脑梗死病人急性期血小板密度、细胞内游离钙及其功能的变化
作者：白颖 曹凤林 李柏岩
单位：白颖(哈尔滨市第一医院神经内科，150010)；曹凤林(哈尔滨市第一医院血液病研究所)；李柏岩(哈尔滨医科大学药理教研室)
关键词：脑梗死；血小板；密度；血小板聚集；释放反应；钙；梯度离心；Fluo-3；AM；共聚焦显微镜检查
中国急救医学000907 [摘 要] 目的 观察脑梗死病人急性期血小板密度、细胞内游离钙浓度及 血小板聚集和释放的变化。方法 以梯度离心法制备血小板密度亚 群，激光共聚焦显微镜法测定Fluo-3/AM负载后血小板细胞内游离钙荧光强度的变化，以透 光度法和介质中ATP的量评价血小板的凝集和释放反映。对照组和实验组血小板分别来自于 正常志愿者和脑梗死病人急性期的静脉血。结果 ①Percoll梯度离 心的结果表明，脑梗死病人急性期血液中高密度亚群(比重>1.062)血小板的数量与对照组 〔(24.6±8.6)%，n＝5〕比较显著增多〔(52.1±11.4)%，n＝6，P<0.001〕，上 述结果与共聚焦显微镜直接观察的结果一致。②与对照组相比3 μΜ ADP介导的聚集反应 增强〔(69.4±19.8)%，P<0.01〕，介质中ATP的含量为1.26±0.44(P<0.0 1) 。③对照组和实验组细胞内钙的静息水平无明显差异，加10 μΜ ADP后，实验组细胞内钙 的荧光强度增加明显(862±319，P<0.01)。结论 与对照组 比较，脑梗死病人急性期，高密度亚群血小板的数量显著增加。血小板聚集和释放功能明显 增强，这一结果可能与细胞游离钙增加有关。
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[中图分类号] R 743.33 [文献标识码] A [文章编号] 1002-1949(2000)09-0521-03
Changes of density,functions,and intracellular calcium of platelets in the patie nts with encephalorrhagia in acute stage
BAI Ying1,CAO Feng-lin2 ,LI Bai-yan3.1 Department of Neurology,Harbin First City Hospital,Harbin 15 0010,China
[Abstracts] Objective To investigate the changes of platelet densit y,platelet aggregation,release reaction,and intracellular calcium in the patient s with encephalorrhagia in acute stage.Methods The density subpopulations of platelets were prepared by gradient Percoll.Platelet aggregati on and release reaction were measured by light transmission and the amount of AT P in the medium,respectively.Intracellular calcium concentration ([Ca2+ ]i) was measured in single platelet loaded with Fluo-3/AM by laser scanning c onfocal microscope (LSCM).The platelets were obtained from volunteer and the pat ients with acute cerebral infarction.Results ①The experi ments with Percoll gradients showed that high density subpopulation (HD) of plat elets was increased 〔(52.1±11.4)%，n＝6，P<0.01〕compared with the con trol 〔(24.6±8.6)%，n＝5〕.These results were consistent with those observed directly by LSCM.②3 μM ADP-induced aggregation 〔(69.4±19.8)%,P<0.01〕 and ATP in the medium 〔(1.26±0.44)%,P<0.01〕 were more potent those in control.③Before stimulatio n,there was no different in [Ca2+]i compared with control,but after adding 10 μM ADP,fluorescent intensity of [Ca2+]i was significant i ncreased (1126±198,P<0.01).Conclusions In the patien ts with cerebral infarction in acute stage,the proportion of HD platelets was increased,the functions,including aggregation and release reaction were more potent than those in ID and LD subpopulations,the re sult also suggested that [Ca2+]i may be involved in above phenomena.
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[Key words] Encephalorrhagia; Platelet; Density; Platelet a ggregation; Release reaction; Calcium; Gradient centrifugation;Fluo-3 /AM; Confocal
以往的研究表明，不同密度血小板其功能具有显著差异[1，2]。血小板密度主要 取决于血小板内亚细胞结构[3]，尤其是特殊颗粒的浓度[4]。临床资料证 明，在心肌梗死病人血液中高密度血小板的数量增加[5]，而某些出血性疾病患者 血中高密度血小板的数量明显减少[6]。我们的研究表明[2，7] ，血小板的密度增加，其聚集和释放反映均增强，与血小板聚集剂接触后，细胞内游离钙 水平显著增高。相反，低密度血小板的功能，细胞内钙浓度，及对聚集剂的反映性均明显降 低。本研究以脑梗死病人的血小板为研究对象，观察其血小板密度，血小板聚集和释放功能 的变化，以及密度与功能之间的关系，并观察细胞内游离钙是否参与上述变化的信息转导过 程。
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1 材料与方法
1.1 试剂 不同浓度的Percall(Pharmacia Co,Japan)溶液用于血小板梯度离心。腺苷二 磷酸(ATP，Sigma,USA)及Luciferin-Lucifease(Chrono-Log Crop,USA)用于测定血小板释 放反应。腺苷二磷酸(ADP，Sigma,USA)为血小板聚集剂。钙荧光指示剂Fluo-3/AM(Molecula r Probes,USA)负载血小板。
1.2 血小板亚群制备 对照组血小板来源于5名正常志愿者(28～56岁)，具体方法参照文 献[7]。
1.3 血小板大小测量 按文献[7]方法测定。
1.4 检测血小板聚集反应 首先制备富血小板血浆(PRP)，乏血小板血浆(PPP)以及洗脱血 小板[8]，加入聚集剂后测定洗脱血小板悬液透光度的改变。
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1.5 ATP释放反应测定 在记录血小板聚集反应的同时，以洗脱血小板悬液介质中ATP的量 评价血小板释放反应，ATP的量以μmol/4×105血小板表示[9]。
1.6 荧光标记和细胞内钙测定 将各亚群洗脱血小板稀释成为6×1011/L，并在37℃条件下，以2 μmol/L Fluo-3/AM负载15 min细胞内 钙，洗脱后以无钙的Hepes缓冲液悬浮，并将血小板浓度稀释为2×1011/L ，实验前10 min加入1 mM CaCl2，并取100 μL置于测定槽内，利用激光共聚焦图像(Lase r Scanning Confocal Microscope,In-Sight Plus-IQ,USA)测定血小板细胞内静息钙水平， 和ADP介导的细胞内钙浓度增加[10]，细胞内钙变化以荧光强度表示。
1.7 统计学处理 所有数据均以均数±标准差表示，以t检验进行统计学分析。
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2 结果
2.1 血小板大小和密度 以Percoll梯度离心法，血小板大致分为高密度亚群(HD，比重> 1.062)、中密度亚群(ID，比重＝1.057)和低密度亚群(LD，比重<1.051)。对照组为 正常志愿者(n=5)，实验组为脑梗死急性期病人(n=6)。对照组和 实验组各亚群血小板的大小及所占的比例见表1。结果显示，与对照组相比，实验组中H D亚群的数量明显增加(P<0.01)，而对照组ID和LD亚群的比例大于实验组(P<0. 05或P<0.01)。
表1 血小板各密度亚群的大小及占总体的百分比 血小板亚群
对照组(%)
(n=5)
实验组(%)
(n= 6)
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HD(>1.062)
806±102(28.2±2.6)
841±89(49.5±4.1)**
ID(＝1.057)
499±84(42.7±5.0)
507±77(2.4±3.8)**
LD(<1.051)
355±40(28.8±7.4)
342±37(18.2±6.9)*
*P<0.05；**P<0.01，与对照组比较
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2.2 血小板聚集反应 3 μM ADP诱导血小板各密度亚群的聚集反应，以血小板悬液光透 过度的程度(%)评价血小板聚集反应。对照组和实验组中HD亚群血小板的聚集反应明显高于I D和LD亚群，实验组中HD和ID亚群聚集反应的程度明显高于对照组(P<0.05或P<0 .01)，见表2。
2.3 血小板释放反应 3 μM ADP在诱导的血小板聚集反应的同时刺激血小板释放反应， 通过测定悬液中ATP的量来决定释放反应的程度。结果表明，对照组和实验组各亚群的释放 反应随密度增加而增强。且实验组各密度亚群血小板释放反应明显高于对照组(P<0.0 5或P<0.01)，见表2。
表2 3 μM ADP诱导的血小板凝集反应 血小板亚群
聚集反应(%)
释放反应(μm)
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对照组
实验组
对照组
实验组
所有亚群
38.5±9.8
57.5±6.2*
0.46±0.24
0.78±0.15*
HD
48.0±10.3
74.7±12.8**
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1.47±0.30
2.94±0.85**
ID
32.3±7.8
47.6±8.2
0.66±0.33
1.31±0.51*
LD
17.5±6.6
22.9±10.1
0.20±0.36
, 百拇医药
0.26±0.21
*P<0.05；**P<0.01，与对照组比较表3 100 U/L凝血酶诱导的血小板细胞
内钙浓度的变化(以荧光 强度表示)(
±s) 分 组
细胞内游离钙 (荧光强度)
HD
ID
LD
对照组(n=5)
ADP刺激前
246±69
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238±72
241±94
ADP刺激后
753±133bd
575±117bc
404±108a
实验组(n=6)
ADP刺激前
259±95
228±80
260±113
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ADP刺激后
1126±198bdf
782±167bde
486±139a
a P<0.05，b P<0.01，与对照组比较；c P<0.05，d P< 0.01；与LD比较，e P<0.05，f P<0.01，与对照组刺激后比较。
2.4 细胞内游离钙浓度测定 对照组及实验组各密度亚群血小板静息时细胞内钙水平无明 显差异(P>0.05)，见表2。以100 U/L凝血酶刺激后，各组中HD亚群血小板细胞内钙 浓 度显著高于其他亚群，且细胞内钙升高达峰值的时间明显提前。与对照组比较，实验组各亚 群细胞内钙明显升高(见表3)。
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3 讨论
血小板在心血管系统疾病的发生和发展过程中发挥重要作用。血小板在受到刺激后可合成 释放体内最强的血小板聚集物质和缩血管物质-血栓素(thromboxane A2，TXA2)，与 血管内皮细胞释放的舒血管物质一前列环素(prostcyclin,PGI2)-同维持血液的流动状态 。在某种病理状态下，如果血小板的功能增强或降低，都会产生严重的不良后果。有研究表 明，心肌梗死病人血液中高密度/体积大的血小板的数量增加[5]，而一些出血性 疾病患者血液中高密度/体积大的血小板的数量明显减少[6]。我们以往的研究证 明[2，7]，无论动物或正常人血小板的密度和功能之间存在着密切的关系，即随 血小板密度的增加，血小板的聚集和释放功能均增强，刺激引起的细胞内钙动员与功能增强 的结果成正相关。本文研究的结果证实，脑梗死病人急性期血液中高密度血小板的比例增加 明显，而低密度亚群血小板的数量则相对显著减少。功能的研究结果表明，实验组各密度亚 群血小板对ADP聚集和释放反应均明显强于对照组，以高密度亚群尤为明显。这些结果与我 们以往的研究结果[2，7]完全一致。
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细胞内钙离子是重要的信息传导物质，同样在血小板的功能中发挥重要作用[11，12] 。本研究发现，脑梗死病人除了高密度亚群血小板数量改变，功能增强以外，ADP诱导的 细胞内钙动员易有显著变化，高密度亚群升高最为显著，与其功能增强的结果一致，进一步 说明细胞内钙参与血小板功能的调节过程，并与我们以往报道的结果相似。结合以往研究和 本研究的结果，我们认为血小板密度亚群比例的改变，以及其功能增强，这在脑梗死急性期 的病理变化中占重要地位，因而，在脑梗死急性期进行抗栓治疗是必不可少的。随着学术水 平的不断提高，如果能从血小板功能变化的不同的环节进行抗栓治疗，可能会收到更好的疗 效。至于为什么脑梗死病人急性期血液中，高密度亚群血小板数量有显著增加，可能是体内 内源性血小板聚集物质少量和长期作用的结果，使血小板内的颗粒物质和血小板本身大量耗 竭，从而促使骨髓释放大量新生的血小板有关[13，14]。脑梗死病人恢复期及脑出 血病人血小板是否有相同改变，有待进一步研究。
[基金来源] 哈尔滨市学科后备带头人基金(1996～1998)
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[参考文献]
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[14]Corash L,Shafer B.Use of asplenic rabbits to demonstrate that plate let age and density are related[J].Blood,1982,60:166-71.
[收稿：1999-05-20，修回：1999-12-13], http://www.100md.com
单位：白颖(哈尔滨市第一医院神经内科，150010)；曹凤林(哈尔滨市第一医院血液病研究所)；李柏岩(哈尔滨医科大学药理教研室)
关键词：脑梗死；血小板；密度；血小板聚集；释放反应；钙；梯度离心；Fluo-3；AM；共聚焦显微镜检查
中国急救医学000907 [摘 要] 目的 观察脑梗死病人急性期血小板密度、细胞内游离钙浓度及 血小板聚集和释放的变化。方法 以梯度离心法制备血小板密度亚 群，激光共聚焦显微镜法测定Fluo-3/AM负载后血小板细胞内游离钙荧光强度的变化，以透 光度法和介质中ATP的量评价血小板的凝集和释放反映。对照组和实验组血小板分别来自于 正常志愿者和脑梗死病人急性期的静脉血。结果 ①Percoll梯度离 心的结果表明，脑梗死病人急性期血液中高密度亚群(比重>1.062)血小板的数量与对照组 〔(24.6±8.6)%，n＝5〕比较显著增多〔(52.1±11.4)%，n＝6，P<0.001〕，上 述结果与共聚焦显微镜直接观察的结果一致。②与对照组相比3 μΜ ADP介导的聚集反应 增强〔(69.4±19.8)%，P<0.01〕，介质中ATP的含量为1.26±0.44(P<0.0 1) 。③对照组和实验组细胞内钙的静息水平无明显差异，加10 μΜ ADP后，实验组细胞内钙 的荧光强度增加明显(862±319，P<0.01)。结论 与对照组 比较，脑梗死病人急性期，高密度亚群血小板的数量显著增加。血小板聚集和释放功能明显 增强，这一结果可能与细胞游离钙增加有关。
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[中图分类号] R 743.33 [文献标识码] A [文章编号] 1002-1949(2000)09-0521-03
Changes of density,functions,and intracellular calcium of platelets in the patie nts with encephalorrhagia in acute stage
BAI Ying1,CAO Feng-lin2 ,LI Bai-yan3.1 Department of Neurology,Harbin First City Hospital,Harbin 15 0010,China
[Abstracts] Objective To investigate the changes of platelet densit y,platelet aggregation,release reaction,and intracellular calcium in the patient s with encephalorrhagia in acute stage.Methods The density subpopulations of platelets were prepared by gradient Percoll.Platelet aggregati on and release reaction were measured by light transmission and the amount of AT P in the medium,respectively.Intracellular calcium concentration ([Ca2+ ]i) was measured in single platelet loaded with Fluo-3/AM by laser scanning c onfocal microscope (LSCM).The platelets were obtained from volunteer and the pat ients with acute cerebral infarction.Results ①The experi ments with Percoll gradients showed that high density subpopulation (HD) of plat elets was increased 〔(52.1±11.4)%，n＝6，P<0.01〕compared with the con trol 〔(24.6±8.6)%，n＝5〕.These results were consistent with those observed directly by LSCM.②3 μM ADP-induced aggregation 〔(69.4±19.8)%,P<0.01〕 and ATP in the medium 〔(1.26±0.44)%,P<0.01〕 were more potent those in control.③Before stimulatio n,there was no different in [Ca2+]i compared with control,but after adding 10 μM ADP,fluorescent intensity of [Ca2+]i was significant i ncreased (1126±198,P<0.01).Conclusions In the patien ts with cerebral infarction in acute stage,the proportion of HD platelets was increased,the functions,including aggregation and release reaction were more potent than those in ID and LD subpopulations,the re sult also suggested that [Ca2+]i may be involved in above phenomena.
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[Key words] Encephalorrhagia; Platelet; Density; Platelet a ggregation; Release reaction; Calcium; Gradient centrifugation;Fluo-3 /AM; Confocal
以往的研究表明，不同密度血小板其功能具有显著差异[1，2]。血小板密度主要 取决于血小板内亚细胞结构[3]，尤其是特殊颗粒的浓度[4]。临床资料证 明，在心肌梗死病人血液中高密度血小板的数量增加[5]，而某些出血性疾病患者 血中高密度血小板的数量明显减少[6]。我们的研究表明[2，7] ，血小板的密度增加，其聚集和释放反映均增强，与血小板聚集剂接触后，细胞内游离钙 水平显著增高。相反，低密度血小板的功能，细胞内钙浓度，及对聚集剂的反映性均明显降 低。本研究以脑梗死病人的血小板为研究对象，观察其血小板密度，血小板聚集和释放功能 的变化，以及密度与功能之间的关系，并观察细胞内游离钙是否参与上述变化的信息转导过 程。
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1 材料与方法
1.1 试剂 不同浓度的Percall(Pharmacia Co,Japan)溶液用于血小板梯度离心。腺苷二 磷酸(ATP，Sigma,USA)及Luciferin-Lucifease(Chrono-Log Crop,USA)用于测定血小板释 放反应。腺苷二磷酸(ADP，Sigma,USA)为血小板聚集剂。钙荧光指示剂Fluo-3/AM(Molecula r Probes,USA)负载血小板。
1.2 血小板亚群制备 对照组血小板来源于5名正常志愿者(28～56岁)，具体方法参照文 献[7]。
1.3 血小板大小测量 按文献[7]方法测定。
1.4 检测血小板聚集反应 首先制备富血小板血浆(PRP)，乏血小板血浆(PPP)以及洗脱血 小板[8]，加入聚集剂后测定洗脱血小板悬液透光度的改变。
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1.5 ATP释放反应测定 在记录血小板聚集反应的同时，以洗脱血小板悬液介质中ATP的量 评价血小板释放反应，ATP的量以μmol/4×105血小板表示[9]。
1.6 荧光标记和细胞内钙测定 将各亚群洗脱血小板稀释成为6×1011/L，并在37℃条件下，以2 μmol/L Fluo-3/AM负载15 min细胞内 钙，洗脱后以无钙的Hepes缓冲液悬浮，并将血小板浓度稀释为2×1011/L ，实验前10 min加入1 mM CaCl2，并取100 μL置于测定槽内，利用激光共聚焦图像(Lase r Scanning Confocal Microscope,In-Sight Plus-IQ,USA)测定血小板细胞内静息钙水平， 和ADP介导的细胞内钙浓度增加[10]，细胞内钙变化以荧光强度表示。
1.7 统计学处理 所有数据均以均数±标准差表示，以t检验进行统计学分析。
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2 结果
2.1 血小板大小和密度 以Percoll梯度离心法，血小板大致分为高密度亚群(HD，比重> 1.062)、中密度亚群(ID，比重＝1.057)和低密度亚群(LD，比重<1.051)。对照组为 正常志愿者(n=5)，实验组为脑梗死急性期病人(n=6)。对照组和 实验组各亚群血小板的大小及所占的比例见表1。结果显示，与对照组相比，实验组中H D亚群的数量明显增加(P<0.01)，而对照组ID和LD亚群的比例大于实验组(P<0. 05或P<0.01)。
表1 血小板各密度亚群的大小及占总体的百分比 血小板亚群
对照组(%)
(n=5)
实验组(%)
(n= 6)
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HD(>1.062)
806±102(28.2±2.6)
841±89(49.5±4.1)**
ID(＝1.057)
499±84(42.7±5.0)
507±77(2.4±3.8)**
LD(<1.051)
355±40(28.8±7.4)
342±37(18.2±6.9)*
*P<0.05；**P<0.01，与对照组比较
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2.2 血小板聚集反应 3 μM ADP诱导血小板各密度亚群的聚集反应，以血小板悬液光透 过度的程度(%)评价血小板聚集反应。对照组和实验组中HD亚群血小板的聚集反应明显高于I D和LD亚群，实验组中HD和ID亚群聚集反应的程度明显高于对照组(P<0.05或P<0 .01)，见表2。
2.3 血小板释放反应 3 μM ADP在诱导的血小板聚集反应的同时刺激血小板释放反应， 通过测定悬液中ATP的量来决定释放反应的程度。结果表明，对照组和实验组各亚群的释放 反应随密度增加而增强。且实验组各密度亚群血小板释放反应明显高于对照组(P<0.0 5或P<0.01)，见表2。
表2 3 μM ADP诱导的血小板凝集反应 血小板亚群
聚集反应(%)
释放反应(μm)
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对照组
实验组
对照组
实验组
所有亚群
38.5±9.8
57.5±6.2*
0.46±0.24
0.78±0.15*
HD
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74.7±12.8**
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2.94±0.85**
ID
32.3±7.8
47.6±8.2
0.66±0.33
1.31±0.51*
LD
17.5±6.6
22.9±10.1
0.20±0.36
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*P<0.05；**P<0.01，与对照组比较表3 100 U/L凝血酶诱导的血小板细胞
内钙浓度的变化(以荧光 强度表示)(
±s) 分 组细胞内游离钙 (荧光强度)
HD
ID
LD
对照组(n=5)
ADP刺激前
246±69
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238±72
241±94
ADP刺激后
753±133bd
575±117bc
404±108a
实验组(n=6)
ADP刺激前
259±95
228±80
260±113
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ADP刺激后
1126±198bdf
782±167bde
486±139a
a P<0.05，b P<0.01，与对照组比较；c P<0.05，d P< 0.01；与LD比较，e P<0.05，f P<0.01，与对照组刺激后比较。
2.4 细胞内游离钙浓度测定 对照组及实验组各密度亚群血小板静息时细胞内钙水平无明 显差异(P>0.05)，见表2。以100 U/L凝血酶刺激后，各组中HD亚群血小板细胞内钙 浓 度显著高于其他亚群，且细胞内钙升高达峰值的时间明显提前。与对照组比较，实验组各亚 群细胞内钙明显升高(见表3)。
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3 讨论
血小板在心血管系统疾病的发生和发展过程中发挥重要作用。血小板在受到刺激后可合成 释放体内最强的血小板聚集物质和缩血管物质-血栓素(thromboxane A2，TXA2)，与 血管内皮细胞释放的舒血管物质一前列环素(prostcyclin,PGI2)-同维持血液的流动状态 。在某种病理状态下，如果血小板的功能增强或降低，都会产生严重的不良后果。有研究表 明，心肌梗死病人血液中高密度/体积大的血小板的数量增加[5]，而一些出血性 疾病患者血液中高密度/体积大的血小板的数量明显减少[6]。我们以往的研究证 明[2，7]，无论动物或正常人血小板的密度和功能之间存在着密切的关系，即随 血小板密度的增加，血小板的聚集和释放功能均增强，刺激引起的细胞内钙动员与功能增强 的结果成正相关。本文研究的结果证实，脑梗死病人急性期血液中高密度血小板的比例增加 明显，而低密度亚群血小板的数量则相对显著减少。功能的研究结果表明，实验组各密度亚 群血小板对ADP聚集和释放反应均明显强于对照组，以高密度亚群尤为明显。这些结果与我 们以往的研究结果[2，7]完全一致。
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细胞内钙离子是重要的信息传导物质，同样在血小板的功能中发挥重要作用[11，12] 。本研究发现，脑梗死病人除了高密度亚群血小板数量改变，功能增强以外，ADP诱导的 细胞内钙动员易有显著变化，高密度亚群升高最为显著，与其功能增强的结果一致，进一步 说明细胞内钙参与血小板功能的调节过程，并与我们以往报道的结果相似。结合以往研究和 本研究的结果，我们认为血小板密度亚群比例的改变，以及其功能增强，这在脑梗死急性期 的病理变化中占重要地位，因而，在脑梗死急性期进行抗栓治疗是必不可少的。随着学术水 平的不断提高，如果能从血小板功能变化的不同的环节进行抗栓治疗，可能会收到更好的疗 效。至于为什么脑梗死病人急性期血液中，高密度亚群血小板数量有显著增加，可能是体内 内源性血小板聚集物质少量和长期作用的结果，使血小板内的颗粒物质和血小板本身大量耗 竭，从而促使骨髓释放大量新生的血小板有关[13，14]。脑梗死病人恢复期及脑出 血病人血小板是否有相同改变，有待进一步研究。
[基金来源] 哈尔滨市学科后备带头人基金(1996～1998)
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[收稿：1999-05-20，修回：1999-12-13], http://www.100md.com