依那普利和缬沙坦对自发性高血压大鼠血管紧张素Ⅱ及其受体偶联G蛋白的影响
缪丽燕 刘志华 蒋文平
摘 要 目的 观察依那普利及缬沙坦在降压的同时，对血液和组织血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)水平的影响及依那普利是否干预受体后Gq α的表达。方法 (1)雄性自发性高血压大鼠(SHR)分三组(n=6)：依那普利组：依那普利20 mg.kg-1.d-1；缬沙坦组：缬沙坦30 mg.kg-1.d-1；对照组用等量蒸馏水灌胃。用HPLC-RIA测定治疗前、后SHR血液和心脏、动脉壁、肾脏中AngⅡ含量；(2)用半定量RT-PCR测定SHR血管平滑肌细胞(VSMC)Gq α表达与正常大鼠(WKY)间差异。结果 (1)依那普利及缬沙坦治疗后，SHR血压及左室重量/体重明显降低(P<0.01);(2)依那普利明显降低心脏、肾脏中AngⅡ水平(P<0.01),但对血液及动脉壁的AngⅡ水平基本无影响；⑶缬沙坦使血液及肾脏中AngⅡ含量增加(P<0.01)，心脏及动脉壁AngⅡ含量减少(P<0.01)；⑷VSMC培养静止期，SHR及WKY的Gq α mRNA表达无明显差异，在10%小牛血清作用下，SHR Gq α mRNA表达增加4倍，依那普利(10-5 mmol/L)可明显抑制Gq α mRNA的表达(P<0.01)。结论 (1)依那普利、缬沙坦对不同组织AngⅡ水平的影响不同，但二者均降低左室心肌AngⅡ的含量；(2)依那普利除抑制血管紧张素转换酶外，对SHR血管平滑肌细胞Gq α mRNA的过度表达也有抑制作用。
, 百拇医药
关键词：依那普利 缬沙坦 受体，血管紧张素 大鼠，近交SHR
血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)和血管紧张素Ⅱ—Ⅰ型受体(AT1)阻滞剂对血液和组织的血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)水平的影响报道不一。ACEI的降压作用除抑制ACE外，是否在AT1受体后水平上也有影响，尚在探索中[1]。为此，本研究以自发性高血压大鼠(SHR)为对象，采用高压液相放免法(HPLC-RIA)，检测依那普利和缬沙坦在降压的同时对血液和心、动脉壁、肾脏中AngⅡ浓度的影响；应用分子生物学技术检测正常大鼠(WKY)与SHR血管平滑肌细胞Gq α表达的情况，以探讨在不同水平上AngⅡ-AT1-Gq α的干预对高血压病的治疗作用。
材料与方法
1.实验分组：雄性SHR大鼠18只(上海高血压所)测体重、尾动脉压，随机分三组：依那普利组：依那普利20 mg*kg-1*d-1灌胃；缬沙坦组: 缬沙坦30 mg*kg-1*d-1灌胃；对照组以等量蒸馏水灌胃。每周测体重、血压，第5周断头处死。
, 百拇医药
2.AngⅡ测定[2]：血液收集在4℃提取液(pepstatin 146 μmol/L,1,10-phenanthroline 50 mmol/L,EDTA 125 mmol/L, neomycin sulfate 2 g/L,DMSO 2%,ethanol 2%)中3 000 g离心20 min，上清液经phenylsilyl silica柱固相提取；主动脉(从根部到膈水平)、一侧肾脏、左心室(包括室间膈)在提取液(GTC 4M，1%三氯乙酸)中迅速匀浆，低温离心5 000 g，20 min后上清液经相同柱固相提取。提取液经HPLC分离后应用RIA分析，放免药盒购自中国原子能研究所。
3.Gq α mRNA测定[3]：15周龄SHR和WKY各8只，取胸主动脉贴壁法血管平滑肌细胞培养，应用Trizol试剂盒提取总RNA，采用RT-PCR技术半定量测定Gq α mRNA。
4.试剂：AngⅡ标准品、pepstatin、HFBA为Sigma公司产品；异硫氰胍(GTC)、DEPC为SERVA公司产品；PRIM1640培养基、TRIZOL、M-MLV逆转录酶为GIBICO公司产品；Gq α和β-actin引物合成、Random primer、dNTP、Taq-ase上海SANGON生物工程公司产品。C18柱中国科学院大连物理化学研究所，Phenysilyl silca柱：J.T.Baker公司产品。
, 百拇医药
5.数据统计：数据以X±s表示，组间差异用t检验，治疗前后血压用配对t检验。
结果
1.依那普利及缬沙坦对SHR血压、血液及组织AngⅡ的影响(表1)：对照组在15周龄及19周龄血压无明显变化，依那普利组及缬沙坦组经4周治疗，均可使血压明显下降。治疗组与对照组相比，依那普利可使心脏和肾脏中AngⅡ含量明显减少(P<0.01)，而血液及动脉壁AngⅡ含量无明显变化；缬沙坦使血液和肾脏中AngⅡ含量明显增加(P<0.01)，心脏及动脉壁AngⅡ减少(P<0.01)。
表1 依那普利与结缬沙坦对SHR血液及组织中
AngⅡ的影响(n=6，X±s)
项目
对照组
, 百拇医药
依那普利组
缬沙坦组
治疗前血压(mm Hg)
203.3±5.3
200.7±7.3
205.0±10.7
治疗后血压(mm Hg)
206.0±9.4
138.8±8.1*
150.0±6.8*
血液AngⅡ(fom/L)
, 百拇医药
41.6±6.8
40.4±7.6
83.8±18.8*
肾脏AngⅡ(fom/g)
106.7±16.4
50.5±13.6*
150.1±13.1*
心脏AngⅡ(fom/g)
19.3±2.5
4.7±2.2*
, 百拇医药 4.6±1.2*
血管AngⅡ(fom/g)
148.4±11.9
131.1±21.3
102.2±7.9*
注：*与对照组比较P<0.01 2.依那普利及缬沙坦对SHR心肌肥厚的影响：对照组左心室/体重比值为(264.3±17.1) mg/100 g；依那普利组、缬沙坦组分别为(193.1±18.7)及(208.2±13.9) mg/100 g，与对照组比较，P均<0.01。提示依那普利和缬沙坦均具明显抑制左室肥厚作用。
3.SHR和WKY血管平滑肌Gq α基因表达：在无小牛血清刺激组中WKY及SHR Gq α mRNA表达无明显差异(图1)，以SHR Gq α mRNA的表达为100%，则WKY的表达为(103.1±4.6) %。在有小牛血清刺激组,SHR平滑肌细胞Gq α mRNA表达明显升高[(397.0±9.7)%，P<0.01],而WKY组的表达停留在(100.8±3.1)%。
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泳道1、1′：对照组β-actin，Gq α；泳道2、2′：WKY组
β-actin，Gq α；泳道3，3′：SHR组β-actin，Gq α
图1 依那普利对静止期WKY与SHRGq α基因表达的影响
4.依那普利及沙拉新(saralasin)对SHR平滑肌细胞Gq α mRNA的影响(图2)：10-5 mol/L依那普利和10-5 mol/L沙拉新分别加入含10%小牛血清的SHR平滑肌细胞，作用12 h，依那普利组Gq α mRNA表达下降为(20.2±3.4)%(P<0.01),而沙拉新组的表达为(104.2±10.1)%。提示依那普利对受体后Gq α mRNA具抑制作用。
, 百拇医药
泳道1、1′：对照组β-actin，Gq α；泳道2、2′：沙拉新组
β-actin，Gq α；泳道3、3′：依那普利组β-actin，Gq α
图2 依那普利及沙拉新对SHR血管平滑肌细胞Gq α表达的影响
讨论
1.依那普利对AngⅡ水平的影响：依那普利对心脏、肾脏、血液和血管壁的AngⅡ含量的影响与Campbell等[4]报道相似。依那普利为何对不同组织的AngⅡ水平有不同的影响，目前尚不清楚。可能的影响：(1)依那普利对不同组织ACE抑制的程度可能有区别，如依那普利对主动脉壁ACE的抑制作用短暂，对肾脏则持久而较强[5]；(2)不同组织非ACE途径生成AngⅡ的能力不同，尤其在长效ACEI的作用下[6]。
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2.缬沙坦对AngⅡ水平的影响：在缬沙坦治疗4周的SHR，肾脏和血浆的AngⅡ显著升高，而心脏和动脉壁的AngⅡ明显下降。与Mizuno等[7]应用氯沙坦的实验结果相似。按理AT1阻断，AngⅡ的水平有所提高，但不同的组织对此反应并不相同，其原因尚不清楚。有研究表明，氯沙坦可抑制心肌组织肾素mRNA的表达，降低肾素的自分泌和旁分泌，由此减少心肌组织的AngⅡ生成[8]。
3.左室肥大与AngⅡ水平的关系：依那普利、缬沙坦治疗均可逆转SHR肥大的左室，使肥大的左室重量显著下降。大量实验和临床资料都提示，AngⅡ在促进心肌肥大中具重要作用，左室肥大与组织内AngⅡ水平有关。依那普利和缬沙坦二者虽作用机制不同，但均能降低心肌组织AngⅡ的含量，因此二者都有利于抑制或逆转心肌肥大。
4.依那普利对Gq α基因表达的影响：AngⅡ作用于与Gq α蛋白偶联的AT1受体，传递细胞内信息。实验表明，依那普利对SHR Gq α mRNA过度表达有抑制作用，肽类AngⅡ受体阻滞剂沙拉新对此无影响。本研究仅涉及沙拉新和依那普利直接对Gq α mRNA表达的影响，至于AngⅡ受体激活或阻滞对Gq α mRNA表达的影响，需进一步研究。Gq α mRNA的测量本研究采用了RT-PCR相对表达量的比测方法，未再应用Northern Blotting等方法验证，对此也需进一步研究。
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作者单位：缪丽燕(215006 苏州医学院附属第一医院心血管病研究室)
刘志华(215006 苏州医学院附属第一医院心血管病研究室)
蒋文平(215006 苏州医学院附属第一医院心血管病研究室)
参考文献
1，祝之明，祝善俊. 血管紧张素转换酶抑制剂对血管紧张素Ⅱ介导的钙信号传导的作用及其机理研究. 中华心血管病杂志, 1996，24：380-383.
2，Voelker JR, Cobb SL, Bowsher RR. Improved HPLC-radimmunoassay for quantifying angiotensin Ⅱ in plasma. Clin Chem, 1994, 40:1537-1543.
, http://www.100md.com
3，Shah BH, MacEwan DJ, Milligan G. Gonadotrophin-releasing hormone receptor agonist-mediated down-regulation of Gq alpha/G11 alpha (pertussis toxin-insensitive) G proteins in alpha T3-1 gonadotroph cells reflects increased G protein turnover but not alternations in mRNA levels. Proc Natl Acad Sci U S A, 1995, 92:1886-1890.
4，Campbell DJ, Duncan AM, Kladis A, et al. Converting enzyme inhibition and its withdrawal in spontaneously hypertensive rats. J Cardiol Pharmacol, 1995, 26:426-436.
, 百拇医药
5，Cushman DW, Wang FL, Fung WC, et al. Differentiation of angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitors by their selective inhibition of ACE in physiologically important target organs. Am J Hypertens, 1989, 2:294-306.
6，Dzau VJ. Multiple pathways of angiotensin production in the blood vessel wall: evidence, possibilities and hypotheses. J Hypertens, 1989, 7:933-936.
7，Mizuno K, Tani M, Hashimoto S, et al. Effects of losartan, a nonpeptides angiotensin Ⅱ receptor antagonist, on cardiac hypertrophy and the tissue angiotensin Ⅱ content in spontaneously hypertensive rats. Life Sci, 1992, 51:367-374.
8，Kitani Y, Hiwada K, Murakami E, et al. The effect of the renin inhibitor ES-1005 on the expression of the kidney renin gene in sodium-depleted marmosets. J Hypertens, 1990, 6:1143-1146., 百拇医药
摘 要 目的 观察依那普利及缬沙坦在降压的同时，对血液和组织血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)水平的影响及依那普利是否干预受体后Gq α的表达。方法 (1)雄性自发性高血压大鼠(SHR)分三组(n=6)：依那普利组：依那普利20 mg.kg-1.d-1；缬沙坦组：缬沙坦30 mg.kg-1.d-1；对照组用等量蒸馏水灌胃。用HPLC-RIA测定治疗前、后SHR血液和心脏、动脉壁、肾脏中AngⅡ含量；(2)用半定量RT-PCR测定SHR血管平滑肌细胞(VSMC)Gq α表达与正常大鼠(WKY)间差异。结果 (1)依那普利及缬沙坦治疗后，SHR血压及左室重量/体重明显降低(P<0.01);(2)依那普利明显降低心脏、肾脏中AngⅡ水平(P<0.01),但对血液及动脉壁的AngⅡ水平基本无影响；⑶缬沙坦使血液及肾脏中AngⅡ含量增加(P<0.01)，心脏及动脉壁AngⅡ含量减少(P<0.01)；⑷VSMC培养静止期，SHR及WKY的Gq α mRNA表达无明显差异，在10%小牛血清作用下，SHR Gq α mRNA表达增加4倍，依那普利(10-5 mmol/L)可明显抑制Gq α mRNA的表达(P<0.01)。结论 (1)依那普利、缬沙坦对不同组织AngⅡ水平的影响不同，但二者均降低左室心肌AngⅡ的含量；(2)依那普利除抑制血管紧张素转换酶外，对SHR血管平滑肌细胞Gq α mRNA的过度表达也有抑制作用。
, 百拇医药
关键词：依那普利 缬沙坦 受体，血管紧张素 大鼠，近交SHR
血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)和血管紧张素Ⅱ—Ⅰ型受体(AT1)阻滞剂对血液和组织的血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)水平的影响报道不一。ACEI的降压作用除抑制ACE外，是否在AT1受体后水平上也有影响，尚在探索中[1]。为此，本研究以自发性高血压大鼠(SHR)为对象，采用高压液相放免法(HPLC-RIA)，检测依那普利和缬沙坦在降压的同时对血液和心、动脉壁、肾脏中AngⅡ浓度的影响；应用分子生物学技术检测正常大鼠(WKY)与SHR血管平滑肌细胞Gq α表达的情况，以探讨在不同水平上AngⅡ-AT1-Gq α的干预对高血压病的治疗作用。
材料与方法
1.实验分组：雄性SHR大鼠18只(上海高血压所)测体重、尾动脉压，随机分三组：依那普利组：依那普利20 mg*kg-1*d-1灌胃；缬沙坦组: 缬沙坦30 mg*kg-1*d-1灌胃；对照组以等量蒸馏水灌胃。每周测体重、血压，第5周断头处死。
, 百拇医药
2.AngⅡ测定[2]：血液收集在4℃提取液(pepstatin 146 μmol/L,1,10-phenanthroline 50 mmol/L,EDTA 125 mmol/L, neomycin sulfate 2 g/L,DMSO 2%,ethanol 2%)中3 000 g离心20 min，上清液经phenylsilyl silica柱固相提取；主动脉(从根部到膈水平)、一侧肾脏、左心室(包括室间膈)在提取液(GTC 4M，1%三氯乙酸)中迅速匀浆，低温离心5 000 g，20 min后上清液经相同柱固相提取。提取液经HPLC分离后应用RIA分析，放免药盒购自中国原子能研究所。
3.Gq α mRNA测定[3]：15周龄SHR和WKY各8只，取胸主动脉贴壁法血管平滑肌细胞培养，应用Trizol试剂盒提取总RNA，采用RT-PCR技术半定量测定Gq α mRNA。
4.试剂：AngⅡ标准品、pepstatin、HFBA为Sigma公司产品；异硫氰胍(GTC)、DEPC为SERVA公司产品；PRIM1640培养基、TRIZOL、M-MLV逆转录酶为GIBICO公司产品；Gq α和β-actin引物合成、Random primer、dNTP、Taq-ase上海SANGON生物工程公司产品。C18柱中国科学院大连物理化学研究所，Phenysilyl silca柱：J.T.Baker公司产品。
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5.数据统计：数据以X±s表示，组间差异用t检验，治疗前后血压用配对t检验。
结果
1.依那普利及缬沙坦对SHR血压、血液及组织AngⅡ的影响(表1)：对照组在15周龄及19周龄血压无明显变化，依那普利组及缬沙坦组经4周治疗，均可使血压明显下降。治疗组与对照组相比，依那普利可使心脏和肾脏中AngⅡ含量明显减少(P<0.01)，而血液及动脉壁AngⅡ含量无明显变化；缬沙坦使血液和肾脏中AngⅡ含量明显增加(P<0.01)，心脏及动脉壁AngⅡ减少(P<0.01)。
表1 依那普利与结缬沙坦对SHR血液及组织中
AngⅡ的影响(n=6，X±s)
项目
对照组
, 百拇医药
依那普利组
缬沙坦组
治疗前血压(mm Hg)
203.3±5.3
200.7±7.3
205.0±10.7
治疗后血压(mm Hg)
206.0±9.4
138.8±8.1*
150.0±6.8*
血液AngⅡ(fom/L)
, 百拇医药
41.6±6.8
40.4±7.6
83.8±18.8*
肾脏AngⅡ(fom/g)
106.7±16.4
50.5±13.6*
150.1±13.1*
心脏AngⅡ(fom/g)
19.3±2.5
4.7±2.2*
, 百拇医药 4.6±1.2*
血管AngⅡ(fom/g)
148.4±11.9
131.1±21.3
102.2±7.9*
注：*与对照组比较P<0.01 2.依那普利及缬沙坦对SHR心肌肥厚的影响：对照组左心室/体重比值为(264.3±17.1) mg/100 g；依那普利组、缬沙坦组分别为(193.1±18.7)及(208.2±13.9) mg/100 g，与对照组比较，P均<0.01。提示依那普利和缬沙坦均具明显抑制左室肥厚作用。
3.SHR和WKY血管平滑肌Gq α基因表达：在无小牛血清刺激组中WKY及SHR Gq α mRNA表达无明显差异(图1)，以SHR Gq α mRNA的表达为100%，则WKY的表达为(103.1±4.6) %。在有小牛血清刺激组,SHR平滑肌细胞Gq α mRNA表达明显升高[(397.0±9.7)%，P<0.01],而WKY组的表达停留在(100.8±3.1)%。
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泳道1、1′：对照组β-actin，Gq α；泳道2、2′：WKY组
β-actin，Gq α；泳道3，3′：SHR组β-actin，Gq α
图1 依那普利对静止期WKY与SHRGq α基因表达的影响
4.依那普利及沙拉新(saralasin)对SHR平滑肌细胞Gq α mRNA的影响(图2)：10-5 mol/L依那普利和10-5 mol/L沙拉新分别加入含10%小牛血清的SHR平滑肌细胞，作用12 h，依那普利组Gq α mRNA表达下降为(20.2±3.4)%(P<0.01),而沙拉新组的表达为(104.2±10.1)%。提示依那普利对受体后Gq α mRNA具抑制作用。
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泳道1、1′：对照组β-actin，Gq α；泳道2、2′：沙拉新组
β-actin，Gq α；泳道3、3′：依那普利组β-actin，Gq α
图2 依那普利及沙拉新对SHR血管平滑肌细胞Gq α表达的影响
讨论
1.依那普利对AngⅡ水平的影响：依那普利对心脏、肾脏、血液和血管壁的AngⅡ含量的影响与Campbell等[4]报道相似。依那普利为何对不同组织的AngⅡ水平有不同的影响，目前尚不清楚。可能的影响：(1)依那普利对不同组织ACE抑制的程度可能有区别，如依那普利对主动脉壁ACE的抑制作用短暂，对肾脏则持久而较强[5]；(2)不同组织非ACE途径生成AngⅡ的能力不同，尤其在长效ACEI的作用下[6]。
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2.缬沙坦对AngⅡ水平的影响：在缬沙坦治疗4周的SHR，肾脏和血浆的AngⅡ显著升高，而心脏和动脉壁的AngⅡ明显下降。与Mizuno等[7]应用氯沙坦的实验结果相似。按理AT1阻断，AngⅡ的水平有所提高，但不同的组织对此反应并不相同，其原因尚不清楚。有研究表明，氯沙坦可抑制心肌组织肾素mRNA的表达，降低肾素的自分泌和旁分泌，由此减少心肌组织的AngⅡ生成[8]。
3.左室肥大与AngⅡ水平的关系：依那普利、缬沙坦治疗均可逆转SHR肥大的左室，使肥大的左室重量显著下降。大量实验和临床资料都提示，AngⅡ在促进心肌肥大中具重要作用，左室肥大与组织内AngⅡ水平有关。依那普利和缬沙坦二者虽作用机制不同，但均能降低心肌组织AngⅡ的含量，因此二者都有利于抑制或逆转心肌肥大。
4.依那普利对Gq α基因表达的影响：AngⅡ作用于与Gq α蛋白偶联的AT1受体，传递细胞内信息。实验表明，依那普利对SHR Gq α mRNA过度表达有抑制作用，肽类AngⅡ受体阻滞剂沙拉新对此无影响。本研究仅涉及沙拉新和依那普利直接对Gq α mRNA表达的影响，至于AngⅡ受体激活或阻滞对Gq α mRNA表达的影响，需进一步研究。Gq α mRNA的测量本研究采用了RT-PCR相对表达量的比测方法，未再应用Northern Blotting等方法验证，对此也需进一步研究。
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作者单位：缪丽燕(215006 苏州医学院附属第一医院心血管病研究室)
刘志华(215006 苏州医学院附属第一医院心血管病研究室)
蒋文平(215006 苏州医学院附属第一医院心血管病研究室)
参考文献
1，祝之明，祝善俊. 血管紧张素转换酶抑制剂对血管紧张素Ⅱ介导的钙信号传导的作用及其机理研究. 中华心血管病杂志, 1996，24：380-383.
2，Voelker JR, Cobb SL, Bowsher RR. Improved HPLC-radimmunoassay for quantifying angiotensin Ⅱ in plasma. Clin Chem, 1994, 40:1537-1543.
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3，Shah BH, MacEwan DJ, Milligan G. Gonadotrophin-releasing hormone receptor agonist-mediated down-regulation of Gq alpha/G11 alpha (pertussis toxin-insensitive) G proteins in alpha T3-1 gonadotroph cells reflects increased G protein turnover but not alternations in mRNA levels. Proc Natl Acad Sci U S A, 1995, 92:1886-1890.
4，Campbell DJ, Duncan AM, Kladis A, et al. Converting enzyme inhibition and its withdrawal in spontaneously hypertensive rats. J Cardiol Pharmacol, 1995, 26:426-436.
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5，Cushman DW, Wang FL, Fung WC, et al. Differentiation of angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitors by their selective inhibition of ACE in physiologically important target organs. Am J Hypertens, 1989, 2:294-306.
6，Dzau VJ. Multiple pathways of angiotensin production in the blood vessel wall: evidence, possibilities and hypotheses. J Hypertens, 1989, 7:933-936.
7，Mizuno K, Tani M, Hashimoto S, et al. Effects of losartan, a nonpeptides angiotensin Ⅱ receptor antagonist, on cardiac hypertrophy and the tissue angiotensin Ⅱ content in spontaneously hypertensive rats. Life Sci, 1992, 51:367-374.
8，Kitani Y, Hiwada K, Murakami E, et al. The effect of the renin inhibitor ES-1005 on the expression of the kidney renin gene in sodium-depleted marmosets. J Hypertens, 1990, 6:1143-1146., 百拇医药