细胞凋亡在脊髓损伤中作用的实验研究

http://www.100md.com 《现代康复》 2000年第9期

     作者：蒋赞利 陈君长 王坤正

    单位：西安交通大学第二附属医院，陕西 西安 710004

    关键词：脊髓损伤；细胞凋亡

    现代康复000934

    摘要:目的 探讨细胞凋亡在脊髓损伤发病机理中的作用。方法 采用原位末端标记法，对大鼠脊髓损伤不同时间脊髓组织中凋亡细胞的数目和部位进行观察和分析，并作正常对照。结果 损伤后灰质和白质均检测到凋亡细胞，神经元凋亡少见，胶质细胞凋亡多见。细胞凋亡发生在损伤后12h～4周，以4d时达到高峰，至4周时渐趋于正常。结论 大鼠脊髓损伤后神经元和胶质细胞均发生细胞凋亡，而以胶质细胞凋亡常见。

    中图分类号:R744 文献标识码:A

    文章编号:1007-5496(2000)09-1342-02

    The role of apoptosis in spinal cord injury in rat

    JIANG Zan-li,CHEN Jun-chang,WANG Kun-zheng

    (Department of Orthopaedics ,the Second Teaching Hospital of Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710004,China)

    Abstract： Objective To study the role of apoptosis in spinal cord injury.Methods Forty rats with spinal cord injury were made with Allen weight drop and spinal cord tissues were removd from 1 h to 4w after injury.The number and position of apoptosis was observed with in situ end labeling. Results Apoptotic cells appeared from 12 h to 4w,and arrived to peak at 4d after injury in both gray and white matter. Conclusion Apoptosis occurs in both neurons and glial cells after spinal cord injury in rats,especially in the latter one.

    Key words：spinal cord injury;apoptosis

    传统观点认为，脊髓损伤后神经元与胶质细胞的死亡方式是坏死,这种观点受到了越来越严峻的挑战。最新的研究显示，细胞凋亡可能参与了脊髓损伤的病理生理过程^[1]。本研究通过对大鼠脊髓损伤后脊髓组织中细胞凋亡的观察和分析，旨在对脊髓损伤的病理过程作出新的解释。

    1 资料与方法

    1.1动物模型的制备健康成年SD大鼠40只，体重为(280±20)g，随机分为2组，其中1组4只，为对照组。其余36只按改良的Allen打击法制成重度脊髓损伤模型。2%戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔麻醉,后正中切口，切除T8～10椎板，暴露脊髓，在硬膜表面垫一塑料垫片，用重7.5g砝码在玻璃试管的引导下从20cm高处垂直坠落，打击T9脊髓节段组织。

    1.2组织切片的制备将大鼠按损伤后1h,4h,12h,1d,4d,1周，2周，3周和4周共9个时间段分批处死。切取每只大鼠T8～10节段脊髓组织，4%甲醛固定24h,石蜡包埋，组织纵向切片，片厚约5μm。

    1.3原位末端标记法采用德国宝灵曼公司试剂，具体流程如下：组织切片常规脱蜡后，滴加2μg/ml蛋白酶K，双蒸水漂洗。将样片浸入TdT缓冲液(30mmol/L,Trizma基础液，pH7.2，140mmol/L碳酸氢钠二甲胂酸盐，1mmol/LCoC12),再孵育于Tunel反应液(50μlTdT缓冲液8.3u，TdT1nmol地高辛基体11-αUTP)。用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗后，滴加碱性磷酸酶，再用PBS漂洗。将样片置于碱性磷酸酶显色底物(NBT/BCIP)液中避光显色，后双蒸水终止反应。核固红复染，封固，显微镜观察照相,同时做Tunel法染色对照试验，Tunel反应液中不加TdT酶。

    凋亡细胞在原位末端标记后呈黄褐色，称为阳性细胞,分别计数灰质和白质中阳性细胞数目,在高倍镜(400倍)随机观察6个视野。

    1.4数据统计与分析所有数据均用±s表示，做计量资料的t检验，P<0.05表示有显著性差异。

    2 结果

    原位末端标记法检测结果：(1)对照组：组织切片标记后清晰显示出脊髓组织的正常结构，灰质和白质易区分，神经元和胶质细胞均蓝染，黄褐色的阳性细胞罕见，约0～2个凋亡细胞/视野，背景良好。(2)重度损伤组：伤后1h，4h，灰质灶状出血，神经元变性坏死，胶质细胞略增多，阳性细胞罕见。伤后12h，1d，灰质大多数神经元坏死，核溶解，少量胶质细胞和神经元呈阳性着色，白质中胶质细胞呈阳性着色增多。伤后4d，灰质神经元大多数坏死，神经元数目减少，神经元呈阳性者增多，胶质细胞中阳性细胞数目极多。伤后1周，2周，3周，阳性细胞数目开始减少，至4周时阳性细胞数目进一步减少，灰白质中细胞数目很少。伤后不同时间灰质和白质中每视野凋亡细胞数目见表1。

    从表1可见，伤后12h起，胶质细胞也开始发生凋亡，且随时间逐渐增多，至伤后4d时，凋亡细胞数目达到最高值，以后又逐渐减少。至伤后4周时，凋亡细胞数目呈一致变化。同样，伤后12h起，神经元也发生凋亡，且在伤后4d时达到高峰，伤后3周时，无神经元凋亡。

    3 讨论

    长期以来，脊髓损伤作为世界医学界尚未解决的重大课题之一，受到各国专家的关注。目前，脊髓损伤的基础研究主要集中脊髓损伤后脊髓内继发病理损伤的预防和逆转。阻止神经元和胶质细胞的死亡是脊髓损伤早期治疗的最重要的目标。脊髓损伤导致神经元、胶质细胞和微血管细胞的死亡，早期的实验研究中，人们的注意力集中在其坏死形式，未发现凋亡。1994年有报道，成熟动物脑缺血后发生细胞凋亡^[2]，人们才开始重新认识

    表1 大鼠脊髓重度损伤后不同时间凋亡细胞数目(个/视野)(±s)

    灰质

    白质

    伤后时间

    神经元

    胶质细胞

    胶质细胞

    1h

    0

    1±1

    1±2

    4h

    0

    4±2

    2±2

    12h

    3±2

    28±8

    14±4

    24h

    5±3

    87±16

    62±18

    4d

    8±3

    184±32

    89±22

    1周

    4±2

    93±21

    45±26

    2周

    2±1

    58±17

    37±14

    3周

    0

    25±11

    18±9

    4周

    0

    11±6

    注：与伤后1h比较，P<0.05,P<0.01,P<0.001

    神经细胞损伤后的死亡方式。1997年有报道大鼠脊髓损伤后检测到细胞凋亡^[3]，由此有学者认为细胞凋亡可能参与了脊髓损伤的病理生理过程。

    细胞凋亡，又称程序性细胞死亡，是有核细胞在一定条件下通过启动自身内部机制，主要是内源性DNA内切酶的激活，而发生的死亡过程，是受基因调控的主动的细胞死亡方式，与坏死有着本质的不同，其基本特征为：细胞核浓缩，细胞质凝聚，细胞碎裂成环状小体，DNA断裂呈梯状结构，常规染色的组织切片不易检测出凋亡细胞，而原位末端标记法是将凋亡特异的末端酶打开DNA的末端缺口，掺入特殊着色成份，其敏感性和特异性极高，是当前国际上公认的凋亡检测的手段^[4]。用更多更详细的分子细胞学内容描述脊髓损伤病理过程成为优先考虑的目标，达到这个目的则要建立急性脊髓损伤的标准动物模型。现常用的模型主要选用大白鼠，以胸髓损伤作为典型，大鼠T8～10节脊椎应力最小，椎板切除后对整个脊柱的生理弯曲及力学支撑影响不大且术后易于护理，做T9致伤较为理想。改良Allen打击法已成为目前较为通用的，控制性好的模型制作方法^[5]，不同的致伤冲量造成脊髓分级损伤的中、重度^[5]，分别对应于临床分级的不完全性截瘫和完全性截瘫。

    本研究通过对大鼠脊髓损伤后脊髓组织采用原位末端标记法观察细胞凋亡状况，证实了脊髓损伤确实发生细胞凋亡。本研究中，损伤后在灰质和白质中均检测到细胞凋亡，表明脊髓损伤后，神经元和胶质细胞均发生细胞凋亡。而神经元凋亡少见，胶质细胞凋亡多见这一现象提示，胶质细胞发生细胞凋亡在脊髓损伤的病理生理过程中占主要作用。Liu发现凋亡的胶质细胞未表达特异性的酸性胶质蛋白GFAP(GFAP为星形胶质细胞的特异性蛋白)，而形态学表现为少突胶质细胞^[6]。因此他认为脊髓损伤后主要是少突胶质细胞发生凋亡。少突胶质细胞分布在灰、白质中，在白质的纤维之间排列成行，它们包绕轴突，形成髓鞘。髓鞘主要由髓磷脂构成，能有效地排斥水和水溶性物质，因而髓鞘在神经纤维传导冲动时有绝缘作用。少突胶质细胞凋亡，则髓鞘的形成出现障碍。脊髓损伤所致的慢性脱髓鞘改变由少突胶质细胞凋亡作出了合理的解释。

    细胞凋亡的研究对于脊髓损伤的发病机制具有重要的意义。脊髓损伤后细胞凋亡的客观存在及其在时间和空间上的分布特征，更深刻更全面地揭示了脊髓损伤的病理生理过程，从一个新的角度和高度，对以往阐述不清的问题，包括对继发损伤的重新认识作出了更合理的解释。更为重要的是，细胞凋亡的研究不仅有助于阐明脊髓损伤的发病机制，而且必然导致脊髓损伤新疗法的问世。脊髓损伤后不但存在急性期的细胞坏死，也存在亚急性的细胞凋亡。细胞凋亡持续3～4周之久，大大拓宽了以往只有8h黄金治疗的机会窗，使得治疗途径多样化，治疗时间充裕化，必将使得治疗效果大大前进一步。利用细胞凋亡规律，有效地调控细胞凋亡，是治疗脊髓损伤的新思路、新途径，其中药物干预和基因治疗将是最有希望的治疗手段。

    作者简介：蒋赞利(1971-)，男，陕西人，博士，研究方向：脊柱外科。

    参考文献：

    [1]Barinaga M.New view of spinal cord injury[J].Science,1996,274 (5292):1466

    [2]Macmanus JP,Hill JE,Huang ZG,et al.DNA damge consistsnt with apoptosis in transient focal ischemic neocortex[J].Neuro Report,1994, 5:493- 496

    [3]Crowe MJ,Bresnahan JC,Shuman SL,et al.Apoptosis and delayed de generation after spinal cord injury in rats and monkeys[J].Nat Med,1997,3(1):73- 76

    [4]Jan H,Wijsman,Richard R,et al.A new method to detect apoptosis in paraffin sections in situ end labeling of fragmented DNA[J].J Histochem，1993,41(1):7- 12

    [5]Wrathall JR,Pettegrew RW,Harey F.Spinal cord contusion in the rat: production of graded,reproducible injury groups[J].Exp Neurol,1985,88:108- 111

    [6]Li GL,Brodin G,Farooque M,et al.Apoptosis and expression of bcl- 2 after compression trauma to rat spinal cord[J].J Neuropathol Exp Neurol, 1996,55(3):280- 289

    收稿日期：2000-06-22

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