非小细胞肺癌CD44v6和nm23基因蛋白的表达及其临床意义
作者：褚晓源 陈龙邦 王靖华 周晓军 龚涌灵 张群
单位：(210002 南京军区南京总医院肿瘤内科)
关键词：CD44v6；nm23；免疫组化；肺肿瘤
江苏医药000902 【摘要】 目的 研究CD44v6、nm23基因蛋白在非小细胞肺癌(NSCLC)的表达及其与病理类型、淋巴结转移、肿瘤大小及病理分期之间的关系。方法 应用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)法染色技术测定65例NSCLC组织标本的CD44v6、nm23基因蛋白的表达水平。结果 CD44v6和nm23在NSCLC组织中的阳性表达率显著高于癌旁组织(P<0.01)；CD44v6高表达与NSCLC的淋巴结转移及病理分期有关(P<0.05)；nm23与病理类型、淋巴结转移、肿瘤大小及病理分期之间均无关(P>0.05)。结论 检测CD44v6蛋白的表达，有可能为判断NSCLC淋巴结转移、病变的发展以及评估预后提供依据。
, http://www.100md.com
Studies on the expressions of CD44v6 and nm23 gene protein products in human non-small cell lung cancer
CHU Xiaoyuan，CHEN Longbang，WANG Jinghua，et al
(Department of Oncology，Nanjing General Hospital of PLA，Nanjing 210002)
【Abstract】 Objective To study the correlation between the expressions of CD44v6，nm23 gene protein in non-small cell lung cancer(NSCLC) and pathological types，lymph node metastases，the size of tumor mass and clinical stages.Methods Using SP immunohistochemical method with anti-CD44v6 and nm23 mono/multiclonal antibody，expressions of CD44v6 and nm23 gene protein in 65 cases non-small cell lung cancer(NSCLC) were examined.Results The total positive rates of CD44v6 and nm23 expression in NSCLC were much higher than those in the normal adjacent tissues (P<0.01).CD44v6 overexpression was associated with the stages of lymph node metastases and the disease staging(P<0.05).Nm23 overexpression was not related with pathological types，lymph node metastases，the size of tumor mass or clinical stages(P>0.05).Conclusion The data demonstrated that expression of CD44v6 might be used as an objective indicator of the metastatic potency，extent of invasion and the prognosis in NSCLC.
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【Key words】 CD44v6 nm23 Immunohistochemistry Lung neoplasms
CD44v6是一种细胞表面粘附分子，主要参与细胞与细胞、细胞与细胞外基质间的特异性粘连，在多种人类肿瘤的侵袭和转移过程中均起重要作用[1，2]。nm23是一种抑癌基因，与乳腺癌的转移潜在性有关，而在结肠癌等其它肿瘤则有不同报道。我们采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)法染色技术，对NSCLC组织的CD44v6和nm23基因蛋白进行了检测。
材料与方法
一、标本
全部选自经病理证实的NSCLC标本65例，男性50例，女性15例；年龄38～75岁，平均年龄58.8岁。按WHO《肺肿瘤组织学分型》(1981)标准，65例中肺鳞癌32例，肺腺癌33例。组织学分级为Ⅰ级10例，Ⅱ级23例，Ⅲ级32例。根据1986年UICC的TNM分期标准分期为Ⅰ期11例，Ⅱ期22例，ⅢA期28例，ⅢB～Ⅳ期4例。根据有无肺门或纵隔淋巴结转移分为两组，淋巴结转移组36例，无淋巴结转移组29例。标本均经中性福尔马林溶液固定，石蜡包埋，4μm切片。
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二、抗体
美国Eenda公司生产的CD44v6单克隆抗体(克隆号2F10)、nm23多克隆抗体及链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组织染色试剂盒均购自福州迈新生物技术公司。
三、免疫组织化学染色
切片常规脱蜡水化，放入0.01mol/L，pH6.0的柠檬酸缓冲液内，于微波炉中，Ⅱ档(功率220W)，加热10min，室温冷却30min后，蒸馏水冲洗，再用PBS冲洗(3×5min)。每张切片加1滴过氧化物酶阻断液，室温下孵育10min。PBS液冲洗(3×5min)。每张切片加1滴非免疫性动物血清，室温下孵育20min。每张切片加1滴第一抗体，4℃下孵育过夜。PBS液冲洗(3×5min)。每张切片加1滴生物素标记的第二抗体，室温下孵育20min。PBS液冲洗(3×5min)。每张切片加1滴链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液，室温下孵育20min。PBS液冲洗(3×5min)。每张切片加2滴新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察10min。自来水冲洗，苏木素衬染，0.1%盐酸水溶液分化。回蓝后，切片常规脱水，二甲苯透明，中性树酯封片。
, 百拇医药
对照：用已知的阳性肺癌组织切片同时同一条件下染色作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。
四、结果判断
CD44v6和nm23阳性染色标准为细胞膜和/或细胞浆内出现棕黄色颗粒。采用双评分半定量法进行评分：≤25%癌细胞阳性0分，26%～50%1分，51%～75%2分，>75%3分；显色度按切片中细胞显色有无及深浅计分，无显色0分，浅棕黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分；将两分相加，1～2分判+，3～4分判，5～6分判。
五、统计分析
阳性率的比较采用χ2检验。
结果
一、CD44v6和nm23基因蛋白表达的定位
, 百拇医药
CD44v6阳性染色定位于癌细胞膜和细胞浆中。nm23阳性染色定位于癌细胞浆内。
二、CD44v6和nm23基因蛋白在NSCLC组织中表达及其与病理类型的关系
同一癌巢细胞CD44v6和nm23基因蛋白表达强度各异，阳性表达以“+”至“++”多见，阳性染色呈灶状或片状分布。癌旁正常肺组织呈阴性或弱阳性表达。CD44v6和nm23基因蛋白在NSCLC组织阳性表达率为66.2%和73.8%，明显高于癌旁组织的7.7%和10.8%，经统计学处理，均有显著统计学意义(P<0.01)；CD44v6在肺鳞癌、腺癌组织中的阳性表达率为56.2%和75.8%，而nm23的阳性表达率为78.1%和69.7%，经统计学处理，两指标在NSCLC组织中的表达与病理类型均无关(P>0.05)。
, 百拇医药
三、CD44v6和nm23基因蛋白的表达与NSCLC淋巴结转移的关系
CD44v6在淋巴结转移组的阳性率为80.6%，明显高于无淋巴结转移组的48.3%，且有显著统计学意义(P<0.01)；nm23在淋巴结转移组的阳性率为77.8%，与无淋巴结转移组的阳性率69.0%相差不显著(P>0.05)。
四、CD44v6和nm23基因蛋白表达与NSCLC肿瘤大小、病理分期之间关系(见表1)
结果表明CD44v6在NSCLC的表达与临床病理分期有关，早期为Ⅰ期+Ⅱ期，中晚期为Ⅲ期+Ⅳ期，中晚期NSCLC的表达率显著高于早期(P<0.05)；CD44v6在不同肿瘤大小中的表达率相差不明显(P>0.05)；nm23在不同肿瘤大小及不同临床病理分期中的表达率均相差不显著(P>0.05)。
, 百拇医药
表1 CD44v6和nm23基因蛋白表达与NSCLC肿瘤大小(cm)、病理分期之间关系 分类
例数
CD44v6
nm23
阳性
阴性
阳性率(%)
阳性
阴性
阳性率(%)
肿瘤Φ≤3.0
, 百拇医药
18
13
5
72.2
14
4
77.8
3.0<Φ≤5.0
31
21
10
67.7
23
, 百拇医药
8
74.2
5.0<Φ
16
9
7
56.3
11
5
68.8
Ⅰ期+Ⅱ期
33
18
, 百拇医药 15
55.5＃
22
11
66.7＃＃
Ⅲ期+Ⅳ期
32
25
7
78.1
26
6
81.3
, 百拇医药
注：肿瘤Φ≤3.0、3.0<Φ≤5.0与5.0<Φ三者之间比较，P>0.05
Ⅰ期+Ⅱ期与Ⅲ期+Ⅳ期比较，＃P<0.05，＃＃P>0.05
讨论
CD44v6属于细胞表面粘附分子CD44的一种变异型。CD44v6的表达有助于肿瘤细胞获得转移潜能，其促转移作用机理可能是表达CD44v6的肿瘤细胞与远隔的淋巴管或血管内某一配体结合，使转移至那里的肿瘤细胞更加稳定地寄宿与生长[3]。
目前，有关CD44v6蛋白表达与NSCLC的侵袭、转移关系报道较少。本实验发现，CD44v6在癌组织的阳性表达率明显高于癌旁组织，有淋巴结转移的肿瘤组织表达率明显高于无转移者，并且发现CD44v6与NSCLC的病理分期有关，中晚期肺癌的CD44v6表达率显著高于早期。以上说明CD44v6不仅与NSCLC淋巴结转移有关，是判断淋巴结转移的一个重要指标，而且可能与NSCLC病变的进展有关。因此，CD44v6有可能作为判断NSCLC淋巴结转移、病变的发展以及评估预后的一个指标。
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nm23是steeg等[4]从高转移和低转移鼠K-1735黑色素瘤细胞系cDNA文库中分离出来的肿瘤转移抑制基因，其编码产物为核苷二磷酸激酶(NDPK)。近年来，人们已认识到nm23基因与乳腺癌的转移潜在性密切相关，但有作者发现nm23的编码产物NDPK水平在有转移和无转移结肠癌中都很高，且通过对前列腺癌和甲状腺癌的研究表明，nm23在上述肿瘤中并未起转移抑制作用，而与细胞恶性增殖有关[5，6]。
本实验发现，nm23基因蛋白在NSCLC组织的阳性表达率明显高于癌旁组织，但其蛋白表达与肿瘤的病理类型、肿瘤大小及病理分期均无关。nm23在NSCLC组织中有过量表达，可能与肿瘤的发生、发展有一定联系，本研究未能证实nm23在肺癌中作为转移抑制基因的作用。由于本组实验ⅢB期以上的标本较少，并不完全能反映该期nm23的表达状况，因此对nm23在NSCLC发生、发展中的确切意义尚有待于进一步研究。
参考文献
, 百拇医药
1，Koretz K，Moller P，Lehnert T，et al.Effect of CD44-v6 on survival in colorectal carcinoma.Lancet，1995，345：327-329.
2，Salmi M，Gron-Virta K，Sointu P，et al.Regulated expression of exon v6 containing isoforms of CD44 in man：downregulation during malignant transformation of tumors of squamocellular origin.J cell Biol，1993，122：431-444.
3，Ermak G，Jennings T，Kobinson L，et al.Restricted pattern of CD44 cvariant exon expression in human papillary thyriod carcinoma.Cancer Res，1996，56：1037-1038.
, http://www.100md.com
4，Steeg PS，Bevilacqua G，Kopper L，et al.Evidence for a novel gene associated with low metastatic potential.J Natl Cancer Inst ，1988，80：200-202.
5，Haut M，Steer PS，Willson S，et al.Induction of nm23 gene expression in human colonic neoplasms and equal expression in colon tumors of high and low metastatic potential.J Natl Cancer Inst，1991，83：712-714.
6，Igawa M，Rwkstallis DB，Tanabe T，et al.High level of nm23 expression are related to cell proliferation in human prostate cancer.Cancer Res，1994，54：1313 -1315.
收稿：2000-01-04 修回：2000-04-18, 百拇医药
单位：(210002 南京军区南京总医院肿瘤内科)
关键词：CD44v6；nm23；免疫组化；肺肿瘤
江苏医药000902 【摘要】 目的 研究CD44v6、nm23基因蛋白在非小细胞肺癌(NSCLC)的表达及其与病理类型、淋巴结转移、肿瘤大小及病理分期之间的关系。方法 应用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)法染色技术测定65例NSCLC组织标本的CD44v6、nm23基因蛋白的表达水平。结果 CD44v6和nm23在NSCLC组织中的阳性表达率显著高于癌旁组织(P<0.01)；CD44v6高表达与NSCLC的淋巴结转移及病理分期有关(P<0.05)；nm23与病理类型、淋巴结转移、肿瘤大小及病理分期之间均无关(P>0.05)。结论 检测CD44v6蛋白的表达，有可能为判断NSCLC淋巴结转移、病变的发展以及评估预后提供依据。
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Studies on the expressions of CD44v6 and nm23 gene protein products in human non-small cell lung cancer
CHU Xiaoyuan，CHEN Longbang，WANG Jinghua，et al
(Department of Oncology，Nanjing General Hospital of PLA，Nanjing 210002)
【Abstract】 Objective To study the correlation between the expressions of CD44v6，nm23 gene protein in non-small cell lung cancer(NSCLC) and pathological types，lymph node metastases，the size of tumor mass and clinical stages.Methods Using SP immunohistochemical method with anti-CD44v6 and nm23 mono/multiclonal antibody，expressions of CD44v6 and nm23 gene protein in 65 cases non-small cell lung cancer(NSCLC) were examined.Results The total positive rates of CD44v6 and nm23 expression in NSCLC were much higher than those in the normal adjacent tissues (P<0.01).CD44v6 overexpression was associated with the stages of lymph node metastases and the disease staging(P<0.05).Nm23 overexpression was not related with pathological types，lymph node metastases，the size of tumor mass or clinical stages(P>0.05).Conclusion The data demonstrated that expression of CD44v6 might be used as an objective indicator of the metastatic potency，extent of invasion and the prognosis in NSCLC.
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【Key words】 CD44v6 nm23 Immunohistochemistry Lung neoplasms
CD44v6是一种细胞表面粘附分子，主要参与细胞与细胞、细胞与细胞外基质间的特异性粘连，在多种人类肿瘤的侵袭和转移过程中均起重要作用[1，2]。nm23是一种抑癌基因，与乳腺癌的转移潜在性有关，而在结肠癌等其它肿瘤则有不同报道。我们采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)法染色技术，对NSCLC组织的CD44v6和nm23基因蛋白进行了检测。
材料与方法
一、标本
全部选自经病理证实的NSCLC标本65例，男性50例，女性15例；年龄38～75岁，平均年龄58.8岁。按WHO《肺肿瘤组织学分型》(1981)标准，65例中肺鳞癌32例，肺腺癌33例。组织学分级为Ⅰ级10例，Ⅱ级23例，Ⅲ级32例。根据1986年UICC的TNM分期标准分期为Ⅰ期11例，Ⅱ期22例，ⅢA期28例，ⅢB～Ⅳ期4例。根据有无肺门或纵隔淋巴结转移分为两组，淋巴结转移组36例，无淋巴结转移组29例。标本均经中性福尔马林溶液固定，石蜡包埋，4μm切片。
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二、抗体
美国Eenda公司生产的CD44v6单克隆抗体(克隆号2F10)、nm23多克隆抗体及链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组织染色试剂盒均购自福州迈新生物技术公司。
三、免疫组织化学染色
切片常规脱蜡水化，放入0.01mol/L，pH6.0的柠檬酸缓冲液内，于微波炉中，Ⅱ档(功率220W)，加热10min，室温冷却30min后，蒸馏水冲洗，再用PBS冲洗(3×5min)。每张切片加1滴过氧化物酶阻断液，室温下孵育10min。PBS液冲洗(3×5min)。每张切片加1滴非免疫性动物血清，室温下孵育20min。每张切片加1滴第一抗体，4℃下孵育过夜。PBS液冲洗(3×5min)。每张切片加1滴生物素标记的第二抗体，室温下孵育20min。PBS液冲洗(3×5min)。每张切片加1滴链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液，室温下孵育20min。PBS液冲洗(3×5min)。每张切片加2滴新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察10min。自来水冲洗，苏木素衬染，0.1%盐酸水溶液分化。回蓝后，切片常规脱水，二甲苯透明，中性树酯封片。
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对照：用已知的阳性肺癌组织切片同时同一条件下染色作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。
四、结果判断
CD44v6和nm23阳性染色标准为细胞膜和/或细胞浆内出现棕黄色颗粒。采用双评分半定量法进行评分：≤25%癌细胞阳性0分，26%～50%1分，51%～75%2分，>75%3分；显色度按切片中细胞显色有无及深浅计分，无显色0分，浅棕黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分；将两分相加，1～2分判+，3～4分判，5～6分判。
五、统计分析
阳性率的比较采用χ2检验。
结果
一、CD44v6和nm23基因蛋白表达的定位
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CD44v6阳性染色定位于癌细胞膜和细胞浆中。nm23阳性染色定位于癌细胞浆内。
二、CD44v6和nm23基因蛋白在NSCLC组织中表达及其与病理类型的关系
同一癌巢细胞CD44v6和nm23基因蛋白表达强度各异，阳性表达以“+”至“++”多见，阳性染色呈灶状或片状分布。癌旁正常肺组织呈阴性或弱阳性表达。CD44v6和nm23基因蛋白在NSCLC组织阳性表达率为66.2%和73.8%，明显高于癌旁组织的7.7%和10.8%，经统计学处理，均有显著统计学意义(P<0.01)；CD44v6在肺鳞癌、腺癌组织中的阳性表达率为56.2%和75.8%，而nm23的阳性表达率为78.1%和69.7%，经统计学处理，两指标在NSCLC组织中的表达与病理类型均无关(P>0.05)。
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三、CD44v6和nm23基因蛋白的表达与NSCLC淋巴结转移的关系
CD44v6在淋巴结转移组的阳性率为80.6%，明显高于无淋巴结转移组的48.3%，且有显著统计学意义(P<0.01)；nm23在淋巴结转移组的阳性率为77.8%，与无淋巴结转移组的阳性率69.0%相差不显著(P>0.05)。
四、CD44v6和nm23基因蛋白表达与NSCLC肿瘤大小、病理分期之间关系(见表1)
结果表明CD44v6在NSCLC的表达与临床病理分期有关，早期为Ⅰ期+Ⅱ期，中晚期为Ⅲ期+Ⅳ期，中晚期NSCLC的表达率显著高于早期(P<0.05)；CD44v6在不同肿瘤大小中的表达率相差不明显(P>0.05)；nm23在不同肿瘤大小及不同临床病理分期中的表达率均相差不显著(P>0.05)。
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表1 CD44v6和nm23基因蛋白表达与NSCLC肿瘤大小(cm)、病理分期之间关系 分类
例数
CD44v6
nm23
阳性
阴性
阳性率(%)
阳性
阴性
阳性率(%)
肿瘤Φ≤3.0
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18
13
5
72.2
14
4
77.8
3.0<Φ≤5.0
31
21
10
67.7
23
, 百拇医药
8
74.2
5.0<Φ
16
9
7
56.3
11
5
68.8
Ⅰ期+Ⅱ期
33
18
, 百拇医药 15
55.5＃
22
11
66.7＃＃
Ⅲ期+Ⅳ期
32
25
7
78.1
26
6
81.3
, 百拇医药
注：肿瘤Φ≤3.0、3.0<Φ≤5.0与5.0<Φ三者之间比较，P>0.05
Ⅰ期+Ⅱ期与Ⅲ期+Ⅳ期比较，＃P<0.05，＃＃P>0.05
讨论
CD44v6属于细胞表面粘附分子CD44的一种变异型。CD44v6的表达有助于肿瘤细胞获得转移潜能，其促转移作用机理可能是表达CD44v6的肿瘤细胞与远隔的淋巴管或血管内某一配体结合，使转移至那里的肿瘤细胞更加稳定地寄宿与生长[3]。
目前，有关CD44v6蛋白表达与NSCLC的侵袭、转移关系报道较少。本实验发现，CD44v6在癌组织的阳性表达率明显高于癌旁组织，有淋巴结转移的肿瘤组织表达率明显高于无转移者，并且发现CD44v6与NSCLC的病理分期有关，中晚期肺癌的CD44v6表达率显著高于早期。以上说明CD44v6不仅与NSCLC淋巴结转移有关，是判断淋巴结转移的一个重要指标，而且可能与NSCLC病变的进展有关。因此，CD44v6有可能作为判断NSCLC淋巴结转移、病变的发展以及评估预后的一个指标。
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nm23是steeg等[4]从高转移和低转移鼠K-1735黑色素瘤细胞系cDNA文库中分离出来的肿瘤转移抑制基因，其编码产物为核苷二磷酸激酶(NDPK)。近年来，人们已认识到nm23基因与乳腺癌的转移潜在性密切相关，但有作者发现nm23的编码产物NDPK水平在有转移和无转移结肠癌中都很高，且通过对前列腺癌和甲状腺癌的研究表明，nm23在上述肿瘤中并未起转移抑制作用，而与细胞恶性增殖有关[5，6]。
本实验发现，nm23基因蛋白在NSCLC组织的阳性表达率明显高于癌旁组织，但其蛋白表达与肿瘤的病理类型、肿瘤大小及病理分期均无关。nm23在NSCLC组织中有过量表达，可能与肿瘤的发生、发展有一定联系，本研究未能证实nm23在肺癌中作为转移抑制基因的作用。由于本组实验ⅢB期以上的标本较少，并不完全能反映该期nm23的表达状况，因此对nm23在NSCLC发生、发展中的确切意义尚有待于进一步研究。
参考文献
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1，Koretz K，Moller P，Lehnert T，et al.Effect of CD44-v6 on survival in colorectal carcinoma.Lancet，1995，345：327-329.
2，Salmi M，Gron-Virta K，Sointu P，et al.Regulated expression of exon v6 containing isoforms of CD44 in man：downregulation during malignant transformation of tumors of squamocellular origin.J cell Biol，1993，122：431-444.
3，Ermak G，Jennings T，Kobinson L，et al.Restricted pattern of CD44 cvariant exon expression in human papillary thyriod carcinoma.Cancer Res，1996，56：1037-1038.
, http://www.100md.com
4，Steeg PS，Bevilacqua G，Kopper L，et al.Evidence for a novel gene associated with low metastatic potential.J Natl Cancer Inst ，1988，80：200-202.
5，Haut M，Steer PS，Willson S，et al.Induction of nm23 gene expression in human colonic neoplasms and equal expression in colon tumors of high and low metastatic potential.J Natl Cancer Inst，1991，83：712-714.
6，Igawa M，Rwkstallis DB，Tanabe T，et al.High level of nm23 expression are related to cell proliferation in human prostate cancer.Cancer Res，1994，54：1313 -1315.
收稿：2000-01-04 修回：2000-04-18, 百拇医药