组织型纤溶酶原激活物在人大隐静脉组织培养液中的活性变化
刁彦鹏 辛世杰 李玉岩 王丹蓉 王新文 张强 段志泉
摘 要 目的:检测人大隐静脉(human saphenous vein，HSV)组织培养液中组织型纤溶酶原激活物(tissue-type plasminogen activator, t-PA)的活性变化, 及不同浓度纤维蛋白原(fibrinogen, Fg)对t-PA活性的影响, 探讨血管移植后再狭窄发生发展的可能机制。方法：应用EALAS酶标法检测组织培养液中的t-PA活性变化。结果：正常培养HSV第3、5天时的t-PA活性水平均明显低于培养第8、10、12和14天的t-PA水平(P<0.05, P<0.01); 低浓度的Fg (0.5 g/L)对t-PA活性无明显影响; 高浓度的Fg (2.5 g/L或5 g/L)使培养HSV第3、5天时的t-PA活性进一步降低，且降低培养HSV第8、10天时的t-PA活性; 但对培养HSV第12、14天时的t-PA活性无明显影响。结论：血管移植术后早期，移植静脉的低t-PA活性水平与吻合口处的血栓形成相关; 中、晚期的t-PA活性升高则与血管平滑肌细胞的迁移及内膜增生等相关; 较高浓度Fg则具有促进这一过程的作用。
, 百拇医药
关键词：组织型纤溶酶原激活物 人 大隐静脉 纤维蛋白原
组织型纤溶酶原激活物(tissue-type plasminogen activator, t-PA)是由血管内皮细胞合成并分泌的一种丝氨酸蛋白酶。目前的研究表明，t-PA具有促进纤溶酶原转化为纤溶酶、使纤维蛋白降解而具有防治血栓病及血管移植术后血栓形成等作用; 但还具有诱导细胞外基质降解及胶原酶原激活为胶原酶、促使血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMC)的迁移与增殖而不利于防治血管移植术后血管狭窄与血栓形成等作用[1，2]。因此, t-PA在血管移植术后再狭窄的发生发展中的作用是有争议的。本研究应用EALAS酶标法检测培养的人大隐静脉(human saphenous vein, HSV)培养液中的t-PA活性变化, 同时探讨不同浓度的纤维蛋白原(fibrinogen, Fg)对t-PA活性变化的影响。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 仪器与试剂 细胞培养箱(FISHER 公司,美国),酶标测定仪(Model 550 Bio-RAD公司,美国);t-PA活性测定试剂盒(上海医科大学分子遗传室); PRMI 1640培养液(Sigma公司,美国); L-谷氨酰胺(Gioco公司,美国),30%灭活小牛血清(大连生物制品厂), Fg(中美合资上海莱士血液制品有限公司 ), 其它为市售分析纯试剂。
1.2 HSV取材及内皮细胞完整性检测 在9例血管移植手术中取正常大隐静脉(长约2.0 cm),按Soyombo和Karen E的方法进行处理[3,4]。将HSV置于4℃无菌PBS液(pH 7.4)中除去两端及外周结缔组织后, 分成若干0.5 cm×0.5 cm大小的静脉片,并进行内皮细胞完整性检测。检测方法为:随机取一片HVS用0.3% Trypan Blue染色30 s(37℃)、PBS冲洗后观察染色情况。内皮覆盖大于50%者可进行下述实验。
1.3 HSV的培养 将HSV分别置于含不同浓度Fg(0, 0.5, 2.5和5 g/L)的1640培养液中, 于细胞培养箱 (37℃、5% CO2)培养。并分别在培养第3,5,8, 10, 12和14 d时更换并收集培养液。
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1.4 t-PA活性检测 将上述收集的培养液立即加入等体积的酸化液(NaAc-Hac), 4℃ 1000 r/min离心10 min以除去杂质, 上清-80 ℃保存。测定时按t-PA活性测定试剂盒进行,培养液中的t-PA活性用EALAS酶标法测定。首先制备t-PA标准曲线, 根据标准曲线计算出各待测液的t-PA活性。
1.5 统计学分析 所有数据以中位数(全距)表示，用Wilcoxon秩和检验对各组数据进行统计学分析处理。
2 结果
2.1 正常培养液中t-PA活性水平 检测结果表明, 在培养HSV不同时间时的t-PA活性测得值有明显变化。HSV培养第3、5 d的t-PA活性测得值较低,而培养第8、10、12和14 d时t-PA活性值较高。
2.2 不同浓度Fg对HSV培养液t-PA活性的影响 当Fg浓度为较低水平时(0.5 g/L), HSV培养液t-PA活性基本不受影响(P>0.05); 当Fg浓度为较高水平时(2.5和5.0 g/L), 可使培养第3、5 d时的t-PA低活性水平进一步降低, 同时明显降低培养第8、10 d时HSV培养液t-PA的活性水平(P<0.05、P<0.01)，但对培养第12、14 d时HSV培养液t-PA活性水平无明显影响。实验结果见表1。
, 百拇医药
表1 正常HSV培养液t-PA活性水平变化(IU/ml)
Tab. 1 Activity of t-PA in cultured medium of HSV (IU/ml)
培养时间
(d)
Fg浓度(g/L)
0
0.5
2.5
5.0
3
0.277(0.114～0.362)
, 百拇医药
0.258(0.116～0.494)
0.198(0.098～0.256)**
0.102(0.042～0.120)**
5
0.242(0.070～0.356)
0.248(0.130～0.540)
0.177(0.064～0.236)**
0.090(0.043～0.131)**
8
, http://www.100md.com 0.348(0.240～0.639)
0.445(0.261～0.896)
0.172(0.114～0.353)**
0.162(0.114～0.322)**
10
0.363(0.218～0.998)
0.485(0.269～0.755)
0.384(0.227～0.816)
0.206(0.151～0.456)*
, 百拇医药 12
0.384(0.194～0.903)
0.443(0.270～0.918)
0.362(0.199～0.874)
0.362(0.225～1.364)
14
0.377(0.243～0.705)
0.365(0.262～0.886)
0.375(0.253～0.633)
0.323(0.158～0.758)
, 百拇医药 与无Fg组比较：* P<0.05, ** P<0.01
3 讨论
已有研究表明,血管移植术中的内膜损伤是近期的血栓形成与远期的VSMC从中膜向内膜迁移并增殖进而形成移植静脉再狭窄或闭塞的主要原因[5]。自体大隐静脉是心脏架桥术和周围血管移植术的首选替代物,但移植术后移植静脉再狭窄或闭塞的发生发展机制复杂。有关t-PA活性变化以及Fg通过调节t-PA活性在该过程中所起的重要作用,受到有关学者的重视。因此,检测t-PA活性水平以及Fg对t-PA活性的影响[6,7], 可以直接反映体内t-PA的功能状态及静脉移植后的发生发展过程。
本研究应用EALAS酶标法检测HSV培养液中的t-PA的活性变化。在培养HSV 5 d内, 正常组t-PA活性水平较低;低浓度Fg预处理组的t-PA活性水平与正常组基本一致,但高浓度Fg预处理组的t-PA活性水平则被进一步降低;提示此时的t-PA低活性水平与早期的血栓形成密切相关，而较高浓度Fg可促进该过程。培养HSV 5 d后, 培养液中的t-PA活性逐渐升高,并达相对稳定水平,提示与VSMC的迁移与增殖等相关;此时,低浓度Fg预处理组的t-PA活性水平仍与正常组基本一致,但高浓度Fg预处理组的t-PA活性水平被降低,但在培养12及14 d时又恢复至与正常培养组相同水平,表明较高浓度Fg在延长t-PA早期诱发血栓形成的同时, 还具有促进血管移植晚期的VSMC迁移与增殖等作用。此外，早期检测的t-PA活性低水平也与准备过程中对标本的牵拉、钳夹等所致不同程度的内皮细胞损伤有关[9]; 后期检测的t-PA活性较高水平则与静脉内皮细胞损伤的逐渐恢复及VSMC的增殖等相关[10]。
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本实验结果表明，移植血管术后早期的t-PA活性降低而诱导血栓发生;后期的t-PA活性升高利于VSMC的迁移与增殖; 以及高浓度Fg具有促进这一过程的作用。但血管移植术后再狭窄的发生发展机制复杂, 有待进一步探讨。
卫生部科研基金资助项目，96-1-212
刁彦鹏(中国医科大学第一临床学院普外科，沈阳 110001)
辛世杰(中国医科大学第一临床学院普外科，沈阳 110001)
李玉岩(大连妇产医院)
王丹蓉(中国医科大学第一临床学院普外科，沈阳 110001)
王新文(中国医科大学第一临床学院普外科，沈阳 110001)
, http://www.100md.com
张强(中国医科大学第一临床学院普外科，沈阳 110001)
段志泉(中国医科大学第一临床学院普外科，沈阳 110001)
参考文献
1，Werb Z, Mainardi C, Vater CA, et al. Endogenous activation of latent collagenase by rheumatoid synovial cells: Evidence for a role of plasminogen activator. N Engl J Med, 1977,296(18):1017—1023
2，Paranjpe M, Engel L, Young N, et al. Activation of human breast carcinoma collagenase through plasminogen activator. Life Sci, 1980, 26(15): 1223—1231
, http://www.100md.com
3，Soyombo AA, Angelini GD, Bryan AJ, et al. Intimal proliferation in organ culture of human saphenous vein. Am J pathol, 1990, 137(6): 1401—1410
4，Karen E, Kevin V. Human saphenous vein organ culture useful model of intimal hyperplasia? Eur J Vasc Endovasc Surg, 1996, 11(1):48—58
5，Higman DJ, Greenhalgh RM, Powell JT. Smoking impairs endothelium-dependent relaxation of saphenous vein. Br J Surg, 1993, 80(10): 1242—1245
, 百拇医药
6，Hicks RCJ, Ellis M, Mir-Hasseine R, et al. The influence of fibrinogen concentration on the development of vein graft stenosis. Eur J Vasc Surg, 1995, 9(5): 415—420
7，J Gupta SK, Ascer E. Six year prospective multicenter randomized comparison of autologous vein and expanded polytetrafluororthylene grafts in infrainguial arterial reconstructions. J Vasc Surg, 1986, 3(2): 104—114
8，Xiaoli M, Wenying H, Mingpeng S, et al Expression of tissue-type plasmingen activator in smooth muscle cells of injured iliac arteries in rabbits. Chin Med Sci J, 1996, 11(2):84—88, 百拇医药
摘 要 目的:检测人大隐静脉(human saphenous vein，HSV)组织培养液中组织型纤溶酶原激活物(tissue-type plasminogen activator, t-PA)的活性变化, 及不同浓度纤维蛋白原(fibrinogen, Fg)对t-PA活性的影响, 探讨血管移植后再狭窄发生发展的可能机制。方法：应用EALAS酶标法检测组织培养液中的t-PA活性变化。结果：正常培养HSV第3、5天时的t-PA活性水平均明显低于培养第8、10、12和14天的t-PA水平(P<0.05, P<0.01); 低浓度的Fg (0.5 g/L)对t-PA活性无明显影响; 高浓度的Fg (2.5 g/L或5 g/L)使培养HSV第3、5天时的t-PA活性进一步降低，且降低培养HSV第8、10天时的t-PA活性; 但对培养HSV第12、14天时的t-PA活性无明显影响。结论：血管移植术后早期，移植静脉的低t-PA活性水平与吻合口处的血栓形成相关; 中、晚期的t-PA活性升高则与血管平滑肌细胞的迁移及内膜增生等相关; 较高浓度Fg则具有促进这一过程的作用。
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关键词：组织型纤溶酶原激活物 人 大隐静脉 纤维蛋白原
组织型纤溶酶原激活物(tissue-type plasminogen activator, t-PA)是由血管内皮细胞合成并分泌的一种丝氨酸蛋白酶。目前的研究表明，t-PA具有促进纤溶酶原转化为纤溶酶、使纤维蛋白降解而具有防治血栓病及血管移植术后血栓形成等作用; 但还具有诱导细胞外基质降解及胶原酶原激活为胶原酶、促使血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMC)的迁移与增殖而不利于防治血管移植术后血管狭窄与血栓形成等作用[1，2]。因此, t-PA在血管移植术后再狭窄的发生发展中的作用是有争议的。本研究应用EALAS酶标法检测培养的人大隐静脉(human saphenous vein, HSV)培养液中的t-PA活性变化, 同时探讨不同浓度的纤维蛋白原(fibrinogen, Fg)对t-PA活性变化的影响。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 仪器与试剂 细胞培养箱(FISHER 公司,美国),酶标测定仪(Model 550 Bio-RAD公司,美国);t-PA活性测定试剂盒(上海医科大学分子遗传室); PRMI 1640培养液(Sigma公司,美国); L-谷氨酰胺(Gioco公司,美国),30%灭活小牛血清(大连生物制品厂), Fg(中美合资上海莱士血液制品有限公司 ), 其它为市售分析纯试剂。
1.2 HSV取材及内皮细胞完整性检测 在9例血管移植手术中取正常大隐静脉(长约2.0 cm),按Soyombo和Karen E的方法进行处理[3,4]。将HSV置于4℃无菌PBS液(pH 7.4)中除去两端及外周结缔组织后, 分成若干0.5 cm×0.5 cm大小的静脉片,并进行内皮细胞完整性检测。检测方法为:随机取一片HVS用0.3% Trypan Blue染色30 s(37℃)、PBS冲洗后观察染色情况。内皮覆盖大于50%者可进行下述实验。
1.3 HSV的培养 将HSV分别置于含不同浓度Fg(0, 0.5, 2.5和5 g/L)的1640培养液中, 于细胞培养箱 (37℃、5% CO2)培养。并分别在培养第3,5,8, 10, 12和14 d时更换并收集培养液。
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1.4 t-PA活性检测 将上述收集的培养液立即加入等体积的酸化液(NaAc-Hac), 4℃ 1000 r/min离心10 min以除去杂质, 上清-80 ℃保存。测定时按t-PA活性测定试剂盒进行,培养液中的t-PA活性用EALAS酶标法测定。首先制备t-PA标准曲线, 根据标准曲线计算出各待测液的t-PA活性。
1.5 统计学分析 所有数据以中位数(全距)表示，用Wilcoxon秩和检验对各组数据进行统计学分析处理。
2 结果
2.1 正常培养液中t-PA活性水平 检测结果表明, 在培养HSV不同时间时的t-PA活性测得值有明显变化。HSV培养第3、5 d的t-PA活性测得值较低,而培养第8、10、12和14 d时t-PA活性值较高。
2.2 不同浓度Fg对HSV培养液t-PA活性的影响 当Fg浓度为较低水平时(0.5 g/L), HSV培养液t-PA活性基本不受影响(P>0.05); 当Fg浓度为较高水平时(2.5和5.0 g/L), 可使培养第3、5 d时的t-PA低活性水平进一步降低, 同时明显降低培养第8、10 d时HSV培养液t-PA的活性水平(P<0.05、P<0.01)，但对培养第12、14 d时HSV培养液t-PA活性水平无明显影响。实验结果见表1。
, 百拇医药
表1 正常HSV培养液t-PA活性水平变化(IU/ml)
Tab. 1 Activity of t-PA in cultured medium of HSV (IU/ml)
培养时间
(d)
Fg浓度(g/L)
0
0.5
2.5
5.0
3
0.277(0.114～0.362)
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0.258(0.116～0.494)
0.198(0.098～0.256)**
0.102(0.042～0.120)**
5
0.242(0.070～0.356)
0.248(0.130～0.540)
0.177(0.064～0.236)**
0.090(0.043～0.131)**
8
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0.445(0.261～0.896)
0.172(0.114～0.353)**
0.162(0.114～0.322)**
10
0.363(0.218～0.998)
0.485(0.269～0.755)
0.384(0.227～0.816)
0.206(0.151～0.456)*
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0.384(0.194～0.903)
0.443(0.270～0.918)
0.362(0.199～0.874)
0.362(0.225～1.364)
14
0.377(0.243～0.705)
0.365(0.262～0.886)
0.375(0.253～0.633)
0.323(0.158～0.758)
, 百拇医药 与无Fg组比较：* P<0.05, ** P<0.01
3 讨论
已有研究表明,血管移植术中的内膜损伤是近期的血栓形成与远期的VSMC从中膜向内膜迁移并增殖进而形成移植静脉再狭窄或闭塞的主要原因[5]。自体大隐静脉是心脏架桥术和周围血管移植术的首选替代物,但移植术后移植静脉再狭窄或闭塞的发生发展机制复杂。有关t-PA活性变化以及Fg通过调节t-PA活性在该过程中所起的重要作用,受到有关学者的重视。因此,检测t-PA活性水平以及Fg对t-PA活性的影响[6,7], 可以直接反映体内t-PA的功能状态及静脉移植后的发生发展过程。
本研究应用EALAS酶标法检测HSV培养液中的t-PA的活性变化。在培养HSV 5 d内, 正常组t-PA活性水平较低;低浓度Fg预处理组的t-PA活性水平与正常组基本一致,但高浓度Fg预处理组的t-PA活性水平则被进一步降低;提示此时的t-PA低活性水平与早期的血栓形成密切相关，而较高浓度Fg可促进该过程。培养HSV 5 d后, 培养液中的t-PA活性逐渐升高,并达相对稳定水平,提示与VSMC的迁移与增殖等相关;此时,低浓度Fg预处理组的t-PA活性水平仍与正常组基本一致,但高浓度Fg预处理组的t-PA活性水平被降低,但在培养12及14 d时又恢复至与正常培养组相同水平,表明较高浓度Fg在延长t-PA早期诱发血栓形成的同时, 还具有促进血管移植晚期的VSMC迁移与增殖等作用。此外，早期检测的t-PA活性低水平也与准备过程中对标本的牵拉、钳夹等所致不同程度的内皮细胞损伤有关[9]; 后期检测的t-PA活性较高水平则与静脉内皮细胞损伤的逐渐恢复及VSMC的增殖等相关[10]。
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本实验结果表明，移植血管术后早期的t-PA活性降低而诱导血栓发生;后期的t-PA活性升高利于VSMC的迁移与增殖; 以及高浓度Fg具有促进这一过程的作用。但血管移植术后再狭窄的发生发展机制复杂, 有待进一步探讨。
卫生部科研基金资助项目，96-1-212
刁彦鹏(中国医科大学第一临床学院普外科，沈阳 110001)
辛世杰(中国医科大学第一临床学院普外科，沈阳 110001)
李玉岩(大连妇产医院)
王丹蓉(中国医科大学第一临床学院普外科，沈阳 110001)
王新文(中国医科大学第一临床学院普外科，沈阳 110001)
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张强(中国医科大学第一临床学院普外科，沈阳 110001)
段志泉(中国医科大学第一临床学院普外科，沈阳 110001)
参考文献
1，Werb Z, Mainardi C, Vater CA, et al. Endogenous activation of latent collagenase by rheumatoid synovial cells: Evidence for a role of plasminogen activator. N Engl J Med, 1977,296(18):1017—1023
2，Paranjpe M, Engel L, Young N, et al. Activation of human breast carcinoma collagenase through plasminogen activator. Life Sci, 1980, 26(15): 1223—1231
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3，Soyombo AA, Angelini GD, Bryan AJ, et al. Intimal proliferation in organ culture of human saphenous vein. Am J pathol, 1990, 137(6): 1401—1410
4，Karen E, Kevin V. Human saphenous vein organ culture useful model of intimal hyperplasia? Eur J Vasc Endovasc Surg, 1996, 11(1):48—58
5，Higman DJ, Greenhalgh RM, Powell JT. Smoking impairs endothelium-dependent relaxation of saphenous vein. Br J Surg, 1993, 80(10): 1242—1245
, 百拇医药
6，Hicks RCJ, Ellis M, Mir-Hasseine R, et al. The influence of fibrinogen concentration on the development of vein graft stenosis. Eur J Vasc Surg, 1995, 9(5): 415—420
7，J Gupta SK, Ascer E. Six year prospective multicenter randomized comparison of autologous vein and expanded polytetrafluororthylene grafts in infrainguial arterial reconstructions. J Vasc Surg, 1986, 3(2): 104—114
8，Xiaoli M, Wenying H, Mingpeng S, et al Expression of tissue-type plasmingen activator in smooth muscle cells of injured iliac arteries in rabbits. Chin Med Sci J, 1996, 11(2):84—88, 百拇医药