地高辛掺入RT-PCR半定量检测WT1基因在AML中的表达及其意义
作者：王玮 傅建新 陈子兴 王玲
单位：王玮 傅建新 陈子兴(215006 苏州医学院附属第一医院 江苏省血液研究所)；王玲(现在青岛医学院附属第二医院 266042)
关键词：肾母细胞瘤基因；急性髓细胞性白血病；地高辛；半定量RT-PCR
江苏医药001015 【摘要】 目的 建立客观的半定量检测WT1基因表达的方法，探讨WT1基因表达水平与急性髓细胞性白血病(AML)预后的关系。方法 用地高辛标记的脱氧三磷酸尿苷(DIG-11-dUTP)掺入逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法检测，用KG-1细胞建立WT1表达的半定量稀释曲线，分析53例AML及21例非恶性疾患病人骨髓中WT1基因的表达。结果 倍比稀释的KG-1细胞WT1基因表达水平与稀释倍数有良好的线性关系；将WT1基因与β-actin基因的表达水平之比<0.16定为(-)，≥0.16～<0.6为(+)，≥0.6～<1.0为()，≥1.0为()。21例非恶性疾患病人骨髓中WT1基因均为阴性，41例初治AML病人WT1基因表达阳性率为92.7%，随着WT1基因表达水平的升高，完全缓解(CR)率有明显下降的趋势(<0.6及≥0.6组比较P<0.025)。CR后WT1基因表达水平明显下降，复发后又显著升高。结论 DIG掺入RT-PCR半定量检测WT1基因表达的方法客观、准确，WT1基因表达水平与AML的预后相关。
, http://www.100md.com
Analysis of WT1 gene expression in acute myelocytic leukemia by DIG labeled RT-PCR.
WANG Ling WANG Wei FU Jianxin et al.
(Jiangsu Institute of Hematology，the First Affiliated Hospital of Suzhou Medical College，Suzhou 215006)
【Abstract】 Objective To establish an objective and quantitative criterion for the assessment of WT1 gene expression and study the correlation between WT1 gene expression and prognosis of AML.Methods Using DIG labeled RT-PCR assay，a semi-quantitative curve of WT1 gene expression was established in KG-1 cell line.Based on this standard，WT1 gene expression was determined in the bone marrow specimens from 53 AML patients and 21 nonmalignant patients.Results WT1 gene expression level was classified as (-)(the ratio of WT1/β-actin PCR products<0.16)，(+)(≥0.16～<0.6)，()(≥0.6～<1.0)and ()(≥1.0) respectively.WT1 gene expression in 21 nonmalignant patients was (-)，positive rate of WT1 gene expression was 92.7% in 41 first diagnosed cases.The CR rate was markedly decreased as WT1 gene expression level increased(≥0.6 v <0.6 group，P<0.025).Short-term follow-up of 12 M3 patients showed that WT1 gene expression level was markedly decreased after CR whereas highly increased when relapsed.Conclusion The method we established using DIG labeled RT-PCR was objective and quantitative.WT1 gene expression level was correlated with the prognosis of AML.
, 百拇医药
【Key words】 Gene，Wilm＇stumor Acute myelocytic leukemia DIG Semi-quantitative RT-PCR
WT1基因(Wilms瘤基因)是儿童肾母细胞瘤的易感基因。1990年由Call等人克隆并定位于染色体11p13，全长约50Kb，共有10个外显子，它编码的分子量为52-54KDa的锌指蛋白是一种双向转录调控因子，在肿瘤的发生中起重要的作用。近年来发现在白血病尤其AML中WT1基因有异常的高表达，而且表达水平与预后有关，高表达可能导致差的预后[1]，但对此也存在争议[2]。因此需要建立一种较为精确的定量方法来检测WT1基因的表达水平。我们建立了一种DIG掺入RT-PCR方法，对54例AML病人进行了半定量检测及短期随访观察，探讨WT1基因表达水平与AML预后的关系。
材料和方法
, http://www.100md.com 一、实验材料
1.急性髓细胞白血病细胞系KG-1由本实验室长期保存。
2.41例初治AML患者均为我院病人，按MIC诊断标准分型，用标准DA或HA方案化疗，M3病人用全反式维甲酸(ATRA)诱导分化及联合化疗治疗。其中M17例，M212例，M316例，M42例，M52例，M62例。男23例，女18例，中位数年龄35(3～67)岁。我们对另外12例M3病人进行了短期随访，12例病人均入院治疗，由ATRA进行诱导分化至骨髓形态学完全缓解(CR)，缓解后继续用联合化疗及ATRA维持治疗。21例经骨髓形态学检查排除恶性血液疾患病人骨髓细胞作为对照。
3.WT1、β-actin基因引物由生工公司合成，引物序列如下：
, 百拇医药
WT1(343bp)
sense 5-CTGTCCCACTTACAGATGCA-3
antisense 5-TCAAAGCGCCAGCTGGAGTTT-3
β-actin(265bp)
sense 5-AGGCCGGCTTCGCGGGCGAC-3
antisense 5-CTCGGGAGCCACACGCAGCTC-3
二、实验方法
1.单个核细胞分离按常规方法进行，RNA提取采用TRIzol试剂(GibcoBRL)。
2.逆转录反应：总RNA2μg，M-MLV(GibcoBRL)200U，总逆转录体系40μl，其余按本室常规进行。
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4.PCR反应：反应体系50μl，WT1基因扩增时取逆转录产物5μl，β-actin基因扩增时取逆转录产物取2μl。寡核苷酸引物各100ng，10×PCR buffer 5μl，2.0mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTPs，2.0μmol/L DIG-11-dUTP，Taq DNA聚合酶(上海生工公司)1.5U。反应条件：WT1基因95℃变性5分；94℃变性45秒，58℃退火45秒，72℃延伸60秒，共35个循环；72℃延伸7分。β-actin基因条件同上，进行20个循环。
5.PCR产物分析：取适量WT1基因及β-actin基因PCR产物混匀，在2%琼脂糖凝胶上进行电泳(80V，1.5小时)。在紫外检测仪上切割所需印迹凝胶块，碱变性、中和、10×SSC平衡后将DNA产物转移至尼龙膜上。洗膜、封闭后将连有碱性磷酸酶(AP)的抗-DIG抗体(德国宝灵曼公司)的Fab片段结合至产物上，加入AP发光底物CSPD，X线片上数分钟显影，洗片后观察结果。X线片在紫外线像仪上经Gel Doc1000软件进行扫描定量，计算WT1基因产物与β-actin基因产物比值。
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6.半定量稀释曲线的建立：KG-1细胞株的cDNA倍比稀释至2-8倍，PCR扩增出各点的WT1基因产物，分别与未稀释点扩增的β-actin产物进行比较，根据扫描得到的WT1基因与β-actin的比值建立WT1基因表达的半定量稀释曲线。同时进行各稀释点的β-actin扩增，分别观察两种基因产物在特定的循环数cDNA倍比稀释时产物的线性关系。
7.统计学检验：采用四格表精确概率法。
结果
一、首先用倍比稀释的方法证实在35个循环内WT1基因扩增产物与所加入的模板量呈线性关系，而β-actin基因在20个循环时也在线性关系范围内扩增。
二、对KG-1细胞株的cDNA各稀释点WT1基因与原点的β-actin基因PCR产物电泳后X线片显影结果进行扫描，建立了标准曲线，见图1。根据该曲线可见DIG掺入PCR灵敏度可以达到2-4水平，WT1基因扩增产物与所加入的模板的量呈很好的线性关系。
, 百拇医药
三、收集41例初治AML病人骨髓标本，RNA抽提及逆转录后用以上建立的DIG掺入半定量方法检测WT1基因的表达。发现初治病人阳性率达92.7%，见图2。将WT1和β-actin基因表达水平的比值<0.16定为阴性，≥0.16～<0.6为弱阳性(+)，≥0.6～<1.0为中等度阳性(
)，≥1.0为强阳性(
)，其表达程度及CR率见表1。CR率与WT1基因表达水平呈明显的负相关。鉴于M3病例在发病机制和治疗上的特殊性，未将其进行统计，结果发现CR率在≥0.6组(7/16)和<0.6组(9/10)之间有统计学意义(P<0.025)。
图1 KG-1细胞中WT1基因表达的半定量稀释曲线
, 百拇医药
图2 DIG-PCR检测AML病人WT1基因表达
M：Marker 1～8：WT1基因表达阳性 9：WT1基因表达阴性表1 WT1基因表达与CR率的关系 WT1
CR
NR
总例数
CR率(%)
6
6
12
50
, 百拇医药
11
4
15
73.3
+
10
1
11
90.1
-
3
0
3
100
, 百拇医药
合计
30
11
41
73.2
四、对12例M3病人进行了短期随访，包括8例初治、经ATRA或联合化疗治疗后缓解病人，4例缓解后复发病人。WT1基因检测结果如下：8例初治病人治疗后7例达到CR，WT1基因在CR后明显下降，5例检测不到；另外2例CR时WT1仍阳性的病人均在短期内复发(2、6个月)；1例病人WT1基因持续高表达，半年未能达到CR而死亡。4例病人从CR开始进行的随访观察发现：1例CR时阳性(+)，复发后明显升高()；3例CR时阴性表达者，复发后WT1基因均转为阳性(+)～()，4例复发时间在7～12个月之间。
, 百拇医药
五、对21例非恶性疾患病人骨髓进行了检测，均未检测到WT1基因表达。讨论
对于AML的预后判断，目前有很多方法，如染色体分析、免疫表型监测、PCR检测特异性基因标志等，而后种方法因其灵敏度高、先知性强等优点已成为常用的方法之一。虽然PCR对残留白血病细胞的检出率为10-4～10-5，但因为具有特异性基因标志的白血病很少，使其应用范围很窄。诸多研究表明肿瘤抑制基因WT1在白血病中有异常高的表达，与染色体核型、年龄及性别等无关，尤以在AML中阳性率高，可达73%～100%[3]。因此WT1基因可以作为一种独立应用的“泛白血病”基因标志，用于白血病的疗效观察及随访等。为了达到半定量目的，我们选用了DIG掺入RT-PCR，扩增后用抗体及发光剂检测产物量，最后计算机扫描定量的方法。该方法与直接在紫外光下观察溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶的传统方法比较，结果更加客观，灵敏度可提高至2-4水平。与同位素标记的分析方法相比，该方法简便易行，避免了同位素接触，有同样高的半定量准确性。如此，建立了一种较为客观的定量方法，为更合理地评价WT1基因在白血病发病中所起的作用提供了研究手段。
, 百拇医药
我们的研究发现WT1基因在AML中确有异常高表达，阳性率达92.7%；AML各亚型中，M1～M3亚型表达较M4～M6亚型表达高，与文献报道一致[1]。对21例非恶性疾患病人骨髓进行了检测，均未检测到WT1基因表达，说明WT1基因在正常骨髓中的表达水平明显低于白血病细胞，提示WT1基因可以作为一种“泛白血病”基因标记。对41例初治AML病人的CR状况进行的研究显示，随着WT1表达水平的升高，CR率存在明显降低的趋势。提示初治时WT1基因高表达可能导致AML差的预后[1，4]，并可能与耐药有关[5]。
对12例M3病人的随访分析发现，WT1基因持续高表达与较难达到CR密切相关，CR后WT1持续表达或表达水平明显升高可能提示近期复发，预后差。我们将增加检测样本数量，延长随访时间，对这一结果进行证实。
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总之，我们建立的DIG掺入PCR半定量检测WT1基因表达的方法能较为准确地标定WT1基因的表达水平，在国内尚属首次，为今后WT1基因以及其他基因的检测研究提供了一种较为准确、客观的方法。应用这一方法对AML病人初治、CR及复发时WT1基因表达水平的变化进行了检测，表明WT1基因作为一种新的“泛白血病”基因标志，在AML治疗及随访中具有一定的指导作用，对判断疗效、指导治疗、预测复发具有重要意义。
基金项目：国家自然科学基金(39770306)及江苏省卫生厅科研基金(H9703)
参考文献
1，Inoue K，Sugiyama H，Ogawa H，et al.WT1 as a new prognostic factor and a new marker for the detection of minimal residual disease in acute leukemia.Blood，1994，84：3071-3079.
, 百拇医药
2，Gigar A，Schmid D，Heinze G，et al.Detetion of the WT1 transcript by RT-PCR in complete remission has no prognostic relevance in de novo acute myeloid leukemia.Leukemia，1998，12：1886-1894.
3，Menssen HD，Renkl HJ，Rodeck U，et al.Presence of Wilms′ tumor gene(WT1) transcripts and the WT1 nuclear protein in the majority of human acute leukemias.Leukemia，1995，9：1060-1067.
4，Bergmann L，Miething C，Maurer U，et al.High levels of Wilms tumor gene(WT1) mRNA in acute myeloid leukemias are associated with a worse long-term outcome.Blood，1997，90：1217-1225.
5，King-Underwood L，Pritchard-Jones K.Wlims tumor(WT1) gene mutations occur mainly in acute myeloid leukemia and may confer drug resistance.Blood，1998，91：2961-2968.
收稿：1999-12-28
修回：2000-03-17, http://www.100md.com
单位：王玮 傅建新 陈子兴(215006 苏州医学院附属第一医院 江苏省血液研究所)；王玲(现在青岛医学院附属第二医院 266042)
关键词：肾母细胞瘤基因；急性髓细胞性白血病；地高辛；半定量RT-PCR
江苏医药001015 【摘要】 目的 建立客观的半定量检测WT1基因表达的方法，探讨WT1基因表达水平与急性髓细胞性白血病(AML)预后的关系。方法 用地高辛标记的脱氧三磷酸尿苷(DIG-11-dUTP)掺入逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法检测，用KG-1细胞建立WT1表达的半定量稀释曲线，分析53例AML及21例非恶性疾患病人骨髓中WT1基因的表达。结果 倍比稀释的KG-1细胞WT1基因表达水平与稀释倍数有良好的线性关系；将WT1基因与β-actin基因的表达水平之比<0.16定为(-)，≥0.16～<0.6为(+)，≥0.6～<1.0为()，≥1.0为()。21例非恶性疾患病人骨髓中WT1基因均为阴性，41例初治AML病人WT1基因表达阳性率为92.7%，随着WT1基因表达水平的升高，完全缓解(CR)率有明显下降的趋势(<0.6及≥0.6组比较P<0.025)。CR后WT1基因表达水平明显下降，复发后又显著升高。结论 DIG掺入RT-PCR半定量检测WT1基因表达的方法客观、准确，WT1基因表达水平与AML的预后相关。
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Analysis of WT1 gene expression in acute myelocytic leukemia by DIG labeled RT-PCR.
WANG Ling WANG Wei FU Jianxin et al.
(Jiangsu Institute of Hematology，the First Affiliated Hospital of Suzhou Medical College，Suzhou 215006)
【Abstract】 Objective To establish an objective and quantitative criterion for the assessment of WT1 gene expression and study the correlation between WT1 gene expression and prognosis of AML.Methods Using DIG labeled RT-PCR assay，a semi-quantitative curve of WT1 gene expression was established in KG-1 cell line.Based on this standard，WT1 gene expression was determined in the bone marrow specimens from 53 AML patients and 21 nonmalignant patients.Results WT1 gene expression level was classified as (-)(the ratio of WT1/β-actin PCR products<0.16)，(+)(≥0.16～<0.6)，()(≥0.6～<1.0)and ()(≥1.0) respectively.WT1 gene expression in 21 nonmalignant patients was (-)，positive rate of WT1 gene expression was 92.7% in 41 first diagnosed cases.The CR rate was markedly decreased as WT1 gene expression level increased(≥0.6 v <0.6 group，P<0.025).Short-term follow-up of 12 M3 patients showed that WT1 gene expression level was markedly decreased after CR whereas highly increased when relapsed.Conclusion The method we established using DIG labeled RT-PCR was objective and quantitative.WT1 gene expression level was correlated with the prognosis of AML.
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【Key words】 Gene，Wilm＇stumor Acute myelocytic leukemia DIG Semi-quantitative RT-PCR
WT1基因(Wilms瘤基因)是儿童肾母细胞瘤的易感基因。1990年由Call等人克隆并定位于染色体11p13，全长约50Kb，共有10个外显子，它编码的分子量为52-54KDa的锌指蛋白是一种双向转录调控因子，在肿瘤的发生中起重要的作用。近年来发现在白血病尤其AML中WT1基因有异常的高表达，而且表达水平与预后有关，高表达可能导致差的预后[1]，但对此也存在争议[2]。因此需要建立一种较为精确的定量方法来检测WT1基因的表达水平。我们建立了一种DIG掺入RT-PCR方法，对54例AML病人进行了半定量检测及短期随访观察，探讨WT1基因表达水平与AML预后的关系。
材料和方法
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1.急性髓细胞白血病细胞系KG-1由本实验室长期保存。
2.41例初治AML患者均为我院病人，按MIC诊断标准分型，用标准DA或HA方案化疗，M3病人用全反式维甲酸(ATRA)诱导分化及联合化疗治疗。其中M17例，M212例，M316例，M42例，M52例，M62例。男23例，女18例，中位数年龄35(3～67)岁。我们对另外12例M3病人进行了短期随访，12例病人均入院治疗，由ATRA进行诱导分化至骨髓形态学完全缓解(CR)，缓解后继续用联合化疗及ATRA维持治疗。21例经骨髓形态学检查排除恶性血液疾患病人骨髓细胞作为对照。
3.WT1、β-actin基因引物由生工公司合成，引物序列如下：
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WT1(343bp)
sense 5-CTGTCCCACTTACAGATGCA-3
antisense 5-TCAAAGCGCCAGCTGGAGTTT-3
β-actin(265bp)
sense 5-AGGCCGGCTTCGCGGGCGAC-3
antisense 5-CTCGGGAGCCACACGCAGCTC-3
二、实验方法
1.单个核细胞分离按常规方法进行，RNA提取采用TRIzol试剂(GibcoBRL)。
2.逆转录反应：总RNA2μg，M-MLV(GibcoBRL)200U，总逆转录体系40μl，其余按本室常规进行。
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4.PCR反应：反应体系50μl，WT1基因扩增时取逆转录产物5μl，β-actin基因扩增时取逆转录产物取2μl。寡核苷酸引物各100ng，10×PCR buffer 5μl，2.0mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTPs，2.0μmol/L DIG-11-dUTP，Taq DNA聚合酶(上海生工公司)1.5U。反应条件：WT1基因95℃变性5分；94℃变性45秒，58℃退火45秒，72℃延伸60秒，共35个循环；72℃延伸7分。β-actin基因条件同上，进行20个循环。
5.PCR产物分析：取适量WT1基因及β-actin基因PCR产物混匀，在2%琼脂糖凝胶上进行电泳(80V，1.5小时)。在紫外检测仪上切割所需印迹凝胶块，碱变性、中和、10×SSC平衡后将DNA产物转移至尼龙膜上。洗膜、封闭后将连有碱性磷酸酶(AP)的抗-DIG抗体(德国宝灵曼公司)的Fab片段结合至产物上，加入AP发光底物CSPD，X线片上数分钟显影，洗片后观察结果。X线片在紫外线像仪上经Gel Doc1000软件进行扫描定量，计算WT1基因产物与β-actin基因产物比值。
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6.半定量稀释曲线的建立：KG-1细胞株的cDNA倍比稀释至2-8倍，PCR扩增出各点的WT1基因产物，分别与未稀释点扩增的β-actin产物进行比较，根据扫描得到的WT1基因与β-actin的比值建立WT1基因表达的半定量稀释曲线。同时进行各稀释点的β-actin扩增，分别观察两种基因产物在特定的循环数cDNA倍比稀释时产物的线性关系。
7.统计学检验：采用四格表精确概率法。
结果
一、首先用倍比稀释的方法证实在35个循环内WT1基因扩增产物与所加入的模板量呈线性关系，而β-actin基因在20个循环时也在线性关系范围内扩增。
二、对KG-1细胞株的cDNA各稀释点WT1基因与原点的β-actin基因PCR产物电泳后X线片显影结果进行扫描，建立了标准曲线，见图1。根据该曲线可见DIG掺入PCR灵敏度可以达到2-4水平，WT1基因扩增产物与所加入的模板的量呈很好的线性关系。
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三、收集41例初治AML病人骨髓标本，RNA抽提及逆转录后用以上建立的DIG掺入半定量方法检测WT1基因的表达。发现初治病人阳性率达92.7%，见图2。将WT1和β-actin基因表达水平的比值<0.16定为阴性，≥0.16～<0.6为弱阳性(+)，≥0.6～<1.0为中等度阳性(
)，≥1.0为强阳性()，其表达程度及CR率见表1。CR率与WT1基因表达水平呈明显的负相关。鉴于M3病例在发病机制和治疗上的特殊性，未将其进行统计，结果发现CR率在≥0.6组(7/16)和<0.6组(9/10)之间有统计学意义(P<0.025)。图1 KG-1细胞中WT1基因表达的半定量稀释曲线
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图2 DIG-PCR检测AML病人WT1基因表达
M：Marker 1～8：WT1基因表达阳性 9：WT1基因表达阴性表1 WT1基因表达与CR率的关系 WT1
CR
NR
总例数
CR率(%)
6
6
12
50
, 百拇医药
11
4
15
73.3
+
10
1
11
90.1
-
3
0
3
100
, 百拇医药
合计
30
11
41
73.2
四、对12例M3病人进行了短期随访，包括8例初治、经ATRA或联合化疗治疗后缓解病人，4例缓解后复发病人。WT1基因检测结果如下：8例初治病人治疗后7例达到CR，WT1基因在CR后明显下降，5例检测不到；另外2例CR时WT1仍阳性的病人均在短期内复发(2、6个月)；1例病人WT1基因持续高表达，半年未能达到CR而死亡。4例病人从CR开始进行的随访观察发现：1例CR时阳性(+)，复发后明显升高(
)；3例CR时阴性表达者，复发后WT1基因均转为阳性(+)～()，4例复发时间在7～12个月之间。, 百拇医药
五、对21例非恶性疾患病人骨髓进行了检测，均未检测到WT1基因表达。讨论
对于AML的预后判断，目前有很多方法，如染色体分析、免疫表型监测、PCR检测特异性基因标志等，而后种方法因其灵敏度高、先知性强等优点已成为常用的方法之一。虽然PCR对残留白血病细胞的检出率为10-4～10-5，但因为具有特异性基因标志的白血病很少，使其应用范围很窄。诸多研究表明肿瘤抑制基因WT1在白血病中有异常高的表达，与染色体核型、年龄及性别等无关，尤以在AML中阳性率高，可达73%～100%[3]。因此WT1基因可以作为一种独立应用的“泛白血病”基因标志，用于白血病的疗效观察及随访等。为了达到半定量目的，我们选用了DIG掺入RT-PCR，扩增后用抗体及发光剂检测产物量，最后计算机扫描定量的方法。该方法与直接在紫外光下观察溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶的传统方法比较，结果更加客观，灵敏度可提高至2-4水平。与同位素标记的分析方法相比，该方法简便易行，避免了同位素接触，有同样高的半定量准确性。如此，建立了一种较为客观的定量方法，为更合理地评价WT1基因在白血病发病中所起的作用提供了研究手段。
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我们的研究发现WT1基因在AML中确有异常高表达，阳性率达92.7%；AML各亚型中，M1～M3亚型表达较M4～M6亚型表达高，与文献报道一致[1]。对21例非恶性疾患病人骨髓进行了检测，均未检测到WT1基因表达，说明WT1基因在正常骨髓中的表达水平明显低于白血病细胞，提示WT1基因可以作为一种“泛白血病”基因标记。对41例初治AML病人的CR状况进行的研究显示，随着WT1表达水平的升高，CR率存在明显降低的趋势。提示初治时WT1基因高表达可能导致AML差的预后[1，4]，并可能与耐药有关[5]。
对12例M3病人的随访分析发现，WT1基因持续高表达与较难达到CR密切相关，CR后WT1持续表达或表达水平明显升高可能提示近期复发，预后差。我们将增加检测样本数量，延长随访时间，对这一结果进行证实。
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总之，我们建立的DIG掺入PCR半定量检测WT1基因表达的方法能较为准确地标定WT1基因的表达水平，在国内尚属首次，为今后WT1基因以及其他基因的检测研究提供了一种较为准确、客观的方法。应用这一方法对AML病人初治、CR及复发时WT1基因表达水平的变化进行了检测，表明WT1基因作为一种新的“泛白血病”基因标志，在AML治疗及随访中具有一定的指导作用，对判断疗效、指导治疗、预测复发具有重要意义。
基金项目：国家自然科学基金(39770306)及江苏省卫生厅科研基金(H9703)
参考文献
1，Inoue K，Sugiyama H，Ogawa H，et al.WT1 as a new prognostic factor and a new marker for the detection of minimal residual disease in acute leukemia.Blood，1994，84：3071-3079.
, 百拇医药
2，Gigar A，Schmid D，Heinze G，et al.Detetion of the WT1 transcript by RT-PCR in complete remission has no prognostic relevance in de novo acute myeloid leukemia.Leukemia，1998，12：1886-1894.
3，Menssen HD，Renkl HJ，Rodeck U，et al.Presence of Wilms′ tumor gene(WT1) transcripts and the WT1 nuclear protein in the majority of human acute leukemias.Leukemia，1995，9：1060-1067.
4，Bergmann L，Miething C，Maurer U，et al.High levels of Wilms tumor gene(WT1) mRNA in acute myeloid leukemias are associated with a worse long-term outcome.Blood，1997，90：1217-1225.
5，King-Underwood L，Pritchard-Jones K.Wlims tumor(WT1) gene mutations occur mainly in acute myeloid leukemia and may confer drug resistance.Blood，1998，91：2961-2968.
收稿：1999-12-28
修回：2000-03-17, http://www.100md.com