，构 建基因组文库。用VH和VL通用探针分别多次筛选此 文库，再用相应的酶切阳性菌斑的DNA分别与VH和VL特异探针作Southern杂交进行筛选，才 能分离出功能性VH和VL。这是早期构建人-鼠嵌合抗体时采用的方法。此方法操作难度大、 费用高，且由于合成的特异性探针短而易出现假基因。第2条途径是首先构建基因组文 库，然 后从杂交瘤细胞中提取出总RNA或mRNA,用小鼠Ig VH和VL特异性正反向引物，扩增出VH和VL cDNA 片断，并进行DNA序列分析。以此经过鉴定的VH和VL cDNA作为探针，从基因组文库中筛选含有上、 下游调控序列的功能性VH和VL基因，以 便在真核细胞中表达。此途径比第1条途 径简便、 省时而且特异性高，但仍需构建基因组文库、进行Southern杂交筛选。此研究从杂 交瘤细胞中提取出总RNA,用小鼠Ig VH和VL家族特异性正反向引物，扩增出VH和VL cDNA片 断，并进行DNA序列分析。然后，将经过测序验证的VH和VL基因直接亚克隆至分别含有人Ig 恒定区Cκ或Cγ1及调控序列的轻链和重链表达载体中，因而可以在真核细胞中得 到表达[5]。与上述两种途径比较可知，此方案更加简便、快速和耗费低。另外 ，用cDNA的 第1条链为模板扩增真核基因有以下优点：扩增出来的基因是能表达的结构基因；没有内含 子，基因长度相对较短，较易扩增；单拷贝基因在模板中的相对浓度大，扩增效率高[6]。
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图2 抗CD4单抗轻链可变区DNA和氨基酸序列
signal peptide: 1～60 bp， FR1: 61～131 bp， CDR1：132～175 b p， FR2: 176～219 bp， CDR2：220～240 bp， FR3: 241～336 bp， CDR3：337～363 bp， FR4: 364～393 bp
作者选用pGEM-T作为克隆载体，该载体来源于pGEM-5Zf(+)，预先用EcoR V在多克隆位点切 开后，在3′末端各加上一个脱氧胸苷(T)，因此可直接与PCR产物在T4连接酶作用下相连 接， 提高了效率。采用菌落PCR筛选阳性克隆，无需采用常规方法提取质粒DNA和用核酸内切酶消 化，且一次PCR可同时鉴定20～30个克隆，从而大大节省了时间，提高了鉴定效率。抗CD4 单克隆抗体VH和VL基因的克隆成功和序列分析为构建和表达抗CD4嵌合抗体奠定了基础。
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参考文献
1，Horneff G,Burinester GR,Emmerrich F, et al. Treatment of rheumatoid arthriti s with an anti-CD4 monoclonal antibody. Arthritis Rheum,1991，34:129
2，Heipe F,Volk HD,Apostoloff HD,et al.Treatment severe systemic lupus er ythematosus with anti-CD4 monoclonal antibody.Lancet,1991，338: 1529
3，Bach JF. Immunosuppressive therapy of autoimmune diseases. Immunology, Today, 1 993,14:322
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4，Waldmann H,Cobbold S.The use of monoclonal antibodies to achieve immun ological tolerance.Immunology Today,1993,14:247
5，Shen G,Zhu Z,Zhu H,et al.Expression of anti-CD4 human/murin e chimeric ant ibody and their killer tumor activity.J Tongji Medical University,1998,18(1):1
6，苏，娜，沈关心，主编.抗体工程.北京：科学技术出版社，1996.133～135
(收稿日期：2000-03-27), http://www.100md.com
单位：朱志刚(广东省广州市第一人民医院血液内科 510180)；沈关心(同济医科大学免疫学教研室 430032)；朱惠芬(同济医科大学免疫学教研室 430032)；王晓林(同济医科大学免疫学教研室 430032)；张悦(同济医科大学免疫学教研室 430032)；龚非力(同济医科大学免疫学教研室 430032)；毛平(广东省广州市第一人民医院血液内科 510180)
关键词：单克隆抗体；可变区；基因克隆；序列分析
广东医学000806
【摘要】 目的 获取抗CD4单克隆抗体(McAb)可变区基因,为构建抗CD4嵌合抗体打下基础。方 法 从分泌抗人CD4 McAb的杂交瘤细胞系中提取总RNA，用家族特异性引物进行逆转录多聚 酶链 反应(RT-PCR)，分别扩增出重链可变区(VH)基因及轻链可变区(VL)基因。将PCR产物克隆至p GEM-T载体,然后转化JM109细菌。并用全自动DNA序列分析仪对VH及VL基因序列进行测定。结 果 VH基因为351bp,编码117aa残基；VL基因为333bp,编码111aa残基。根据K abat分类 体系，VH隶属小鼠免疫球蛋白(Ig)重链Ⅱ(A)亚组，VL隶属小鼠Ig κ链Ⅲ亚组。结 论 从推导出的氨基酸序列证实，所获取的VH和VL序列均符合小鼠Ig可变区的氨基酸序列特征。
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Cloning and sequencing of the VH/VL genes of anti-CD4 McAb
Zhu Zhigang Shen Guanxin Zhu Huifen et al
(Department of Hematology, Guangzho u First Municipal People's Hospital,Guangzhou 510180)
【Abstract】 Objective To acquire variable region gene of anti-CD4 monoclonal an tib ody(McAb) for construction of anti-CD4 chimeric antibody.Methods From the mouse hybr idoma cell line that secreting antibody against CD4,total RNA was prepared .Th e VH and VL genes were amplified by RT-PCR with family specific primer pairs,r espectively. The PCR products were cloned into pGEM-T vectors,then transfected i nto JM109. The VH and VL genes were analysed by auto-matic DNA seqencer. Results The results showed that VH of the anti-CD4 McAb consists of 351bp encoding 11 7 a mino acid residues, and VL of the anti-CD4 McAb contains 333bp encoding 111 ami no acid residues. According to Kabat classified method,the VH and VL genes belon g to the mouse Ig heavy chain subgroup Ⅱ(A) and κ chain subgroup Ⅲ, respe ctively.Conclusion The deduced amino acid sequences of the VH/VL ar e in agreemen t with the characterization of the amino acid present in the mouse Ig variable region.
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【Key words】 Monoclonal antibody Variable region Gene cloning Sequencin
CD4+T细胞与TCR/CD3识别的MHC Ⅱ类分子相互作用,参与T细胞激活，在 大多数自身免疫疾病 的发病过程中起中心作用。在人类,抗CD4单抗已被成功地用来治疗类风湿性关节炎[1]、系 统性红斑狼疮[2]等自身免疫性疾病和肾移植患者的急性和慢性排斥反应[3 ]。但鼠源性单抗 在人体可引起中和性人抗鼠抗体(HAMA)的产生而使其应用受到限制。构建将鼠单抗的可变区 (V)和人免疫球蛋白(Ig)的恒定区(C)相连的人-鼠嵌合抗体，可减少鼠单抗的免疫原性 ，同时保持与 抗原特异结合的能力。抗CD4抗体的VH和VL基因的克隆成功为其嵌合抗体的构建、表达和 应用奠定了基础。
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1 材料与方法
1.1 细胞系 小鼠抗CD4 McAb杂交瘤细胞系由同济医科大学免疫学 教研室收藏; JM109 细菌购自Promega公司; XL2 -Blue细菌购自Stratagen公司。
1.2 工具酶和试剂 限制 性内切酶Sal I，Not I和T4 DNA连接酶(USB),TRIzol试剂和Super SCRIP cDNA合成试剂(G IB co CRL),碱性磷酸酶、RNA酶、Taq DNA聚合酶和dNTPs(Boehringer Mannheim), Triton-X-1 00(Serva), QIAprep 8 plasmid kit，QIAprep plasmid mini prep kit和QIAEXⅡ
本课题受国家自然科学基金资助(编号：39370628)
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DNA pr ification kit(Diagen), Wizard PCR preps DNA purification system和克隆载体pGEM-T( P romega),DNA序列测定试剂ABI PRISM dye terminator cycle seqencing ready reaction kit(Perkin Elmer)。
1.3 RNA提取 参照TRIzol reagent kit说明书,从分泌抗人CD4 McA b的杂交瘤细胞系中提取总RNA。
1.4 RT-PCR 参照Super SCRIP cDNA合成试剂说明书,合成cDNA第1条链。 PCR引物 由Eurogen公司合成,VH for(Not I) 5′-d(GCC TGC GGC CGC GAG AGG TTT T AA GGA CTC ACC TGA GGA GAC TGT GAG AGT G)-3′和VL for(Not I) 5′-d(GGC CTG CGG CCG C TT TAA ATT C TA CTC ACG TTT [G/T] AT TTC CAG CTT GGT)-3′分别与鼠Ig的重链和轻链恒定区mRNA 的5′端 互补;VH back(Sal I) 5′-d(GGG GTC GAC CTC ACC ATG G[A/G]A TG[C /G] AGC TG[T/G] GT[C /A] AT[C/G] CTC TT)-3′和VL back(Sal I) 5′-d(GGG GTC GAC CTC AC C ATG GAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA)-3′分别与反义cDNA保守的N端互补。在50 μl反应体积中,分别取合成的 cDNA第 1条链 2μl作模板,其中一管加入10 μmol/L VH for和VH back引物各2 μl,另一管加 入 10 μmol/L VL for和VL back引物各2 μl,然后每管加入10×PCR 缓冲液 5 μl、10 mmol/ L dNTP s 5 μl、10 mmol/L MgCl2 3 μl、Taq DNA聚合酶1 μl。PCR反应条件:95℃预变性 5 min后 , 94℃ 30 s,42℃ 30 s,72 ℃ 1 min(末次为10 min),共30个循环。取5～10 μl PC R产物进行2%琼脂糖电泳。
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1.5 VH和VL DNA的克隆 按Wizard PCR preps DNA purificati on system说明书纯 化PCR产物,并用紫外分光光度计测定纯化的VH和VL的DNA浓度。以pGEM-T作为克隆载体, 分 别将VH和VL与pGEM-T连接。反应体系如下:10×T4 DNA连接酶缓冲液1 μl, pGEM-T载体( 50 ng)1 μl, VH或VL DNA 数ng (按插入片段/载体摩尔比为3∶1 ), T4 DNA连接酶 (5 u/μl)1 μl,用三蒸水补足体积至10 μl。将反应管置25℃水浴3 h。每管取2 μl 用来转化处于感受态的 JM109受体菌,然后涂布于含X-gal,IPTG和100 μg/ml Amp的LB平板上 ,37℃过夜。
1.6 菌落PCR鉴定 用无菌牙签挑取单个白色菌落,接种至另一LB平板上 有编号的方格内保种 ,然后将此牙签置20 μl 0.1% Triton X-100液中煮沸2 min ,取2 μl作模板DNA, 以V 引物进行PCR。引物序列如下: V for 5′-AAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCG-3′;V back 5′-GCT T CCGGCTCGTATGTTGTGTG-3′。反应条件: 94℃预变性5 min, 94℃ 1 min, 60 ℃ 3 0 s, 72℃ 1 min(最后一个循环10 min), 共25个循环。然后取10 μl PCR反应产物, 2%琼脂糖电泳鉴定阳性克隆。
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1.7 VH和VL DNA序列测定 分别取VH和VL菌落PCR产物10 μl,用2u Exo I(Perki n Elmer)消化,37℃ 15 min, 80℃ 15 min, 然后加入碱性磷酸酶2 u, 37℃ 1 5 min,80℃ 15 min。测序引物:M13 (-20Universal):5′-GTAAAACGACGGCCAGT-3′; M13( -40):5′-GTT TTCCCAGTCACGAC-3′; SP6:5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATACT-3′;T7:5′-TAATACGAC TCACTATA GGGCGA-3′。使用ABI PRISM dye terminator cycle seqencing ready reaction kit(Perk in Elmer),在PE 310型全自动DNA序列分析仪上进行序列测定。
1. 8 核酸序列的计算机分析 经Internet网进入美国NCBI(全国生物技术信息中 心),使用BLA ST(basic local alignment search tool)将VH和VL DNA序列输入，与GenBank和EMBL数据库 中 已发表序列进行碱基局部同源性比较,然后在微机上用核酸蛋白分析软件DNASIS 7.0 versio n(Hitachi)进行开放阅读框分析和翻译，并与Kabat等总结的已知鼠抗体可变区氨基酸序 列分类进行对比。
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2 结果
2.1 VH和VL基因的扩增 PCR产物进行2%琼脂糖电泳,可观察到430 bp左右 的含VH条带和410 bp左右的含VL条带。直接从PCR产物中纯化得到VH和VL。
2.2 VH和VL基因扩增产物的克隆和鉴定 分别将VH-pGEM-T连接产物和VL-pGEM-T 连接产 物转化JM109感受态细菌,得到数十个白色菌落,经过菌落PCR,取10 μl PCR产物进行2% 琼脂糖电泳。VH得到6个阳性克隆,VL得到7个阳性克隆。
2.3 VH和VL基因的核苷酸序列分析 VH和VL均符合小鼠Ig可变区框架结 构，VH DNA序列共408bp,其中信号肽57bp,编码区351bp、编码117aa,隶属小鼠Ig重链可变 区Ⅱ(A)组；VL DNA序列共393bp,其中信号肽60bp,编码区333bp、编码111氨基酸残基,隶 属小鼠Ig κ链可变区Ⅲ组，分别见图1和图2。
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sequence region: 1-408
translation region: 58-408
图1 抗CD4单抗重链可变区DNA和氨基酸序列
signal peptide: 1～57 bp， FR1： 58～147 bp， CDR1：148～162 bp， FR2: 163～204 bp， CDR2：205～255 bp， FR3: 256～351 bp， CDR3：352～375 bp， FR4: 376～408 bp
signal peptide：信号肽序列, FR：骨架区, CDR：互补决定区
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3 讨论
免疫抑制药物在治疗自身免疫病和进行器官移植术时得到广泛的应用，但由于引起非抗原特 异性的免疫抑制、需要长期持续使用和承受感染的风险及其令人讨厌的药物副作用，至今 取得的成功是有限的。理想的免疫抑制治疗是短期治疗达到长期对特定抗原的免疫无反应 性，且不损害机体抵抗感染的能力[4]。抗CD4+ T细胞的单抗已用于免疫 抑制治疗，预防或 治疗器官移植排斥反应和改善人类的自身免疫性疾病。但鼠源性单抗在人体使用时，因其引 起HAMA的产生而受到限制。随着基因工程技术的发展，可对鼠源性单抗进行改造，构建人- 鼠嵌合抗体。 嵌合抗体的构建，首先需获取鼠源性的VH和VL基因，可采用不同的技术路线。 第1条途径是从杂交瘤细胞中提取出大分子量的DNA，然后经过酶切、与噬菌体连接， 连接 产物用包装蛋白包装后感染大肠杆菌，构 建基因组文库。用VH和VL通用探针分别多次筛选此 文库，再用相应的酶切阳性菌斑的DNA分别与VH和VL特异探针作Southern杂交进行筛选，才 能分离出功能性VH和VL。这是早期构建人-鼠嵌合抗体时采用的方法。此方法操作难度大、 费用高，且由于合成的特异性探针短而易出现假基因。第2条途径是首先构建基因组文 库，然 后从杂交瘤细胞中提取出总RNA或mRNA,用小鼠Ig VH和VL特异性正反向引物，扩增出VH和VL cDNA 片断，并进行DNA序列分析。以此经过鉴定的VH和VL cDNA作为探针，从基因组文库中筛选含有上、 下游调控序列的功能性VH和VL基因，以 便在真核细胞中表达。此途径比第1条途 径简便、 省时而且特异性高，但仍需构建基因组文库、进行Southern杂交筛选。此研究从杂 交瘤细胞中提取出总RNA,用小鼠Ig VH和VL家族特异性正反向引物，扩增出VH和VL cDNA片 断，并进行DNA序列分析。然后，将经过测序验证的VH和VL基因直接亚克隆至分别含有人Ig 恒定区Cκ或Cγ1及调控序列的轻链和重链表达载体中，因而可以在真核细胞中得 到表达[5]。与上述两种途径比较可知，此方案更加简便、快速和耗费低。另外 ，用cDNA的 第1条链为模板扩增真核基因有以下优点：扩增出来的基因是能表达的结构基因；没有内含 子，基因长度相对较短，较易扩增；单拷贝基因在模板中的相对浓度大，扩增效率高[6]。
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图2 抗CD4单抗轻链可变区DNA和氨基酸序列
signal peptide: 1～60 bp， FR1: 61～131 bp， CDR1：132～175 b p， FR2: 176～219 bp， CDR2：220～240 bp， FR3: 241～336 bp， CDR3：337～363 bp， FR4: 364～393 bp
作者选用pGEM-T作为克隆载体，该载体来源于pGEM-5Zf(+)，预先用EcoR V在多克隆位点切 开后，在3′末端各加上一个脱氧胸苷(T)，因此可直接与PCR产物在T4连接酶作用下相连 接， 提高了效率。采用菌落PCR筛选阳性克隆，无需采用常规方法提取质粒DNA和用核酸内切酶消 化，且一次PCR可同时鉴定20～30个克隆，从而大大节省了时间，提高了鉴定效率。抗CD4 单克隆抗体VH和VL基因的克隆成功和序列分析为构建和表达抗CD4嵌合抗体奠定了基础。
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参考文献
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(收稿日期：2000-03-27), http://www.100md.com