ACV治疗转TK基因人肺腺癌细胞A549裸鼠皮下成瘤的实验研究
作者：何祥梁 郭先健
单位：何祥梁(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037)；郭先健(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037)
关键词：肺癌；HSV1-TK基因；基因治疗；无环鸟苷；腺癌
第三军医大学学报000816
提 要： 目的 观察活体内转TK基因肺腺癌细胞对ACV(无环鸟苷)的敏感性。方法 转TK基因肺腺癌细胞A549-TK、亲代细胞A549分别接种于裸鼠腹部皮下左右侧成瘤后,给予腹腔注射ACV治疗2周，测量治疗前后肿瘤大小，并做病理观察。 结果 A549-TK细胞接种的肿瘤治疗前后体积增大不明显(P>0.05);A549细胞接种的肿瘤治疗后体积明显大于治疗前，光镜发现A549-TK细胞接种的肿瘤有局部坏死，胞核裂解、消失。结论 转TK基因肺腺癌细胞接种裸鼠所形成的肿瘤能被ACV治疗抑制生长。
, 百拇医药
中图法分类号： R730.261;R730.59;R734.2 文献标识码： A
文章编号：1000-5404(2000)08-0766-03
Study of ACV treatment of subcutaneous tumors induced with inoculation of pulmonary adenocarcinoma cells A549-TK in nude mice
HE Xiang-liang, GUO Xian-jian
(Instittue of Respiratory Disease, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037, China)
, 百拇医药
Abstract： Objective To observe the sensitivity of pulmonary adenocarcinoma cell A549 transfected with TK gene to acyclovir ACV in nude mice. Methods A549-TK, A549-cells were inoculated into left and right abdominal wall in nude mice respectively. When the tumors grew to certain volume, animals were treated with ACV injection into the abdominal cavity for 2 weeks, the diameter of tumor was measured before and after ACV treatment. The tumor tissues were examined pathologically with light microscope. Results The tumors induced with inoculation of A549-TK cells showed no significant increase of their volume after ACV treatment (P>0.05) but those induced with inoculation of A549 cells demonstrated an obvious increase in their volume after treatment. Light microscopy revealed local necrosis, karyoklasis and nuclear disappearance. Conclusion The growth of tumor induced with inoculation of A549-TK cells could be inhibited with ACV treatment in nude mice.
, http://www.100md.com
Key words: pulmonary carcinoma; TK gene; gene therapy; acyclovir; adenocarcinoma
TK基因作为研究最多的自杀基因，已进行了多种肿瘤体内外治疗研究，美国FDA早已批准该基因可以进入临床治疗试验，如脑胶质瘤、黑色素瘤、卵巢癌等。为了探索该基因治疗肺癌的效果， 旨在为该基因进入临床治疗肺癌奠定基础， 我们将TK基因转入人肺腺癌细胞A549在裸鼠体内进行试验，现报告如下。
1 材料与方法
RPMI1640、0.25%胰蛋白酶均为Gibco公司产品，ACV为进口分装。A549-TK、 A549均为作者转染保存，BALB/c裸小鼠购于第三军医大学实验动物中心。
取对数生长中晚期A549-TK、A549 2种细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，用PBS洗2遍,离心，留细胞沉淀，用无血清的RPMI1640培养基重悬细胞，细胞密度达5×107/ml BALB/c裸小鼠9只(第1批6只，第2批3只)，雌雄不拘，4～5周龄，平均重量为(19.8±1.5)g,确定左右侧分别接种A549-TK、A549细胞，每个点接种细胞107/0.2 ml，其中3只裸鼠各接种4个点，另6只裸鼠每只接种2个点。自接种之日起每天观察肿瘤结节生长情况，待大部分肿瘤在(0.5～1)cm×(0.5～1)cm(长×宽)之间，开始治疗，按ACV 100 mg.kg-1.d-1，腹腔注射，每天上下午各1次，连续2周。治疗前及治疗结束时均用卡尺测量肿瘤长宽，并拍照。肿瘤体积按V=1/2((长2×宽) mm3公式计算，肿瘤体积大小用配对计量资料Student′s t检验分析。病理观察：治疗结束后无菌取出肿瘤组织，10%福尔马林固定24 h ，石蜡包埋切片，HE染色，普通光镜下观察，请病理专家鉴定。
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2 结果
2.1 裸鼠体内成瘤情况及治疗前后肿瘤大小的变化
将A549-TK,A549 2种瘤细胞接种裸鼠后成瘤时间、肿瘤发生频率、ACV治疗前后体积分别进行统计，见表1。裸鼠体内成瘤见图1，表示其中1只裸鼠治疗前后肿瘤变化。
表1 裸鼠体内成瘤情况及治疗前后肿瘤变化(
±s)
Tab 1 Tumors igenesis and volume changes of tumor before and
after ACV treatment in nude mice(±s) Cells inoculated
, 百拇医药
Number of cells
(1×107)
Incidence of
tumor
Time of tumor
formation(d)
Volume of tumor (mm3)
Pre-treatment
Post-treatment
A549-TK
, http://www.100md.com 1.0
12/12
7±3
224±151
258±167
A549
1.0
12/12
6±2
243±173
953±412*
*：P<0.01 vs pre-treatment
, http://www.100md.com
从表1中可看出，裸鼠皮下接种1×107个细胞(A549-TK或A549)，100%能长出肿瘤,平均长出肉眼可见肿瘤时间，A549-TK为(7±3) d，A549为(6±2) d，两种瘤细胞接种裸鼠后成瘤时间差别不显著(P>0.05)。A549-TK细胞接种的肿瘤ACV治疗后体积变化不明显(P>0.05)。A549细胞接种的肿瘤ACV治疗后体积明显大于治疗前(P<0.01)。
图1 裸鼠治疗前后体积变化情况
Fig 1 Changes of tumor volume before and after ACV
treatment in nude mice
从图1中可看出，右侧肿瘤(A549)治疗后体积明显大于治疗前(P<0.01)。左侧肿瘤(A549-TK)治疗前后体积变化不明显(P<0.005)。
, http://www.100md.com
2.2 肿瘤组织学观察
A549-TK细胞接种的肿瘤经ACV治疗后，组织切片中有散在小片状坏死区，细胞形态结构模糊不清，胞核裂解、消失。A549细胞接种的肿瘤经ACV治疗后，组织切片中细胞形态结构均正常。见图2, 图3。
图2 A549-TK细胞成瘤经ACV治疗的组织学变化 (HE×400)
Fig 2 Morphological changes of A549-TK cells inoculated tumors after ACV treatment (HE×400)
图3 A549细胞成瘤经ACV治疗的组织学变化 (HE×400)
, 百拇医药
Fig 3 Morphological changes of A549 cells inoculated tumors after ACV treatment (HE×400)
3 讨论
近10年来，TK基因在体内进行了很多肿瘤的治疗实验，虽然报道不一，但转基因细胞都不同程度获得了对ACV的敏感性，能使动物体内的肿瘤停止生长、退化或完全消失[2，3]。我们应用肺腺癌细胞转TK基因后接种裸鼠皮下，与亲代细胞对照，腹腔给予ACV注射，能使A549-TK细胞接种的肿瘤停止生长，治疗前后体积变化不明显(P<0.05)，而亲代细胞接种所形成的肿瘤则明显增大(P<0.01)，不受治疗影响。虽然不能达到使肿瘤退化或消失，但也说明在体内可以抑制肿瘤生长。
目前，活体内基因转移有3种方式：①向肿瘤组织内注射病毒上清液；②向肿瘤内注射包装细胞；③用表达TK基因的肿瘤细胞直接接种。我们采用第3种方式，应该说肿瘤组织细胞全部表达TK基因，而前两种方式还存在病毒感染效率低下的问题，所以表达细胞阳性率不会太高。我们所采用的细胞转TK基因后对ACV的敏感性比亲代细胞提高40多倍，与Smythe[3]报道的相似。A549细胞本身对ACV极不敏感。一般大多数研究者报道不同类型的肿瘤细胞转TK基因后，对GCV(丙氧鸟苷)或ACV的敏感性比亲代细胞提高102-3倍，因此我们的治疗效果受到限制。肿瘤组织病理检查结果表明A549-TK细胞形成的肿瘤ACV治疗后组织中明显出现细胞坏死，组织结构模糊不清，而A549细胞接种的肿瘤细胞、组织结构完全正常，进一步说明ACV诱导了活体内转TK基因的肺癌细胞死亡。TK基因杀灭肿瘤细胞，特别是活体内肿瘤组织细胞的机制除TK酶外，特异性主动免疫反应起了主要作用[4，5]。TK基因表达细胞被ACV作用后产生凋亡，这种凋亡细胞分泌细胞因子如IL-1、TNFα等进入肿瘤组织，导致免疫活性细胞如CD4+、CD8+、NK等细胞聚集，这些免疫活性细胞也释放细胞因子，导致肿瘤组织出血坏死，局部出现炎症反应，单核细胞侵润，免疫调节分子如B7-1、B7-2、ICAM等表达上调，使肿瘤组织局部微环境由免疫抑制变为免疫激发状态，所以说ACV的毒性作用仅表现在早期对TK表达细胞的杀伤，而机体的免疫反应在这一体系中发挥了持久的抗肿瘤作用。
, http://www.100md.com
作者简介： 何祥梁(1964-)，男，江西省瑞昌县人，博士，主治医师，讲师，主要从事肺癌基因治疗方面的研究，发表论文10篇，现在第一军医大学附属珠江医院呼吸内科，广州 510282。电话： (020)85143373
参考文献：
[1] Caruso M, Panis Y, Gagandeep S, et al. Regression of established macroscopic liver metastases after in situ transduction of a suicide gene[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1993,90(8):7 024-7 029.
[2] Lvarez R D, Curile D T. A phaseⅠstudy of recombinant adenovirus vector-mediated intraperitoneal delivery of HSV-TK gene and intravenous gancciclovir for previously treated ovarian and extraovarian cancer patient[J]. Human Gene Therapy,1997,8(3):283-287.
, 百拇医药
[3] Smythe W R, Hwang H C, Elshami A A， et al. Differential sensitivity of thoracic malignant tumors to adenovirus-mediated drug sensitization gene therapy[J]. J Thorac Cardiovascular Surg，1995,109(4):626-630.
[4] Ramesh R, Marrogi A J, Munshi A， et al. In vivo analysis of the bystander effect:a cytokine cascade[J]. Exp Hematol, 1996,24(7):829-838.
[5] Freeman S M, Ramesh R, Marrogi A J， et al.Immune system in suicide-gene therapy[J]. Lancet, 1997,394(9 044)：2-3.
收稿日期： 1999-10-11；修回日期：2000-05-21, 百拇医药
单位：何祥梁(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037)；郭先健(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037)
关键词：肺癌；HSV1-TK基因；基因治疗；无环鸟苷；腺癌
第三军医大学学报000816
提 要： 目的 观察活体内转TK基因肺腺癌细胞对ACV(无环鸟苷)的敏感性。方法 转TK基因肺腺癌细胞A549-TK、亲代细胞A549分别接种于裸鼠腹部皮下左右侧成瘤后,给予腹腔注射ACV治疗2周，测量治疗前后肿瘤大小，并做病理观察。 结果 A549-TK细胞接种的肿瘤治疗前后体积增大不明显(P>0.05);A549细胞接种的肿瘤治疗后体积明显大于治疗前，光镜发现A549-TK细胞接种的肿瘤有局部坏死，胞核裂解、消失。结论 转TK基因肺腺癌细胞接种裸鼠所形成的肿瘤能被ACV治疗抑制生长。
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中图法分类号： R730.261;R730.59;R734.2 文献标识码： A
文章编号：1000-5404(2000)08-0766-03
Study of ACV treatment of subcutaneous tumors induced with inoculation of pulmonary adenocarcinoma cells A549-TK in nude mice
HE Xiang-liang, GUO Xian-jian
(Instittue of Respiratory Disease, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037, China)
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Abstract： Objective To observe the sensitivity of pulmonary adenocarcinoma cell A549 transfected with TK gene to acyclovir ACV in nude mice. Methods A549-TK, A549-cells were inoculated into left and right abdominal wall in nude mice respectively. When the tumors grew to certain volume, animals were treated with ACV injection into the abdominal cavity for 2 weeks, the diameter of tumor was measured before and after ACV treatment. The tumor tissues were examined pathologically with light microscope. Results The tumors induced with inoculation of A549-TK cells showed no significant increase of their volume after ACV treatment (P>0.05) but those induced with inoculation of A549 cells demonstrated an obvious increase in their volume after treatment. Light microscopy revealed local necrosis, karyoklasis and nuclear disappearance. Conclusion The growth of tumor induced with inoculation of A549-TK cells could be inhibited with ACV treatment in nude mice.
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Key words: pulmonary carcinoma; TK gene; gene therapy; acyclovir; adenocarcinoma
TK基因作为研究最多的自杀基因，已进行了多种肿瘤体内外治疗研究，美国FDA早已批准该基因可以进入临床治疗试验，如脑胶质瘤、黑色素瘤、卵巢癌等。为了探索该基因治疗肺癌的效果， 旨在为该基因进入临床治疗肺癌奠定基础， 我们将TK基因转入人肺腺癌细胞A549在裸鼠体内进行试验，现报告如下。
1 材料与方法
RPMI1640、0.25%胰蛋白酶均为Gibco公司产品，ACV为进口分装。A549-TK、 A549均为作者转染保存，BALB/c裸小鼠购于第三军医大学实验动物中心。
取对数生长中晚期A549-TK、A549 2种细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，用PBS洗2遍,离心，留细胞沉淀，用无血清的RPMI1640培养基重悬细胞，细胞密度达5×107/ml BALB/c裸小鼠9只(第1批6只，第2批3只)，雌雄不拘，4～5周龄，平均重量为(19.8±1.5)g,确定左右侧分别接种A549-TK、A549细胞，每个点接种细胞107/0.2 ml，其中3只裸鼠各接种4个点，另6只裸鼠每只接种2个点。自接种之日起每天观察肿瘤结节生长情况，待大部分肿瘤在(0.5～1)cm×(0.5～1)cm(长×宽)之间，开始治疗，按ACV 100 mg.kg-1.d-1，腹腔注射，每天上下午各1次，连续2周。治疗前及治疗结束时均用卡尺测量肿瘤长宽，并拍照。肿瘤体积按V=1/2((长2×宽) mm3公式计算，肿瘤体积大小用配对计量资料Student′s t检验分析。病理观察：治疗结束后无菌取出肿瘤组织，10%福尔马林固定24 h ，石蜡包埋切片，HE染色，普通光镜下观察，请病理专家鉴定。
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2 结果
2.1 裸鼠体内成瘤情况及治疗前后肿瘤大小的变化
将A549-TK,A549 2种瘤细胞接种裸鼠后成瘤时间、肿瘤发生频率、ACV治疗前后体积分别进行统计，见表1。裸鼠体内成瘤见图1，表示其中1只裸鼠治疗前后肿瘤变化。
表1 裸鼠体内成瘤情况及治疗前后肿瘤变化(
±s)Tab 1 Tumors igenesis and volume changes of tumor before and
after ACV treatment in nude mice(
±s) Cells inoculated, 百拇医药
Number of cells
(1×107)
Incidence of
tumor
Time of tumor
formation(d)
Volume of tumor (mm3)
Pre-treatment
Post-treatment
A549-TK
, http://www.100md.com 1.0
12/12
7±3
224±151
258±167
A549
1.0
12/12
6±2
243±173
953±412*
*：P<0.01 vs pre-treatment
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从表1中可看出，裸鼠皮下接种1×107个细胞(A549-TK或A549)，100%能长出肿瘤,平均长出肉眼可见肿瘤时间，A549-TK为(7±3) d，A549为(6±2) d，两种瘤细胞接种裸鼠后成瘤时间差别不显著(P>0.05)。A549-TK细胞接种的肿瘤ACV治疗后体积变化不明显(P>0.05)。A549细胞接种的肿瘤ACV治疗后体积明显大于治疗前(P<0.01)。
图1 裸鼠治疗前后体积变化情况
Fig 1 Changes of tumor volume before and after ACV
treatment in nude mice
从图1中可看出，右侧肿瘤(A549)治疗后体积明显大于治疗前(P<0.01)。左侧肿瘤(A549-TK)治疗前后体积变化不明显(P<0.005)。
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2.2 肿瘤组织学观察
A549-TK细胞接种的肿瘤经ACV治疗后，组织切片中有散在小片状坏死区，细胞形态结构模糊不清，胞核裂解、消失。A549细胞接种的肿瘤经ACV治疗后，组织切片中细胞形态结构均正常。见图2, 图3。
图2 A549-TK细胞成瘤经ACV治疗的组织学变化 (HE×400)
Fig 2 Morphological changes of A549-TK cells inoculated tumors after ACV treatment (HE×400)
图3 A549细胞成瘤经ACV治疗的组织学变化 (HE×400)
, 百拇医药
Fig 3 Morphological changes of A549 cells inoculated tumors after ACV treatment (HE×400)
3 讨论
近10年来，TK基因在体内进行了很多肿瘤的治疗实验，虽然报道不一，但转基因细胞都不同程度获得了对ACV的敏感性，能使动物体内的肿瘤停止生长、退化或完全消失[2，3]。我们应用肺腺癌细胞转TK基因后接种裸鼠皮下，与亲代细胞对照，腹腔给予ACV注射，能使A549-TK细胞接种的肿瘤停止生长，治疗前后体积变化不明显(P<0.05)，而亲代细胞接种所形成的肿瘤则明显增大(P<0.01)，不受治疗影响。虽然不能达到使肿瘤退化或消失，但也说明在体内可以抑制肿瘤生长。
目前，活体内基因转移有3种方式：①向肿瘤组织内注射病毒上清液；②向肿瘤内注射包装细胞；③用表达TK基因的肿瘤细胞直接接种。我们采用第3种方式，应该说肿瘤组织细胞全部表达TK基因，而前两种方式还存在病毒感染效率低下的问题，所以表达细胞阳性率不会太高。我们所采用的细胞转TK基因后对ACV的敏感性比亲代细胞提高40多倍，与Smythe[3]报道的相似。A549细胞本身对ACV极不敏感。一般大多数研究者报道不同类型的肿瘤细胞转TK基因后，对GCV(丙氧鸟苷)或ACV的敏感性比亲代细胞提高102-3倍，因此我们的治疗效果受到限制。肿瘤组织病理检查结果表明A549-TK细胞形成的肿瘤ACV治疗后组织中明显出现细胞坏死，组织结构模糊不清，而A549细胞接种的肿瘤细胞、组织结构完全正常，进一步说明ACV诱导了活体内转TK基因的肺癌细胞死亡。TK基因杀灭肿瘤细胞，特别是活体内肿瘤组织细胞的机制除TK酶外，特异性主动免疫反应起了主要作用[4，5]。TK基因表达细胞被ACV作用后产生凋亡，这种凋亡细胞分泌细胞因子如IL-1、TNFα等进入肿瘤组织，导致免疫活性细胞如CD4+、CD8+、NK等细胞聚集，这些免疫活性细胞也释放细胞因子，导致肿瘤组织出血坏死，局部出现炎症反应，单核细胞侵润，免疫调节分子如B7-1、B7-2、ICAM等表达上调，使肿瘤组织局部微环境由免疫抑制变为免疫激发状态，所以说ACV的毒性作用仅表现在早期对TK表达细胞的杀伤，而机体的免疫反应在这一体系中发挥了持久的抗肿瘤作用。
, http://www.100md.com
作者简介： 何祥梁(1964-)，男，江西省瑞昌县人，博士，主治医师，讲师，主要从事肺癌基因治疗方面的研究，发表论文10篇，现在第一军医大学附属珠江医院呼吸内科，广州 510282。电话： (020)85143373
参考文献：
[1] Caruso M, Panis Y, Gagandeep S, et al. Regression of established macroscopic liver metastases after in situ transduction of a suicide gene[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1993,90(8):7 024-7 029.
[2] Lvarez R D, Curile D T. A phaseⅠstudy of recombinant adenovirus vector-mediated intraperitoneal delivery of HSV-TK gene and intravenous gancciclovir for previously treated ovarian and extraovarian cancer patient[J]. Human Gene Therapy,1997,8(3):283-287.
, 百拇医药
[3] Smythe W R, Hwang H C, Elshami A A， et al. Differential sensitivity of thoracic malignant tumors to adenovirus-mediated drug sensitization gene therapy[J]. J Thorac Cardiovascular Surg，1995,109(4):626-630.
[4] Ramesh R, Marrogi A J, Munshi A， et al. In vivo analysis of the bystander effect:a cytokine cascade[J]. Exp Hematol, 1996,24(7):829-838.
[5] Freeman S M, Ramesh R, Marrogi A J， et al.Immune system in suicide-gene therapy[J]. Lancet, 1997,394(9 044)：2-3.
收稿日期： 1999-10-11；修回日期：2000-05-21, 百拇医药