细胞因子及内皮细胞游走与川崎病发病的关系
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作者：刘亚黎 胡晓华 黄显香
单位：同济医科大学附属协和医院小儿科 武汉，430022
关键词：川崎病；丙种球蛋白；细胞因子；内皮细胞游走
临床心血管病杂志000814 摘要 目的：探讨川崎病的发病与细胞因子、内皮细胞游走的关系。方法：用ELISA双抗夹心法和改良Boyden法，检测28例川崎病急性期及丙种球蛋白治疗后患儿的血浆细胞因子含量变化及其对内皮细胞游走的影响，并与10例健康儿童对照。结果：在川崎病急性期时，白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、γ干扰素(IFN-γ)等蛋白含量明显增高，用丙种球蛋白治疗后下降；试管内加入上述细胞因子使得内皮细胞的游走明显增加。结论：川崎病急性期时，细胞因子的产生具有加速内皮细胞游走，破坏动脉内膜，诱发动脉炎的作用，而丙种球蛋白的治疗效应与其能抑制内皮细胞游走有密切关系。
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A study on cytokines activity and endothelial cells
migration in Kawasaki disease
LIU Ya-li，HU Xiao-hua，HUANG Xian-xiang
(Department of Pediatrics,Union Hospital,Tongji Medical University,Wuhan 430022)
Abstract Objective:To investigate the cytokines activity and human umbilical vein cell migration (tHUE) in Kawasaki disease.Method:The levels of cytokines and migration of endothelial cells in plasma from 28 patients with Kawasaki disease were examined by ELISA and modified Boyden chamber methods and compared with those of 10 normal children.Result:IFN-γ,TNF-α,IL-1β and IL-6 levels were significantly higher than normal controls.Also the plasma markedly enhanced the migration of tHUE cells.Migration index showed decrease after γ-globulin treatment.Conclusion:Cytokines are important in destroying vessel walls with Kawasaki disease by enhancing the migration of endothelial cells;γ-globulin may be therapeutical effect for this disease by suppressing this endothelial cell migration.
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Key words Kawasaki disease γ-globulin Cytokines Endothelial cells migration
川崎病的主要病理变化是全身性多发性动脉炎，尤以冠状动脉的损害直接危及患者的生命。本文动态研究了川崎病患儿丙种球蛋白治疗前后血浆细胞因子的变化及其对内皮细胞游走的影响，以探讨与发病的关系。
1 对象与方法
1.1 对象
1994年3月～1996年3月在日本京都府立医科大学小儿疾病研究所住院及出院后追踪观察的28例川崎病患儿，年龄3个月～6岁，均符合日本川崎病研究班制定的临床诊断标准。28例分为3组：A组：发病7 d内，平均5 d，未用丙种球蛋白治疗，确诊后立即采血；B组：发病8～14 d，平均12 d，确诊后每天用丙种球蛋白1 g/kg治疗2 d，5 d后采血；C组：发病15～60 d，平均35 d，治疗同B组，治疗30 d后采血。标本离心、分装后保存在-80℃条件下待用。对照(D)组为10例健康儿童，年龄1～6岁，血浆标本的处理同前。
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1.2 细胞因子的测定
γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的测定使用双抗体夹心ELISA法。药盒使用美国Endogen Inc公司制品，按药盒说明操作。
1.3 内皮细胞株的培养及游走性测定
内皮细胞使用人脐静脉内皮细胞株(tHUE)。用含10%小牛血清，2 ml L-谷酰胺，60 g/L卡那霉素的DMEM培养液，放入37℃、5%CO2的温箱内培养，细胞附壁长满后调至使用浓度。
内皮细胞游走性的测定使用改良Boyden计数法。细胞的趋化性用8 μm微孔大小的多碳酸盐滤器(Kurabo.Co.Ltd.Osaka)。将1%的患者血浆及D组标本和1%白蛋白各放入滤器的下部分，含2×104 tHUE细胞悬浮液200 μl放入滤器的上部分。然后在37℃，5%CO2的温箱内培养24 h后用70%乙醇固定，苏木精染色，在光学显微镜下对向滤器下部游走的tHUE细胞计数。游走指数=血浆液诱导细胞游走数均值/用1%白蛋白诱导的细胞游走数均值。
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1.4 统计学处理
采用t检验。
2 结果
2.1 川崎病患儿血浆细胞因子的动态变化
川崎病患儿血浆细胞因子的动态变化见表1。
2.2 川崎病患儿血浆细胞因子对内皮细胞游走的影响
用Boyden计数法测定患儿血浆细胞因子对内皮细胞游走的影响，结果显示，急性期A组的血浆加入后使得tHUE的游走指数明显增加(4.38±1.10)，而使用丙种球蛋白治疗后的B组(2.16±0.63)及恢复期的C组tHUE游走指数(0.65±0.12)受到抑制。A组与B、C及D组(0.90±0.09)比较均P<0.01。
表1 川崎病患儿血浆细胞因子的动态变化±s 组别
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IFN-γ/(IU.L-1)
TNF-α/(ng.L-1)
IL-1β/(ng.L-1)
IL-6/(ng.L-1)
A组
0.073±0.0682)
117.92±164.811)
116.24±36.121)
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243.76±239.221)
B组
0.018±0.017
118.10±186.271)
<100
22.68±44.561)
C组
0.014±0.017
<20
<100
4.30±1.12
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D组
<4
<20
<100
<4
与D组比较1) P<0.05，2) P<0.01
3 讨论
虽然川崎病的病因目前还不是十分清楚，但是有研究认为其发病与免疫系统激活有密切关系〔1〕。由于巨噬细胞、T细胞活化，细胞因子释放等，导致了以心血管为中心的多种抗体刺激后的变态反应〔2〕。在这一过程中，内皮细胞的游走与血管壁的损伤是诱发本病的最重要因素，它最终能导致冠状动脉瘤以及内腔狭窄的发生〔3〕。本实验证实，川崎病急性期患儿的血浆能导致内皮细胞的游走与增殖，而用丙种球蛋白治疗后使得tHUE的这种游走与增殖受到抑制。这与川崎病急性期血浆中含有高浓度的IFN-γ，IL-1β，IL-6有关。有报道认为〔4，5〕，有些细胞因子起着游走刺激因子的作用，如IFN-γ、IL-1β、IL-6能参与β细胞多克隆活化，使免疫球蛋白合成增加，产生自身抗体，同时可诱导粘附分子在血管内皮细胞上的表达，导致内皮细胞的损伤及游走，这些因素是启动川崎病动脉炎发生的重要原因。
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现已公认丙种球蛋白是治疗和预防川崎病冠状动脉瘤发生及进展的最有效药物。通过本实验，我们认为它的治疗效应与其能减少细胞因子的释放从而使内皮细胞的游走与增殖受到抑制有密切关系。
参考文献
1，香坂隆夫，小林登.川崎病病因论の变迁.小旧内科，1990，22：1763～1701
2，Leung D Y.The potential role of cytokine-mediated vascular endothelial activation in the pathogenesis of Kawasaki disease.Acta Pediatr Jpn,1991,33:739～744
3，Hoshimoto Y,Yoshinoyo S,Aikawa T.Enhanced endothelial cell proliferation in acute Kawasaki disease.Pediatr Res,1991,59:194～205
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4，Rosen E M,Liu D,Setter E,et al.Interleukin-6 stimulates motility of vascular endothelium.Exp Suppl 1991，59：194～205
5，Mawatari M,Okamura K,Matsuda T,et al.Tumor necrosis factor and epidermal growth factor modulate migration of human microvascular endothelial cells and production of tissue-type plasminogen activator and its inhibitor.Exp Cell Res,1991,192:574～580
(收稿1999-05-08 修回1999-10-18), 百拇医药