组织工程修复关节软骨缺损的研究进展
作者：裴明 曲绵域 于长隆
单位：100083北京大学第三医院运动医学研究所
关键词：
中华骨科杂志000908
组织工程学是近年生物医学科学发展的新领域,Reddi[1]将组织工程学定义为：制备用于替代缺损组织而再生新组织的一门科学。在这个领域中，细胞生物学家、工程学家以及外科医生合作，使用人体活细胞和各种生物材料构建人造的结缔组织、上皮组织及神经组织等[2]。其中人造皮肤是生物工程研究领域中较早、同时也是已取得较成熟研究成果的课题之一[3]。构建与正常软骨生物学及机械特性相近的人造软骨和骨组织，是当前组织工程学的研究重点之一。
一、关节软骨损伤的修复现状
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成熟关节软骨的自身修复能力较差，除与软骨内无血管、缺乏未分化的软骨细胞及软骨细胞被固定在一个致密的由胶原和蛋白多糖组成的固体基质中有关外，可能还与以下两个因素有关:(1)内在修复依赖于软骨细胞有丝分裂及短期内增加的代谢产物(主要是胶原和蛋白多糖)，而成熟软骨细胞有丝分裂能力极低；(2)外部愈合依赖于来自软骨下骨的间充质成分的参与，形成新的结缔组织，经过一系列变化形成纤维软骨。在关节创伤的愈合过程中，已受损或破坏的关节软骨由纤维软骨修复，易发展成为骨关节炎。而以软骨细胞为基础的软骨组织修复工程，通过透明软骨促进新的软骨形成，可改进修复组织的质量。
治疗创伤和骨关节炎(osteoarthritis,OA)引起的关节软骨损伤的传统方法主要包括:(1)组织移植，即取自体健康软骨，修剪成理想的形状，再重新植回体内，或以自体软骨膜[4]、骨膜移植[5]，也可以用异体骨软骨片移植[6]；(2)置入人造假体，然而由于软骨缺损范围一般较大，而供体组织数量有限，不可能修成所需要的三维结构(3D)置入物。再者人造假体易继发感染或松动，而且不像活体软骨组织和骨组织那样适应周围组织的应力变化，对年轻OA患者则更不适宜行假体置换。为了适应临床需求，重建外科将这一课题的研究重点转移至用体外多聚体支架培养分离的软骨细胞，形成再生软骨，以满足临床修复软骨缺损所需要的三维植入物。这样在未来的临床应用中，使用自体植入物即可以减少对有严重副作用的免疫排斥剂的需求。
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目前有关软骨再生的报道很多，诸如在皮下注射软骨细胞形成小的软骨结节[7]；利用软骨膜片将培养分离的软骨细胞固定在软骨缺损部位使软骨再生，但这种方法技术操作比较困难，可修复缺损的范围也有限[1]；用琼脂糖包裹软骨细胞形成细胞悬液进行体外培养，可使营养物质充分弥散和新合成的软骨基质聚积，且软骨细胞能维持分化表型，并在体外产生蛋白多糖和胶原(包括Ⅱ型胶原)等典型的软骨基质成分。然而以琼脂糖作为支架不能维持植入物的原始构型，而且形成的植入物较软。因此，修复大面积软骨缺损理想的生物载体材料应是形状可控制的三维支架结构的体内植入物，软骨细胞在这种结构中能增殖分化，并形成具有正常软骨成分(主要指糖胺聚糖和Ⅱ型胶原，以及具有相应的生物机械特性)的再生软骨。
二、组织工程软骨的组成
组织工程软骨的培养过程主要有以下三个步骤:(1)首先在体外进行单层培养，通过生长因子的调节，扩增出足够的软骨细胞；(2)将扩增的软骨细胞接种到合适的生物支架上，以维持组织工程软骨的三维结构及恢复组织分化表型；(3)选择合适的生物反应器以长期维持组织工程细胞的分化表型及基质再生。
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(一)软骨细胞的分离及培养
通过酶解活检标本获得软骨细胞，然后在体外进行单层培养，应用生长因子等使软骨细胞传代扩增。但随着细胞数量的增加，逐渐失去其分化表型，为了维持软骨细胞的分化表型，必须以高细胞密度方式进行培养[8,9]。其中生物反应器在维持组织工程化软骨的分化表型及新陈代谢方面效果尤佳。
(二)多聚体支架的要求及种类
控制培养组织分化被视为所有组织工程的核心步骤。细胞的锚着(anchorage)以及人工组织支架的组织相容性都对再生软骨组织的典型特性表达有影响。在细胞培养前2～3周，软骨细胞可形成足够的细胞外基质，为植入物提供机械上的完整性。此后支架应自行逐渐降解以减少体内因植入异物而发生继发性炎症的危险，并为再生的软骨组织提供充分的空间。支架降解率应与靶细胞组织的再生率相一致。多孔径材料的多聚体支架，孔径所占的空间可达总体积的90%以上，为软骨细胞和多聚体相互接触提供充分的表面积。这样，有利于细胞外基质的再生，减少扩散障碍，为再生软骨基质提供足够的空间。为了改进细胞锚着，可在所用生物基质表面涂抹合成聚合体[10]、肽类或细胞外基质蛋白，如多聚赖氨酸、纤维连接素、软骨连接素、粘连蛋白等[11]。在体外，细胞与支架结合后，继而的培养主要是支持细胞分化；对软骨细胞而言，在三维培养环境中，软骨细胞呈圆形能够启动软骨细胞再分化，刺激软骨组织特异性Ⅱ型胶原的合成。
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目前所用的多聚体支架主要包括Ethisorb、V7-2、Ⅰ型胶原及聚乙醇酸(polyglycolic acid，PGA)等。Ethisorb又称为VicrylTM，主要由PGA与低分子左旋聚乳酸(poly-L-lacticacid，PLLA)以90∶1的比例合成，这种成分作为外科缝线材料已在临床使用多年，体外降解时间约3周[12]；V7-2仅由PLLA组成，降解时间约9个月，适用于需要在体外进行长期培养的组织工程[13]。利用Ⅰ型胶原基质作为支架，在体外培养软骨细胞后进行同种异体移植修复软骨缺损，经长期随访表明，修复组织的生物学特性接近正常关节软骨。由于牛胶原不能复制(reproducibility)，故不是一理想的生物载体材料[14]。PGA的纤维直径为12～14μm，其内约97%中空，降解时间约4周，降解产物呈酸性，使支架周围的局部pH值降低，利于软骨细胞蛋白多糖的合成，符合以上三维可降解生物支架标准，适用于软骨组织工程[14]。
, 百拇医药 1998年，Sims等[15]用血浆制备冷沉淀纤维蛋白原(cryoprecipitated fibrinogen),并使其与分离的软骨细胞混合，在牛血栓素催化下形成软骨细胞-纤维素胶状结构，然后植入裸鼠皮下，最早可于6周产生与正常软骨相似的新生软骨。这种纤维蛋白凝胶状支架与上述多聚体支架相比具有以下优点:(1)有趋化性和致有丝分裂作用；(2)取材简单、制备方便，可通过调节血栓素的使用浓度，减慢多聚化的速度，并可按植入物的要求对工程化组织进行塑形；(3)韧性好，无免疫原性。鉴于纤维蛋白凝胶状支架的这些优点使其成为制作组织工程化软骨的自身来源支架之一。
软骨细胞-PGA中组织再生的动力学与三维张力依赖性模型有关，这样就可以解释为何机械作用力的平衡会对软骨细胞的形状和功能产生影响。在这一模型中，底物的机械特性决定了所培养的细胞是增殖还是分化:坚硬底物诱导增殖，而柔韧底物诱导分化[16]。软骨细胞以多层球形构型粘附到生物支架纤维的表面，越贴近PGA纤维表面的细胞，糖胺聚糖的分泌量越多[14]。此现象与Folkman等[17]的推测相吻合，即细胞如被培养于能维持其构象的培养底物表面，即可在体外被诱导表达其分化表型。细胞-PGA结构有足够的硬度促使细胞增殖，分泌细胞外基质，形成外在的胶原包囊。这些现象表明，支架设计参数和体外培养环境对软骨细胞表型和软骨再生具有重要作用。
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(三)生物反应器的种类与优缺点
当细胞增殖后，必须进行诱导以维持细胞的分化，因此组织载体应被转移至生物反应器这一特殊的培养容器内，并不断更换新鲜的培养液。为了适应各种生物技术的需要，生物反应器从外形设计到内在功能均已取得长足进步。例如，超过105L的大型生物反应器现已比较成熟，用于微生物细胞生物制品(如青霉素)的常规生产。用于组织工程的小型生物反应器一般不超过0.5L。目前此类生物反应器尚处于不断改进更新阶段。在组织工程学研究中，生物反应器与静止培养皿相比更具有优势:(1)载体材料与培养细胞混合得更加充分、均匀，并能更好的控制物质交换速率，使培养环境保持稳态；(2)可调整容器中的流体剪切力；(3)可维持恒定的酸碱环境、部分气体压力(PO2、PCO2)及营养水平(如葡萄糖)；(4)在整个培养过程中，都能随着植入物的生长变化而满足其需求。
生物反应器可分为以下4种:(1)机械搅拌式生物反应器[18]；(2)流体循环式生物反应器[19]；(3)旋转式微重力生物反应器；(4)灌注式生物反应器。其中，机械搅拌式生物反应器多用于哺乳动物的细胞培养，然而其混合强度在机械搅拌过程中变化很大，助力器表面的剪切率比生物反应器的其它部位高10倍。这种生物反应器的剪力梯度与营养酸碱度变化曲线及不均匀的物体交换率有关，可影响细胞生长和功能，且助力器本身在植入物培养的早期会产生干扰细胞-支架的相互作用。1992年，Hu[19]提出使用继发性液流替代机械性搅拌混合,依赖液体循环的新型生物反应器又称airlift reactors(ALR)和fluidized bed reactors(FBR),它所培养的杂交瘤细胞的细胞密度和所产生的单克隆抗体比在振荡式培养容器中提高10倍。应用旋转式微重力生物反应器进行组织培养实验，结果显示模拟微重力环境的生物反应器可使细胞发生分化，在微重力环境下聚集体单位横切面上的作用力约比重力条件下相应数值低一个数量级。灌注式生物反应器，按容器设计不同又分为4种:(1)构建物暴露于动力性压力下；(2)构建物暴露于跳动的腔内液流下[20]；(3)构建物固定于针上，在培养过程中用MRI进行监测；(4)旋转壁灌注容器[21]。
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软骨再生与关节活动所产生的应力一样,对损伤软骨的结构修复在某种程度上也依赖于机械应力的大小，可控的较小的剪切应力可增强植入物的生物机械特性[22]。因此，在软骨细胞增殖和软骨再生过程中，应优化生物反应器的工作状态，使物质交换率和剪切应力之间维持最佳平衡状态。
(四)培养液对软骨细胞分化的影响
在人工再生组织中，培养液是控制细胞分化的关键，但容易被忽视[23]。目前，商品化的培养液主要用于增殖细胞。例如，原来认为神经组织只能在胚胎时期增殖，但现已证实，在有丝分裂后期的成熟阶段也有增殖。其它许多组织器官也存在这种现象，其中有的细胞可停留在有丝分裂的G1期多年。因此，组织工程首先要经过增殖阶段，然后再是分化阶段。有丝分裂和分裂间期是渐进的不相平行的过程，因此组织工程必须调整培养液使被培养的细胞进入有丝分裂周期。就增殖环境而言，一般含有生长因子和胎牛血清的培养液比较适合；而对于分化而言，必须减少生长因子和胎牛血清的含量，还要对培养基中的电解质成分进行特别调整[24]。
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三、细胞因子在软骨组织工程中的应用展望
除了人工合成可降解的生物多聚体支架和生物反应器外，组织工程软骨最终的大小及机械特性在某种程度上依赖于基质支架中软骨细胞的起始浓度。因此，如何通过实验方法控制组织细胞的分化及反分化，以及刺激组织细胞增殖，提高培养细胞的密度则显得尤为重要。
(一)刺激软骨细胞增殖的生长因子
由于老年骨关节病患者由于缺乏增殖力旺盛的干细胞，同时老化软骨的软骨细胞体外增殖能力较差，因此可将关节软骨中酶解出的软骨细胞，与生长因子如TGF-β和bFGF共同进行体外培养，使细胞停止产生软骨特异性的表型——Ⅱ型胶原，但软骨细胞的数量却成百倍增加，然后去除高密度培养，重新恢复软骨细胞表型，形成透明软骨。这种方法可提供大量的自体软骨细胞，为组织工程化软骨修复大面积骨关节病的软骨缺损开辟了一条新途径。
(二)刺激软骨细胞分化的生长因子
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在成年动物中，BMP可诱导软骨内成骨，表明来源于BMP的诱导信号在软骨和骨形成中意义重大。1991年，Harrison等[25]发现，BMP-3(也称osteogenin)在无血清培养基中能促使反分化的关节软骨细胞重新表达软骨表型。说明在多肽类生长因子存在的情况下，BMP-3可诱导软骨细胞锚着生长，所形成的集落可产生含有蛋白多糖和Ⅱ型胶原的细胞外基质。这一结果提示，BMP-3可能在骨关节病和关节创伤的软骨修复中发挥一定的作用。
1993年，Chen等[26]在研究过程中发现，在对软骨细胞的长期培养中不断添加低浓度的BMP-7(osteogenic protein,OP-1)可刺激软骨细胞生长。1998年，Klein-Nulend等[27]在进行人和羊软骨膜外植块组织培养时，将BMP-7浓度增加至10～40ng/ml，一次性加入培养液中，对软骨生长具有明显的刺激作用。重组人OP-1在刺激软骨细胞分化及软骨基质产生方面对软骨膜有一定作用，这为进一步研究rhOP-1修复关节软骨退变提供了重要线索。
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Matrigel是一种含有基质分子和生长因子的天然肿瘤抽提物，能刺激继发性的软骨干细胞重新表达蛋白多糖，并使软骨细胞呈典型的圆形形态，形成软骨组织[28]。现已从Matrigel中分离出一些生长和分化因子，包括TGF-β和bFGF。继发性的软骨干细胞也能对诱导信号发生反应，表明这些细胞可与软骨发生因子相结合，加入到可降解的具有生物相容性的生物基质中，在软骨修复中发挥作用。
上述生长因子等刺激因素形成的继发性软骨干细胞，在生物反应器的体外环境中，结合生物可降解的多聚体所形成的组织工程化软骨的生物学特性以及机械特性尚需进一步研究加以确定；对以这种方法制备的新生软骨在植入关节填补缺损后的成活和功能情况也需通过进一步研究而加以评估。
参考文献
1，Reddi AH. Symbiosis of biotechnology and biomaterials: applications in tissue engineering of bone and cartilage. J Cell Biochem, 1994, 56:192-195.
, 百拇医药
2，Service RF. Designer tissues take hold. Science, 1995,270:230- 232.
3，Boyce ST, Goretsky MJ, Greenhalgh DG, et al. Comparative assessment of cultured skin substitutes and native skin autograft for treatment of full- thickness burns. Ann Surg, 1995, 222:743- 752.
4，Kwan MK, Coutts RD, Woo SL, et al. Morphological and biomechanical evaluations of neocartilage from the repair of full- thickness articular cartilage defects using rib perichondrium autografts: a long- term study. J Biomech, 1989, 22:921- 930.
, 百拇医药
5，O Driscoll SW, Salter RB. The induction of neochondrogenesis in free intra- articular periosteal autografts under the influence of continuous passive motion: an experimental investigation in the rabbit. J Bone Joint Surg (Am), 1984, 66:1248- 1257.
6，Kwan MK, Wayne JS, Woo SL, et al. Histological and biomechanical assessment of articular cartilage from stored osteochondral shell allografts. J Orthop Res, 1989, 7:637- 644.
7，Freed LE, Marquis JC, Nohria A, et al. Neocartilage formation in vitro and in vivo using cells cultured on synthetic biodegradable polymers. J Biomed Mater Res, 1993, 27:11- 23.
, http://www.100md.com
8，Bruckner P, Horler I, Mendler M, et al. Induction and prevention of chondrocyte hypertrophy in culture. J Cell Biol, 1989,109:2537-2545.
9，Tacchetti C, Tavella S, Dozin B, et al. Cell condensation in chondrogenic differentiation. Exp Cell Res, 1992, 200:26-33.
10，Woerly S, Laroche G, Marchand R, et al. Intracerebral implantation of hydrogel- coupled adhesion peptides: tissue reaction. J Neural Transplant Plast, 1995, 5:245- 255.
, http://www.100md.com
11，Aebischer P, Bellamkonda R. Review: tissue engineering in the nervous system. Biotech Bioeng, 1993,43:543-554.
12，Sittinger M,Schultz O, Keyszer G, et al. Artificial tissues in perfusion culture. Int J Artif Organs, 1997, 20:57-62.
13，Sittinger M, Reitzel D, Dauner M, et al. Resorbable polyesters in cartilage engineering: affinity and biocompatibility of polymer fiber structures to chondrocytes. J Biomed Mater Res, 1996, 33:57-63.
, http://www.100md.com
14，Freed LE, Vunjak- Novakovic G, Biron RJ, et al. Biodegradable polymer scaffolds for tissue engineering. Biotechnology, 1994, 12:689-693.
15，Sims CD, Butler PE, Cao YL, et al. Tissue engineered neocartilage using plasma derived polymer substrates and chondrocytes. Plast Reconstr Surg, 1998, 101:1580-1585.
16，Ingber DE, Dike L, Hansen L, et al. Cellular tensegrity: exploring how mechanical changes in the cytoskeleton regulate cell growth, migration, and tissue pattern during morphogenesis. Int Rev Cytol, 1994, 150: 173-224.
, 百拇医药
17，Folkman J,Moscona A.Role of cell shape in growth control.Nature,1978,273:345- 349.
18，Thilly WG, Levine DW. Microcarrier culture: a homogeneous environment for studies of cellular biochemistry. Methods Enzymol,1979, 58:184-194.
19，Hu WS. Bioreactors for animal cell cultivation. In:Vardar- Sukan F, Sukan SS,eds. Recent advances in biotechnology. Netherlands: Kluwer, 1992. 243-261.
20，Niklason LE,Langer RS.Advances in tissue engineering of blood vessels and other tissues.Transpl Immunol, 1997,5:303-306.
, 百拇医药
21，Freed LE, Langer R, Martin I, et al. Tissue engineering of cartilage in space. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94:13885-13890.
22，Salter RB. The biological concept of continuous passive motion of synovial joints: the first 18 years of basic research and its clinical application. In:Ewing JW,eds. Articular cartilage and knee joint function. New York: Raven Press, 1990. 335-353.
23，Gorman L, Mercer LP, Hennig B. Growth requirements of endothelial cells in culture: variations in serum and amino acid concentrations. Nutrition, 1996, 12:266- 270.
, 百拇医药
24，Bradham DM, Horton WE Jr. In vivo cartilage formation from growth factor modulated articular chondrocytes. Clin Orthop, 1998, (352):239-249.
25，Harrison ET Jr, Luyten FP, Reddi AH. Osteogenin promotes reexpression of cartilage phenotype by dedifferentiated articular chondrocytes in serum- free medium. Exp Cell Res, 1991, 192:340-345.
26，Chen P,Vukicevic S,Sampath TK,et al. Bovine articular chondrocytes do not undergo hypertrophy when cultured in the presence of serum and osteogenic protein- 1.Biochem Biophys Res Commun, 1993,197:1253-1259.
, http://www.100md.com
27，Klein- Nulend J,Louwerse RT,Heyligers IC, et al. Osteogenic protein (OP-1, BMP-7) stimulates cartilage differentiation of human and goat perichondrium tissue in vitro. J Biomed Mater Res, 1998, 40:614-620.
28，Bradham DM, Passaniti A, Horton WE Jr. Mesenchymal cell chondrogenesis is stimulated by basement membrane matrix and inhibited by age- associated factors. Matrix Biol, 1995, 14:561-571.
(收稿日期:1999-02-26), http://www.100md.com
单位：100083北京大学第三医院运动医学研究所
关键词：
中华骨科杂志000908
组织工程学是近年生物医学科学发展的新领域,Reddi[1]将组织工程学定义为：制备用于替代缺损组织而再生新组织的一门科学。在这个领域中，细胞生物学家、工程学家以及外科医生合作，使用人体活细胞和各种生物材料构建人造的结缔组织、上皮组织及神经组织等[2]。其中人造皮肤是生物工程研究领域中较早、同时也是已取得较成熟研究成果的课题之一[3]。构建与正常软骨生物学及机械特性相近的人造软骨和骨组织，是当前组织工程学的研究重点之一。
一、关节软骨损伤的修复现状
, 百拇医药
成熟关节软骨的自身修复能力较差，除与软骨内无血管、缺乏未分化的软骨细胞及软骨细胞被固定在一个致密的由胶原和蛋白多糖组成的固体基质中有关外，可能还与以下两个因素有关:(1)内在修复依赖于软骨细胞有丝分裂及短期内增加的代谢产物(主要是胶原和蛋白多糖)，而成熟软骨细胞有丝分裂能力极低；(2)外部愈合依赖于来自软骨下骨的间充质成分的参与，形成新的结缔组织，经过一系列变化形成纤维软骨。在关节创伤的愈合过程中，已受损或破坏的关节软骨由纤维软骨修复，易发展成为骨关节炎。而以软骨细胞为基础的软骨组织修复工程，通过透明软骨促进新的软骨形成，可改进修复组织的质量。
治疗创伤和骨关节炎(osteoarthritis,OA)引起的关节软骨损伤的传统方法主要包括:(1)组织移植，即取自体健康软骨，修剪成理想的形状，再重新植回体内，或以自体软骨膜[4]、骨膜移植[5]，也可以用异体骨软骨片移植[6]；(2)置入人造假体，然而由于软骨缺损范围一般较大，而供体组织数量有限，不可能修成所需要的三维结构(3D)置入物。再者人造假体易继发感染或松动，而且不像活体软骨组织和骨组织那样适应周围组织的应力变化，对年轻OA患者则更不适宜行假体置换。为了适应临床需求，重建外科将这一课题的研究重点转移至用体外多聚体支架培养分离的软骨细胞，形成再生软骨，以满足临床修复软骨缺损所需要的三维植入物。这样在未来的临床应用中，使用自体植入物即可以减少对有严重副作用的免疫排斥剂的需求。
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目前有关软骨再生的报道很多，诸如在皮下注射软骨细胞形成小的软骨结节[7]；利用软骨膜片将培养分离的软骨细胞固定在软骨缺损部位使软骨再生，但这种方法技术操作比较困难，可修复缺损的范围也有限[1]；用琼脂糖包裹软骨细胞形成细胞悬液进行体外培养，可使营养物质充分弥散和新合成的软骨基质聚积，且软骨细胞能维持分化表型，并在体外产生蛋白多糖和胶原(包括Ⅱ型胶原)等典型的软骨基质成分。然而以琼脂糖作为支架不能维持植入物的原始构型，而且形成的植入物较软。因此，修复大面积软骨缺损理想的生物载体材料应是形状可控制的三维支架结构的体内植入物，软骨细胞在这种结构中能增殖分化，并形成具有正常软骨成分(主要指糖胺聚糖和Ⅱ型胶原，以及具有相应的生物机械特性)的再生软骨。
二、组织工程软骨的组成
组织工程软骨的培养过程主要有以下三个步骤:(1)首先在体外进行单层培养，通过生长因子的调节，扩增出足够的软骨细胞；(2)将扩增的软骨细胞接种到合适的生物支架上，以维持组织工程软骨的三维结构及恢复组织分化表型；(3)选择合适的生物反应器以长期维持组织工程细胞的分化表型及基质再生。
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(一)软骨细胞的分离及培养
通过酶解活检标本获得软骨细胞，然后在体外进行单层培养，应用生长因子等使软骨细胞传代扩增。但随着细胞数量的增加，逐渐失去其分化表型，为了维持软骨细胞的分化表型，必须以高细胞密度方式进行培养[8,9]。其中生物反应器在维持组织工程化软骨的分化表型及新陈代谢方面效果尤佳。
(二)多聚体支架的要求及种类
控制培养组织分化被视为所有组织工程的核心步骤。细胞的锚着(anchorage)以及人工组织支架的组织相容性都对再生软骨组织的典型特性表达有影响。在细胞培养前2～3周，软骨细胞可形成足够的细胞外基质，为植入物提供机械上的完整性。此后支架应自行逐渐降解以减少体内因植入异物而发生继发性炎症的危险，并为再生的软骨组织提供充分的空间。支架降解率应与靶细胞组织的再生率相一致。多孔径材料的多聚体支架，孔径所占的空间可达总体积的90%以上，为软骨细胞和多聚体相互接触提供充分的表面积。这样，有利于细胞外基质的再生，减少扩散障碍，为再生软骨基质提供足够的空间。为了改进细胞锚着，可在所用生物基质表面涂抹合成聚合体[10]、肽类或细胞外基质蛋白，如多聚赖氨酸、纤维连接素、软骨连接素、粘连蛋白等[11]。在体外，细胞与支架结合后，继而的培养主要是支持细胞分化；对软骨细胞而言，在三维培养环境中，软骨细胞呈圆形能够启动软骨细胞再分化，刺激软骨组织特异性Ⅱ型胶原的合成。
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目前所用的多聚体支架主要包括Ethisorb、V7-2、Ⅰ型胶原及聚乙醇酸(polyglycolic acid，PGA)等。Ethisorb又称为VicrylTM，主要由PGA与低分子左旋聚乳酸(poly-L-lacticacid，PLLA)以90∶1的比例合成，这种成分作为外科缝线材料已在临床使用多年，体外降解时间约3周[12]；V7-2仅由PLLA组成，降解时间约9个月，适用于需要在体外进行长期培养的组织工程[13]。利用Ⅰ型胶原基质作为支架，在体外培养软骨细胞后进行同种异体移植修复软骨缺损，经长期随访表明，修复组织的生物学特性接近正常关节软骨。由于牛胶原不能复制(reproducibility)，故不是一理想的生物载体材料[14]。PGA的纤维直径为12～14μm，其内约97%中空，降解时间约4周，降解产物呈酸性，使支架周围的局部pH值降低，利于软骨细胞蛋白多糖的合成，符合以上三维可降解生物支架标准，适用于软骨组织工程[14]。
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软骨细胞-PGA中组织再生的动力学与三维张力依赖性模型有关，这样就可以解释为何机械作用力的平衡会对软骨细胞的形状和功能产生影响。在这一模型中，底物的机械特性决定了所培养的细胞是增殖还是分化:坚硬底物诱导增殖，而柔韧底物诱导分化[16]。软骨细胞以多层球形构型粘附到生物支架纤维的表面，越贴近PGA纤维表面的细胞，糖胺聚糖的分泌量越多[14]。此现象与Folkman等[17]的推测相吻合，即细胞如被培养于能维持其构象的培养底物表面，即可在体外被诱导表达其分化表型。细胞-PGA结构有足够的硬度促使细胞增殖，分泌细胞外基质，形成外在的胶原包囊。这些现象表明，支架设计参数和体外培养环境对软骨细胞表型和软骨再生具有重要作用。
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(三)生物反应器的种类与优缺点
当细胞增殖后，必须进行诱导以维持细胞的分化，因此组织载体应被转移至生物反应器这一特殊的培养容器内，并不断更换新鲜的培养液。为了适应各种生物技术的需要，生物反应器从外形设计到内在功能均已取得长足进步。例如，超过105L的大型生物反应器现已比较成熟，用于微生物细胞生物制品(如青霉素)的常规生产。用于组织工程的小型生物反应器一般不超过0.5L。目前此类生物反应器尚处于不断改进更新阶段。在组织工程学研究中，生物反应器与静止培养皿相比更具有优势:(1)载体材料与培养细胞混合得更加充分、均匀，并能更好的控制物质交换速率，使培养环境保持稳态；(2)可调整容器中的流体剪切力；(3)可维持恒定的酸碱环境、部分气体压力(PO2、PCO2)及营养水平(如葡萄糖)；(4)在整个培养过程中，都能随着植入物的生长变化而满足其需求。
生物反应器可分为以下4种:(1)机械搅拌式生物反应器[18]；(2)流体循环式生物反应器[19]；(3)旋转式微重力生物反应器；(4)灌注式生物反应器。其中，机械搅拌式生物反应器多用于哺乳动物的细胞培养，然而其混合强度在机械搅拌过程中变化很大，助力器表面的剪切率比生物反应器的其它部位高10倍。这种生物反应器的剪力梯度与营养酸碱度变化曲线及不均匀的物体交换率有关，可影响细胞生长和功能，且助力器本身在植入物培养的早期会产生干扰细胞-支架的相互作用。1992年，Hu[19]提出使用继发性液流替代机械性搅拌混合,依赖液体循环的新型生物反应器又称airlift reactors(ALR)和fluidized bed reactors(FBR),它所培养的杂交瘤细胞的细胞密度和所产生的单克隆抗体比在振荡式培养容器中提高10倍。应用旋转式微重力生物反应器进行组织培养实验，结果显示模拟微重力环境的生物反应器可使细胞发生分化，在微重力环境下聚集体单位横切面上的作用力约比重力条件下相应数值低一个数量级。灌注式生物反应器，按容器设计不同又分为4种:(1)构建物暴露于动力性压力下；(2)构建物暴露于跳动的腔内液流下[20]；(3)构建物固定于针上，在培养过程中用MRI进行监测；(4)旋转壁灌注容器[21]。
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软骨再生与关节活动所产生的应力一样,对损伤软骨的结构修复在某种程度上也依赖于机械应力的大小，可控的较小的剪切应力可增强植入物的生物机械特性[22]。因此，在软骨细胞增殖和软骨再生过程中，应优化生物反应器的工作状态，使物质交换率和剪切应力之间维持最佳平衡状态。
(四)培养液对软骨细胞分化的影响
在人工再生组织中，培养液是控制细胞分化的关键，但容易被忽视[23]。目前，商品化的培养液主要用于增殖细胞。例如，原来认为神经组织只能在胚胎时期增殖，但现已证实，在有丝分裂后期的成熟阶段也有增殖。其它许多组织器官也存在这种现象，其中有的细胞可停留在有丝分裂的G1期多年。因此，组织工程首先要经过增殖阶段，然后再是分化阶段。有丝分裂和分裂间期是渐进的不相平行的过程，因此组织工程必须调整培养液使被培养的细胞进入有丝分裂周期。就增殖环境而言，一般含有生长因子和胎牛血清的培养液比较适合；而对于分化而言，必须减少生长因子和胎牛血清的含量，还要对培养基中的电解质成分进行特别调整[24]。
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三、细胞因子在软骨组织工程中的应用展望
除了人工合成可降解的生物多聚体支架和生物反应器外，组织工程软骨最终的大小及机械特性在某种程度上依赖于基质支架中软骨细胞的起始浓度。因此，如何通过实验方法控制组织细胞的分化及反分化，以及刺激组织细胞增殖，提高培养细胞的密度则显得尤为重要。
(一)刺激软骨细胞增殖的生长因子
由于老年骨关节病患者由于缺乏增殖力旺盛的干细胞，同时老化软骨的软骨细胞体外增殖能力较差，因此可将关节软骨中酶解出的软骨细胞，与生长因子如TGF-β和bFGF共同进行体外培养，使细胞停止产生软骨特异性的表型——Ⅱ型胶原，但软骨细胞的数量却成百倍增加，然后去除高密度培养，重新恢复软骨细胞表型，形成透明软骨。这种方法可提供大量的自体软骨细胞，为组织工程化软骨修复大面积骨关节病的软骨缺损开辟了一条新途径。
(二)刺激软骨细胞分化的生长因子
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在成年动物中，BMP可诱导软骨内成骨，表明来源于BMP的诱导信号在软骨和骨形成中意义重大。1991年，Harrison等[25]发现，BMP-3(也称osteogenin)在无血清培养基中能促使反分化的关节软骨细胞重新表达软骨表型。说明在多肽类生长因子存在的情况下，BMP-3可诱导软骨细胞锚着生长，所形成的集落可产生含有蛋白多糖和Ⅱ型胶原的细胞外基质。这一结果提示，BMP-3可能在骨关节病和关节创伤的软骨修复中发挥一定的作用。
1993年，Chen等[26]在研究过程中发现，在对软骨细胞的长期培养中不断添加低浓度的BMP-7(osteogenic protein,OP-1)可刺激软骨细胞生长。1998年，Klein-Nulend等[27]在进行人和羊软骨膜外植块组织培养时，将BMP-7浓度增加至10～40ng/ml，一次性加入培养液中，对软骨生长具有明显的刺激作用。重组人OP-1在刺激软骨细胞分化及软骨基质产生方面对软骨膜有一定作用，这为进一步研究rhOP-1修复关节软骨退变提供了重要线索。
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Matrigel是一种含有基质分子和生长因子的天然肿瘤抽提物，能刺激继发性的软骨干细胞重新表达蛋白多糖，并使软骨细胞呈典型的圆形形态，形成软骨组织[28]。现已从Matrigel中分离出一些生长和分化因子，包括TGF-β和bFGF。继发性的软骨干细胞也能对诱导信号发生反应，表明这些细胞可与软骨发生因子相结合，加入到可降解的具有生物相容性的生物基质中，在软骨修复中发挥作用。
上述生长因子等刺激因素形成的继发性软骨干细胞，在生物反应器的体外环境中，结合生物可降解的多聚体所形成的组织工程化软骨的生物学特性以及机械特性尚需进一步研究加以确定；对以这种方法制备的新生软骨在植入关节填补缺损后的成活和功能情况也需通过进一步研究而加以评估。
参考文献
1，Reddi AH. Symbiosis of biotechnology and biomaterials: applications in tissue engineering of bone and cartilage. J Cell Biochem, 1994, 56:192-195.
, 百拇医药
2，Service RF. Designer tissues take hold. Science, 1995,270:230- 232.
3，Boyce ST, Goretsky MJ, Greenhalgh DG, et al. Comparative assessment of cultured skin substitutes and native skin autograft for treatment of full- thickness burns. Ann Surg, 1995, 222:743- 752.
4，Kwan MK, Coutts RD, Woo SL, et al. Morphological and biomechanical evaluations of neocartilage from the repair of full- thickness articular cartilage defects using rib perichondrium autografts: a long- term study. J Biomech, 1989, 22:921- 930.
, 百拇医药
5，O Driscoll SW, Salter RB. The induction of neochondrogenesis in free intra- articular periosteal autografts under the influence of continuous passive motion: an experimental investigation in the rabbit. J Bone Joint Surg (Am), 1984, 66:1248- 1257.
6，Kwan MK, Wayne JS, Woo SL, et al. Histological and biomechanical assessment of articular cartilage from stored osteochondral shell allografts. J Orthop Res, 1989, 7:637- 644.
7，Freed LE, Marquis JC, Nohria A, et al. Neocartilage formation in vitro and in vivo using cells cultured on synthetic biodegradable polymers. J Biomed Mater Res, 1993, 27:11- 23.
, http://www.100md.com
8，Bruckner P, Horler I, Mendler M, et al. Induction and prevention of chondrocyte hypertrophy in culture. J Cell Biol, 1989,109:2537-2545.
9，Tacchetti C, Tavella S, Dozin B, et al. Cell condensation in chondrogenic differentiation. Exp Cell Res, 1992, 200:26-33.
10，Woerly S, Laroche G, Marchand R, et al. Intracerebral implantation of hydrogel- coupled adhesion peptides: tissue reaction. J Neural Transplant Plast, 1995, 5:245- 255.
, http://www.100md.com
11，Aebischer P, Bellamkonda R. Review: tissue engineering in the nervous system. Biotech Bioeng, 1993,43:543-554.
12，Sittinger M,Schultz O, Keyszer G, et al. Artificial tissues in perfusion culture. Int J Artif Organs, 1997, 20:57-62.
13，Sittinger M, Reitzel D, Dauner M, et al. Resorbable polyesters in cartilage engineering: affinity and biocompatibility of polymer fiber structures to chondrocytes. J Biomed Mater Res, 1996, 33:57-63.
, http://www.100md.com
14，Freed LE, Vunjak- Novakovic G, Biron RJ, et al. Biodegradable polymer scaffolds for tissue engineering. Biotechnology, 1994, 12:689-693.
15，Sims CD, Butler PE, Cao YL, et al. Tissue engineered neocartilage using plasma derived polymer substrates and chondrocytes. Plast Reconstr Surg, 1998, 101:1580-1585.
16，Ingber DE, Dike L, Hansen L, et al. Cellular tensegrity: exploring how mechanical changes in the cytoskeleton regulate cell growth, migration, and tissue pattern during morphogenesis. Int Rev Cytol, 1994, 150: 173-224.
, 百拇医药
17，Folkman J,Moscona A.Role of cell shape in growth control.Nature,1978,273:345- 349.
18，Thilly WG, Levine DW. Microcarrier culture: a homogeneous environment for studies of cellular biochemistry. Methods Enzymol,1979, 58:184-194.
19，Hu WS. Bioreactors for animal cell cultivation. In:Vardar- Sukan F, Sukan SS,eds. Recent advances in biotechnology. Netherlands: Kluwer, 1992. 243-261.
20，Niklason LE,Langer RS.Advances in tissue engineering of blood vessels and other tissues.Transpl Immunol, 1997,5:303-306.
, 百拇医药
21，Freed LE, Langer R, Martin I, et al. Tissue engineering of cartilage in space. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94:13885-13890.
22，Salter RB. The biological concept of continuous passive motion of synovial joints: the first 18 years of basic research and its clinical application. In:Ewing JW,eds. Articular cartilage and knee joint function. New York: Raven Press, 1990. 335-353.
23，Gorman L, Mercer LP, Hennig B. Growth requirements of endothelial cells in culture: variations in serum and amino acid concentrations. Nutrition, 1996, 12:266- 270.
, 百拇医药
24，Bradham DM, Horton WE Jr. In vivo cartilage formation from growth factor modulated articular chondrocytes. Clin Orthop, 1998, (352):239-249.
25，Harrison ET Jr, Luyten FP, Reddi AH. Osteogenin promotes reexpression of cartilage phenotype by dedifferentiated articular chondrocytes in serum- free medium. Exp Cell Res, 1991, 192:340-345.
26，Chen P,Vukicevic S,Sampath TK,et al. Bovine articular chondrocytes do not undergo hypertrophy when cultured in the presence of serum and osteogenic protein- 1.Biochem Biophys Res Commun, 1993,197:1253-1259.
, http://www.100md.com
27，Klein- Nulend J,Louwerse RT,Heyligers IC, et al. Osteogenic protein (OP-1, BMP-7) stimulates cartilage differentiation of human and goat perichondrium tissue in vitro. J Biomed Mater Res, 1998, 40:614-620.
28，Bradham DM, Passaniti A, Horton WE Jr. Mesenchymal cell chondrogenesis is stimulated by basement membrane matrix and inhibited by age- associated factors. Matrix Biol, 1995, 14:561-571.
(收稿日期:1999-02-26), http://www.100md.com