Hela/MMC细胞亚系的建立及其耐药机制的探讨
作者：李萍 陈红 陈惠祯
单位：李萍(湖北医科大学附属二院妇产科和肿瘤科，武汉 430071)；陈红(湖北医科大学附属二院妇产科和肿瘤科，武汉 430071)；陈惠祯(湖北医科大学附属二院妇产科和肿瘤科，武汉 430071)
关键词：药物耐受性；宫颈肿瘤；细胞系；丝裂霉素C
第三军医大学学报000822
提 要： 目的 建立宫颈癌Hela/MMC耐药细胞亚系，并探讨其耐药机制。方法 以人宫颈癌Hela细胞为亲本，采用丝裂霉素连续性药物作用，间隙性增加药量，逐步提高药物浓度的方法，分离出MMC耐药亚系(Hela/MMC)，并比较两种细胞生物学特性差异。结果 Hela/MMC细胞对MMC有5.02倍耐药，对DDP有2.03倍交叉耐药，对VCR、ADM和5-Fu保持敏感；耐药细胞核分裂指数增加；耐药细胞内丝裂霉素蓄积量比亲代细胞低32.64%(P<0.01)。DNA链间交联指数降低51.91%(P<0.01)。结论 耐药细胞Hela/MMC具有多药耐药特性且生长增殖能力强于亲代细胞，其对MMC耐药性与细胞内药物浓度降低和DNA链间交联减少有关。
, 百拇医药
中图法分类号： R329.24;R915;R979.14 文献标识码： A
文章编号：1000-5404(2000)08-0787-03
Study of establishment of Hela/MMC cell subline and its mechanism of drug-resistance
LI Ping, CHEN Hong, CHEN Hui-zheng
(Department of Obstetrics and Gynecology, Second Affiliated Hospital, Hubei Medical University, Wuhan 430071,China)
Abstract： Objective To establish Hela/MMC cell subline of human cervical cancer and study the mechanism of its drug-resistance. Methods Hela cells of human cervical cancer were cultured with mitomycin C (MMC) in gradually increased dosage in order to obtain a drug-resistant Hela/MMC cell subline. The biological properties of Hela and Hela/MMC cells were compared and the mechanism of drug-resistance of Hela/MMC cells studied. Results Hela/MMC cells possessed the ability of 5.02 fold resistance to MMC and 2.03 fold cross-resistance to Capsulation (DDP) and maintain the sensitivity to vincristine (VCR), adriamycin (ADM) and 5-flurouracil (5-Fu). Mitotic index of the MMC-resistant cells was increased. Intracellular mitomycin accumulation was 32.64% lower in Hela/MMC cells than in Hela cells (P<0.01). DNA interstrand cross-link formation was reduced by 51.91% in Hela/MMC cells (P<0.01). Conclusion Hela/MMC cells are drug-resistant and have stronger proliferation than Hela cells. Its resistance to MMC might be due to the decrease of intracellular drug concentration and the DNA interstrand cross-links.
, 百拇医药
Key words： drug-resistance; cervical neoplasm; cell line; mitomycin C
我们以宫颈癌Hela细胞为亲本，分离筛选出耐丝裂霉素耐药亚系Hela/MMC，初步探讨了其生物学特性和耐药机制，报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
宫颈癌Hela细胞由湖北省医学科学院病毒研究所提供。Hybri-care培养液由武汉大学生物保藏中心提供；丝裂霉素为日本协和发酵工业株式会社产品；长春新碱(VCR)为上海第十二制药厂生产；阿霉素(ADM)是意大利爱宝制药厂生产；5-氟脲嘧啶为上海旭东海浦药业有限公司生产；顺铂(DDP)为中国齐鲁制药厂生产；溴化二甲噻唑二苯四氮唑(MTT)为美国Sigma公司产品。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1耐药细胞分离及生物学特性研究。
1.2.1.1 Hela细胞培养 Hela细胞常规培养于Hybri-care培养基中，隔天换液1次，每周传代2次，细胞贴壁生长。
1.2.1.2 Hela/MMC耐药亚系的分离 Hela细胞培养液中加入MMC 0.5 ng/ml，每2～3周递增0.5 ng/ml至6.0 ng/ml，细胞于含MMC 6.0 ng/ml的培养液中贴壁生长良好1月，为Hela/MMC耐药亚系。进行下列每项生物实验前1周去药。
1.2.1.3 耐药性检测 采用MTT法，具体方法见文献[1]。
1.2.1.4 核分裂指数 将亲代和耐药细胞(1×105/ml)接种于有盖玻片的培养瓶中，按常规方法检测核分裂指数[2]。
, 百拇医药
1.2.2 Hela/MMC细胞耐药机制研究
1.2.2.1 细胞内MMC蓄积量测定 采用高效液相色谱法(HPLC)[3]，①回收实验：取1.0 ml未处理细胞样液多份(1×106/ml)，加8 μg/ml MMC 10、20、30、40、50 μl，加2 ml甲醇吹干，残渣以PBS定容0.1 ml，取2.0 μl进HPLC。以峰高对浓度作线性回归，回归方程为C(ng/ml)=0.138+0.081H(mm),r=0.9933。②样品检测：亲代和耐药细胞培养72 h后，分别给MMC 10、20、40 μl/ml，重复4次，1 h后弃培养液，PBS洗，胰酶消化，调细胞浓度为1×106/ml，冻融法破碎细胞，取细胞样液1 ml，按回收实验方法作高效液相色谱检测前处理，样品MMC浓度按回归方程计算而得。
1.2.2.2 DNA链间交联检测 参照Jong法[4]。
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2 结果
2.1 Hela/MMC细胞耐药性
与亲代Hela细胞相比，Hela/MMC细胞对MMC有5.02倍耐药，对顺铂有2.03倍交叉耐药，而对阿霉素、长春新碱及5-氟脲嘧啶保持敏感。该细胞在无MMC培养液中传代4个月，耐药性基本保持不变，见表1。
表1 Hela和Hela/MMC细胞对不同化疗
药物IC50(nmol)
Tab 1 IC50 of different drugs for Hela and Hela/MMC
Cell line(nmol) Cell line and
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resistance index
MMC
DDP
ADM
VCR
5-Fu
Hela
194.42
168.16
147.19
1.40
2995.80
Hela/MMC
, 百拇医药
975.10
341.36
110.39
1.10
1921.92
RI
5.02
2.03
0.75
0.79
0.64
2.2 核分裂指数见图1
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图1 Hela和Hela/MMC细胞核分裂指数曲线
Fig 1 Mitotic index curves of Hela and
Hela/MMC cell line
2.3 Hela和Hela/MMC细胞内MMC蓄积量，见表2
表2 Hela和Hela/MMC细胞内MMC蓄积量
比较(nmol/106,
±s)
Tab 2 Cummulative value of intracellular mitomycin C in
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Hela and Hela/MMC cell line(nmol/106,±s) MMC(μg/ml)
n
Hela
Hela/MMC
10
4
131.513±34.035
101.848±10.987
20
4
, http://www.100md.com
277.460±15.914
259.998±32.468
40
4
838.675±147.784
564.945±93.243*
*：P<0.05 vs Hela cell
2.4 DNA链间交联检测
Hela细胞DNA链间交联指数为13.10±1.39,耐药细胞为6.30±1.04，比亲代细胞下降了51.91%(P<0.01)。
3 讨论
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3.1 耐药细胞亚系的建立及生物学特性
我们分离出的宫颈癌耐MMC耐药亚系Hela/MMC细胞对MMC有5.02倍耐药，对顺铂有2倍交叉耐药，但对ADM、VCR、5-Fu保持敏感，说明Hela/MMC细胞具有多药耐药特性，这对指导临床用药有意义。随着耐药性的产生，耐药细胞分裂指数增大，提示耐药细胞生长增殖能力增强，该现象在Hela/DDP耐药亚系中亦有发现[5]。Hela/MMC耐药亚系将为进一步研究宫颈癌耐药机制和筛选有效的耐药逆转剂提供实验模型。
3.2 宫颈癌对MMC耐药机制初探
丝裂霉素主要通过使DNA交联致DNA合成抑制和介导自由基反应而发挥抗癌效应，其广泛应用于含宫颈癌在内的许多肿瘤，但耐药性的产生限制了它的临床应用。我们实验结果表明，Hela/MMC细胞DNA链间交联百分数比亲代细胞降低了51.91%，说明DNA链间交联减少与宫颈癌对MMC耐药有关，这一现象在其它MMC耐药细胞如P388白血病和膀胱癌细胞中也有发现[6，7]，但耐药细胞中DNA链间交联的减少是否是由于活化药物减少或由于受损的DNA修复增加，有待进一步研究。本实验还发现， 耐药细胞内MMC蓄积量明显低于亲代细胞(P<0.05)，提示细胞内抗癌药物蓄积量降低与宫颈癌对MMC耐药有关，是否涉及其它耐药机制，尚待进一步研究。
, 百拇医药
基金项目：湖北省教委资助课题(960018)
作者简介：李萍(1953-)，女，湖北省武汉市人，副主任医师，副教授，主要从事妇科临床工作方面的研究，发表论文10篇。电话：(027)87317762
参考文献：
[1] Mosman T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays[J].J Immunol Methods,1983,65(1):55-58.
[2] 张静波 主编.细胞生物学实用方法及技术[M].北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1995.53-54.
, http://www.100md.com
[3] Singh S V, Xu B H, Maurya A K, et al. Modulation of mitomycin C resistance by glutathione transferase inhibitor ethacrynic acid[J]. Biochim Biophys Acta,1992,1 137(2):257-263.
[4] De Jong S. Detection of DNA cross-link in tumor cells with the ethidium bromide fluorescence assay[J]. Int J Cancer,1986,37(3):557-561.
[5] 邱志华，彭祥鄂.Hela/DDP细胞亚系的建立及其耐药性改变的探讨[J].湖南医科大学学报，1991，16(1)：15-18.
[6] Xu B H, Singh S V. Effect of buthionine sulfoximine and ethacrynic acid on cytotoxic activity of mitomycin C analogues BMY 25282 and BMY 25067[J]. Cancer Res,1992,52(12):6 666-6 670.
[7] Xu B H, Gupta V, Singh S V, et al. Mechnism of differential sensitivity of human bladder cancer cell to mitomycin C and its analogue[J]. Br J Cancer,1994,69(7):242-246.
收稿日期：2000-01-05；修回日期：2000-04-25, 百拇医药
单位：李萍(湖北医科大学附属二院妇产科和肿瘤科，武汉 430071)；陈红(湖北医科大学附属二院妇产科和肿瘤科，武汉 430071)；陈惠祯(湖北医科大学附属二院妇产科和肿瘤科，武汉 430071)
关键词：药物耐受性；宫颈肿瘤；细胞系；丝裂霉素C
第三军医大学学报000822
提 要： 目的 建立宫颈癌Hela/MMC耐药细胞亚系，并探讨其耐药机制。方法 以人宫颈癌Hela细胞为亲本，采用丝裂霉素连续性药物作用，间隙性增加药量，逐步提高药物浓度的方法，分离出MMC耐药亚系(Hela/MMC)，并比较两种细胞生物学特性差异。结果 Hela/MMC细胞对MMC有5.02倍耐药，对DDP有2.03倍交叉耐药，对VCR、ADM和5-Fu保持敏感；耐药细胞核分裂指数增加；耐药细胞内丝裂霉素蓄积量比亲代细胞低32.64%(P<0.01)。DNA链间交联指数降低51.91%(P<0.01)。结论 耐药细胞Hela/MMC具有多药耐药特性且生长增殖能力强于亲代细胞，其对MMC耐药性与细胞内药物浓度降低和DNA链间交联减少有关。
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中图法分类号： R329.24;R915;R979.14 文献标识码： A
文章编号：1000-5404(2000)08-0787-03
Study of establishment of Hela/MMC cell subline and its mechanism of drug-resistance
LI Ping, CHEN Hong, CHEN Hui-zheng
(Department of Obstetrics and Gynecology, Second Affiliated Hospital, Hubei Medical University, Wuhan 430071,China)
Abstract： Objective To establish Hela/MMC cell subline of human cervical cancer and study the mechanism of its drug-resistance. Methods Hela cells of human cervical cancer were cultured with mitomycin C (MMC) in gradually increased dosage in order to obtain a drug-resistant Hela/MMC cell subline. The biological properties of Hela and Hela/MMC cells were compared and the mechanism of drug-resistance of Hela/MMC cells studied. Results Hela/MMC cells possessed the ability of 5.02 fold resistance to MMC and 2.03 fold cross-resistance to Capsulation (DDP) and maintain the sensitivity to vincristine (VCR), adriamycin (ADM) and 5-flurouracil (5-Fu). Mitotic index of the MMC-resistant cells was increased. Intracellular mitomycin accumulation was 32.64% lower in Hela/MMC cells than in Hela cells (P<0.01). DNA interstrand cross-link formation was reduced by 51.91% in Hela/MMC cells (P<0.01). Conclusion Hela/MMC cells are drug-resistant and have stronger proliferation than Hela cells. Its resistance to MMC might be due to the decrease of intracellular drug concentration and the DNA interstrand cross-links.
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Key words： drug-resistance; cervical neoplasm; cell line; mitomycin C
我们以宫颈癌Hela细胞为亲本，分离筛选出耐丝裂霉素耐药亚系Hela/MMC，初步探讨了其生物学特性和耐药机制，报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
宫颈癌Hela细胞由湖北省医学科学院病毒研究所提供。Hybri-care培养液由武汉大学生物保藏中心提供；丝裂霉素为日本协和发酵工业株式会社产品；长春新碱(VCR)为上海第十二制药厂生产；阿霉素(ADM)是意大利爱宝制药厂生产；5-氟脲嘧啶为上海旭东海浦药业有限公司生产；顺铂(DDP)为中国齐鲁制药厂生产；溴化二甲噻唑二苯四氮唑(MTT)为美国Sigma公司产品。
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1.2 方法
1.2.1耐药细胞分离及生物学特性研究。
1.2.1.1 Hela细胞培养 Hela细胞常规培养于Hybri-care培养基中，隔天换液1次，每周传代2次，细胞贴壁生长。
1.2.1.2 Hela/MMC耐药亚系的分离 Hela细胞培养液中加入MMC 0.5 ng/ml，每2～3周递增0.5 ng/ml至6.0 ng/ml，细胞于含MMC 6.0 ng/ml的培养液中贴壁生长良好1月，为Hela/MMC耐药亚系。进行下列每项生物实验前1周去药。
1.2.1.3 耐药性检测 采用MTT法，具体方法见文献[1]。
1.2.1.4 核分裂指数 将亲代和耐药细胞(1×105/ml)接种于有盖玻片的培养瓶中，按常规方法检测核分裂指数[2]。
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1.2.2 Hela/MMC细胞耐药机制研究
1.2.2.1 细胞内MMC蓄积量测定 采用高效液相色谱法(HPLC)[3]，①回收实验：取1.0 ml未处理细胞样液多份(1×106/ml)，加8 μg/ml MMC 10、20、30、40、50 μl，加2 ml甲醇吹干，残渣以PBS定容0.1 ml，取2.0 μl进HPLC。以峰高对浓度作线性回归，回归方程为C(ng/ml)=0.138+0.081H(mm),r=0.9933。②样品检测：亲代和耐药细胞培养72 h后，分别给MMC 10、20、40 μl/ml，重复4次，1 h后弃培养液，PBS洗，胰酶消化，调细胞浓度为1×106/ml，冻融法破碎细胞，取细胞样液1 ml，按回收实验方法作高效液相色谱检测前处理，样品MMC浓度按回归方程计算而得。
1.2.2.2 DNA链间交联检测 参照Jong法[4]。
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2 结果
2.1 Hela/MMC细胞耐药性
与亲代Hela细胞相比，Hela/MMC细胞对MMC有5.02倍耐药，对顺铂有2.03倍交叉耐药，而对阿霉素、长春新碱及5-氟脲嘧啶保持敏感。该细胞在无MMC培养液中传代4个月，耐药性基本保持不变，见表1。
表1 Hela和Hela/MMC细胞对不同化疗
药物IC50(nmol)
Tab 1 IC50 of different drugs for Hela and Hela/MMC
Cell line(nmol) Cell line and
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resistance index
MMC
DDP
ADM
VCR
5-Fu
Hela
194.42
168.16
147.19
1.40
2995.80
Hela/MMC
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975.10
341.36
110.39
1.10
1921.92
RI
5.02
2.03
0.75
0.79
0.64
2.2 核分裂指数见图1
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图1 Hela和Hela/MMC细胞核分裂指数曲线
Fig 1 Mitotic index curves of Hela and
Hela/MMC cell line
2.3 Hela和Hela/MMC细胞内MMC蓄积量，见表2
表2 Hela和Hela/MMC细胞内MMC蓄积量
比较(nmol/106,
±s)Tab 2 Cummulative value of intracellular mitomycin C in
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Hela and Hela/MMC cell line(nmol/106,
±s) MMC(μg/ml)n
Hela
Hela/MMC
10
4
131.513±34.035
101.848±10.987
20
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277.460±15.914
259.998±32.468
40
4
838.675±147.784
564.945±93.243*
*：P<0.05 vs Hela cell
2.4 DNA链间交联检测
Hela细胞DNA链间交联指数为13.10±1.39,耐药细胞为6.30±1.04，比亲代细胞下降了51.91%(P<0.01)。
3 讨论
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3.1 耐药细胞亚系的建立及生物学特性
我们分离出的宫颈癌耐MMC耐药亚系Hela/MMC细胞对MMC有5.02倍耐药，对顺铂有2倍交叉耐药，但对ADM、VCR、5-Fu保持敏感，说明Hela/MMC细胞具有多药耐药特性，这对指导临床用药有意义。随着耐药性的产生，耐药细胞分裂指数增大，提示耐药细胞生长增殖能力增强，该现象在Hela/DDP耐药亚系中亦有发现[5]。Hela/MMC耐药亚系将为进一步研究宫颈癌耐药机制和筛选有效的耐药逆转剂提供实验模型。
3.2 宫颈癌对MMC耐药机制初探
丝裂霉素主要通过使DNA交联致DNA合成抑制和介导自由基反应而发挥抗癌效应，其广泛应用于含宫颈癌在内的许多肿瘤，但耐药性的产生限制了它的临床应用。我们实验结果表明，Hela/MMC细胞DNA链间交联百分数比亲代细胞降低了51.91%，说明DNA链间交联减少与宫颈癌对MMC耐药有关，这一现象在其它MMC耐药细胞如P388白血病和膀胱癌细胞中也有发现[6，7]，但耐药细胞中DNA链间交联的减少是否是由于活化药物减少或由于受损的DNA修复增加，有待进一步研究。本实验还发现， 耐药细胞内MMC蓄积量明显低于亲代细胞(P<0.05)，提示细胞内抗癌药物蓄积量降低与宫颈癌对MMC耐药有关，是否涉及其它耐药机制，尚待进一步研究。
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基金项目：湖北省教委资助课题(960018)
作者简介：李萍(1953-)，女，湖北省武汉市人，副主任医师，副教授，主要从事妇科临床工作方面的研究，发表论文10篇。电话：(027)87317762
参考文献：
[1] Mosman T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays[J].J Immunol Methods,1983,65(1):55-58.
[2] 张静波 主编.细胞生物学实用方法及技术[M].北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1995.53-54.
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[3] Singh S V, Xu B H, Maurya A K, et al. Modulation of mitomycin C resistance by glutathione transferase inhibitor ethacrynic acid[J]. Biochim Biophys Acta,1992,1 137(2):257-263.
[4] De Jong S. Detection of DNA cross-link in tumor cells with the ethidium bromide fluorescence assay[J]. Int J Cancer,1986,37(3):557-561.
[5] 邱志华，彭祥鄂.Hela/DDP细胞亚系的建立及其耐药性改变的探讨[J].湖南医科大学学报，1991，16(1)：15-18.
[6] Xu B H, Singh S V. Effect of buthionine sulfoximine and ethacrynic acid on cytotoxic activity of mitomycin C analogues BMY 25282 and BMY 25067[J]. Cancer Res,1992,52(12):6 666-6 670.
[7] Xu B H, Gupta V, Singh S V, et al. Mechnism of differential sensitivity of human bladder cancer cell to mitomycin C and its analogue[J]. Br J Cancer,1994,69(7):242-246.
收稿日期：2000-01-05；修回日期：2000-04-25, 百拇医药