蛇床子素对新生大鼠颅盖骨成骨细胞的作用
作者：张巧艳 秦路平 田野萍 郑汉臣 黄茅 刘祖德
单位：张巧艳(第二军医大学药学院生药学教研室，上海 200433)；秦路平(第二军医大学药学院生药学 教研室，上海 200433)；田野萍(基础医学部免疫学教研室)；郑汉臣(第二军医大学药学院生药学教研室，上海 200433) 黄茅(药学院药理学教研室)；刘祖德(长征医院骨科)
关键词：蛇床子素；骨质疏松；成骨细胞；碱性磷酸酶；胶原合成
第二军医大学学报001010 [摘要] 目的：研究蛇床子素(osthole)在体外对新生大鼠颅盖骨 成骨细胞增殖及成骨作用的影响。方法：酶消化法分离培养新生大鼠 颅盖骨成骨细胞；改良Gomori钙钴法染色鉴定，3H-胸腺嘧啶和3H-脯氨酸掺入法分别 测定细胞增殖和胶原合成；磷酸苯二钠法测定细胞内骨碱性磷酸酶(ALP)活性；并以抗骨 质疏松症药物依普黄酮(ipriflavone, IP)作为阳性对照药物。结果：蛇床子素对新生大鼠颅盖骨成骨细胞的增殖、ALP的活性和胶原合成都有促进作用。其对 成骨细胞的增殖作用比IP强，但对胶原合成的促进作用弱于IP。结论：蛇床子素通过增加成骨细胞数量、促进细胞胶原蛋白及ALP的合成而促进成骨作用。
, 百拇医药
[中图分类号] R 285.5 [文献标识码] A
[文章编号] 0258-879X(2000)10-0935-03
Effect of osthole on osteoblasts in neonatal rat calvarial cultures
ZHANG Qiao-Yan, QIN Lu-Ping,ZHENG Han-Chen
(epartment of Pharmacognosy, College of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
TIAN Ye-Ping
, 百拇医药 (Department of Immunology, Department of Basic Medicine)
HUANG Mao
(Department of Pharmacology, College of Pharmacy)
LIU Zu-De
(Department of Orthopaedic, Changzheng Hospital)
[ABSTRACT] Objective: To study the effects of osthole on prol iferation and differentiation of osteoblasts in neonatal rat calvarial cultures in vitro. Methods: Osteoblasts were isolated from neonatal r at calvaria through trypsin and collagenase digestion. Quality of the cells was assessed by special ALP histochemistry. The proliferation and collagen synthesis of osteoblasts were assayed by 3 H-TdR and 3 H-proline incorporation. The activity of ALP was measured by p-nitrophenyl sodium pho sphate assay. Ipriflavone (IP) was used as positive control drug. Result s: Osthole significantly promoted osteoblast proliferation, alkaline pho sphatase activity and collagen synthesis. The effect of osthole was more potent than IP in bone cell proliferation, but was weaker than IP in collagen synthesis . Conclusion: Osthole has osteoblastic effect by increasing oste oblast proliferation, ALP activity and collagen synthesis.
, http://www.100md.com
[KEY WORDS] osthole; osteoporosis; osteoblasts; alkaline phosphatase; collagen synthesis
蛇床子素(osthole)是从中药蛇床子(系伞形科植物蛇床Cnidium monnieri Cuss. 的干燥成熟果实[1])中提取精制的一种香豆素类成分。现代药理研究证明,蛇床子 素在大鼠体内能明显抑制去卵巢诱导的骨高转换，防止骨质丢失，具抗骨质疏松的作用 [2]。依普黄酮(ipriflavone)是60年代后期匈牙利研究者合成的一种异黄酮衍生物， 为7-异丙氧基异黄酮。早期的研究证实，依普黄酮可通过增加成骨细胞的数量而增加骨形 成，同时对胶原的合成有刺激作用[3]。本实验旨在研究体外环境下，蛇床子素对 新生大鼠颅盖骨成骨细胞的作用，阐明蛇床子素防治骨质疏松症的细胞学机制，为蛇床子 素用于防治骨质疏松症提供实验依据。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 和试剂 蛇床子素为作者从中药蛇床子(1999年10月购于江苏徐州新沂市药材公司 ，由郑汉臣教授鉴定)中提取，经波谱鉴定，纯度为93.8%。依普黄酮为华西医科大学 骨质疏松药物研究实验室翁玲玲老师惠赠。动物：出生2～3 d的Wistar大鼠(第二军医大学 实验动物中心提供)。RPMI 1640培养基、胰蛋白酶(活力1∶250)均为Gibco公司产品；小 牛血清为杭州四季青生物工程材料研究所产品；胶原酶Ⅰ型为Worthington生化公司产品； 3H-TdR购自上海原子能研究所；3H-脯氨酸购自中国原子能科学研究院；对硝基苯酚 磷酸钠购自上海生化试剂公司。
1.2 细胞培养 新生大鼠颅盖骨成骨细 胞参照刘祖德等培养方法[4]。原代细胞长成致密单层后，用0.25%胰蛋白酶进行消 化，以1∶3比例传代，以后每2 d换液1次，长成致密单层后用于实验。
, 百拇医药
1.3 细胞鉴定 (1)倒置显微镜下观察：培养第2天大部分细胞贴壁，贴壁后主 要为梭形、圆形或鳞片状；3～4 d时细胞突起伸展，相互搭连成片，长满瓶底时，细胞为梭 形及立方块状，排列紧密，并可见圆形及鳞片状细胞。随着培养时间的延长，可见成骨细胞 呈多层生长。(2)碱性磷酸酶染色：在原代培养成骨细胞时，于6孔培养板内置一盖玻片， 分别于培养的第6天和第10天，用Gomori钙钴法行碱性磷酸酶染色，结果大多数细胞的细胞 质及细胞膜上形成了灰黑至深黑色的颗粒状或片状沉淀，证明该细胞具有分泌碱性磷酸酶的 活性，为成骨细胞[4]。
1.4 细胞增殖实验 96孔培养板，每孔加入100 μl细胞悬液(1×105个/ml), 在37℃，5%CO2孵育箱中培养24 h，使细胞贴壁，换含不同浓度蛇床子素的培养液，同时 设不加蛇床子素的阴性对照和含1×10-6 mol/L依普黄酮的阳性对照，继续培养48， 72 h，并于结束培养前12 h，每孔加入37 kBq的3H-TdR。培养结束后，弃上清液，每孔 加入0.25%的胰蛋白酶100 μl，于37℃消化20 min，收集细胞于玻璃纤维素滤纸上，用液 体闪烁计数仪测其放射性。
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1.5 碱性磷酸酶活性测定 24孔培养板，每孔加入1 ml 细胞悬液(1×105个/m l)，余同1.4项。继续培养2，6和10 d后，弃上清液，用PBS洗细胞3次，参照文献[5] 的方法进行测定，碱性磷酸酶的活性以每孔生成的对硝基苯酚的纳摩尔数表示。
1.6 胶原合成测定 除用不同浓度蛇床子素的培养液继续培养48 h，在结束培养 前12 h，每孔加入37 kBq 3 H-脯氨酸外，余同1.4项。
1.7 统计学处理 所有数据均以
±s表示，采用t检验。
2 结 果
2.1 蛇床子素对成骨细胞增殖的影响 结 果见表1。蛇床子素 1×10-8～1×10-5 mol/L浓度对成骨细胞的增殖有明显的 促进作用。在48 h时间点，以1×10-8及1×10-7 mol/L浓度作用较强，分 别比阴性对照增加54.8%及81.8%，比阳性对照药物依普黄酮增加5.3%及23.6%。在72 h 时间点，以1×10-6及1×10-5 mol/L浓度作用较强，分别比阴性对照增加70.8 %及61.9%，比阳性对照药物依普黄酮增加35.3%及28.3%。在高浓度(1×10-4 mol/L)作用下蛇床子素对成骨细胞的增殖作用与对照相比无显著性差异。
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表 1 蛇床子素对新生大鼠颅盖骨
成骨细胞增殖的影响
Tab 1 Effects of osthole on proliferation of
osteoblasts i n neonatal rat calvaria cultures(n=4,±s) Osthole concentration(cB/mol*L-1)
3 H-thymidine incorporation (A/Bq)
48 h
72 h
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Control
31.20±3.85
29.65±4.52
1×10-8
48.31±5.54**
40.22±4.89**
1×10-7
56.72±6.71**△
39.27±0.84**
1 ×10-6
, http://www.100md.com
45.39±4.25**
50.64±4.82**△
1×10-5
45.85±6.57**
48.01±6.05**
1×10-4
34.63±1.46
29.77±2.97
Ipriflavone(1×10-6)
, 百拇医药 45.86±3.14**
37.43±1.60*
* P<0.05； ** P<0.01 vs contro l； △ P<0.05 vs ipriflavone2.2 蛇床子素对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响 从表2可以看出，由成骨细胞分 泌的碱性磷酸酶活性随着培养时间的延长而逐渐增强，但第10天后活性开始下降，第15天降 至23.20 nmol/well。用蛇床子素刺激后，与阴性对照相比，2 d时，碱性磷酸酶活性受到抑 制，6 d时，1×10-7～1×10-5 mol/L的蛇床子素浓度依赖性地增加成骨细胞 碱性磷酸酶的活性；10 d时，这种增加作用又减弱。阳性对照药物依普黄酮对成骨细胞碱性 磷酸酶活性的影响在第2，6天时与阴性对照相比无明显差异，第10天时活性高于阴性对照， 但无显著性差异。
, 百拇医药
2.3 蛇床子素对成骨细胞合成胶原的影响 结果见表3。 在1×10-8 及1×10-7 mol/L蛇床子素作用下，3H-脯氨酸的掺入量较高，分别比阴性对照 增加33.1%和21.7%，说明蛇床子素对成骨细胞合成胶原具有显著的促进作用。阳性对照药物 依普黄酮对成骨细胞合成胶原的作用明显强于蛇床子素。
表 2 蛇床子素对新生大鼠颅盖骨
成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响
Tab 2 Effects of osthole on the alkaline phosphatase
activity of osteoblasts in neonatal rat calvaria cultures(n=3,±s) Osthole
, 百拇医药
concentration
(cB/mol.L-1)
ALP activity(cB/nmol.well-1)
2 d
6 d
10 d
Control
16.01±1.91
67.64±2.81
70.98±3.38
, 百拇医药
1×10-8
9.47±0.43
65.23±4.34
72.19±7.72
1×10-7
10.17±0.72
78.60±6.84
67.45±5.15
1×10-6
9.41±0.70
82.95±6.02*
, 百拇医药
72.79±4.57
1×10-5
8.89±0.65
87.26±5.55**
72.16±5.35
1×10-4
8.59±1.06
66.38±0.53
73.26±5.73
Ipriflavone(1×10-6)
, http://www.100md.com
15.68±0.43
68.79±5.41
82.27±6.88
*P<0.05, ** P<0.01 vs control表 3 蛇床子素对新生大鼠颅
盖骨成骨细胞合成胶原的影响
Tab 3 Effects of osthole on collagen synthesis of
osteoblasts in neonatal rat calvaria cultures(n=6,±s) Concentration(cB/mol.L-1)
, 百拇医药
3 H-proline incorporation/(A/Bq)
Osthole
Ipriflavone
Control
104.14± 9.79
104.14± 9.79
1×10-10
108.95±11.39
89.91± 7.69
1×10-9
, 百拇医药
107.84±10.28
214.65± 4.40**△△
1×10-8
138.64±10.88**
191.46±10.22**△△
1×10-7
126.72±13.41**
155.76± 5.39**△△
1×10-6
, 百拇医药
105.49±11.98
131.19±10.97**△△
1×10-5
114.63±10.94
112.83±10.97
**P<0.01 vs control; △△ P<0.01 vs osth ole3 讨 论
实验结果表明，蛇床子素能够刺激成骨细胞3H-胸腺嘧啶和3H-脯氨酸掺入量，提示蛇 床子素具有刺激大鼠成骨细胞的增殖和骨胶原合成作用；在成骨细胞碱性磷酸酶活性最高时 ，蛇床子素显著增加成骨细胞碱性磷酸酶的活性，这些结果与蛇床子素在整体动 物实验中抗骨质疏松的作用相一致。所以，蛇床子素在整体水平增加骨量的基础是促进成骨 细胞的成骨作用。
, 百拇医药
碱性磷酸酶是参与骨代谢的重要蛋白质，通过分解磷酸酯的无机磷，增加其局部浓度，促 进基质矿化。新生大鼠成骨细胞碱性磷酸酶的活性在细胞分化的早期(6～10 d)达到最高 ，在矿化阶段则下降，此点与文献报道相一致[6]。本实验发现，蛇床子素在1× 10-6～1×10-5 mol/L时，在成骨细胞分化阶段(6 d)明显增加碱性磷酸酶的 活性，并且与对照相比具有显著性差异。依普黄酮对碱性磷酸酶的分泌无明显的作用。
胶原是骨细胞外最丰富的基质蛋白，骨基质的90%由胶原组成，在维持纤维连接组织的结构 及功能上起重要作用。分析测定蛇床子素和依普黄酮对成骨细胞3H-脯氨酸掺入作用后发 现，蛇床子素和依普黄酮都能刺激成骨细胞合成胶原，但蛇床子素的作用比依普黄酮弱。这 与文献报道的依普黄酮刺激成骨细胞分泌胶原的作用相一致。
[基金项目]国家自然科学基金资助项目(39770905).
, 百拇医药
[作者简介]张巧艳(1965-)，女(汉族)，博士生，主管药师.
[参 考 文 献]
[1] 中华人民共和国药典委员会编. 中华人民共和国药典.1995年版，一 部[M]. 广州：广东科技出版社，1995. 276.
[2] 李朝阳，吴 铁，李青南， 等. 蛇床子素对去卵巢大鼠近侧胫骨代谢影响的定量研究[J]. 药学学报，1996，31(5 )：327-332.
[3] Notoyon K, Yoshida K, Tsukuda R. Effect of ipriflavone on expression of markers characteristic of the osteoblast phenotype in rat bone marrow stroma l cell culture [J]. J Bone Miner Res, 1994, 9(3):395-400.
, 百拇医药
[4] 刘祖德，臧鸿声，欧阳跃平. 新生大鼠颅骨成骨性细胞体外生长过程研究[J ]. 解剖学报，1995，26(2)：157-159.
[5] 韩志岩，程锦轩，刘景生. 人甲状旁腺素(1-34)对新生大鼠成骨细胞碱性磷 酸酶活性影响[J]. 药学学报，1999，34(8)：582-585.
[6] Owen TA, Aronow M, Shaloub V, et al. Progressive development of r at osteoblast phenotype in vitro reciprocal relationship in expression of ge nes associated with osteoblast proliferation and differentiation during formatio n of bone extracellular matrix[J]. J Cell Physiol，1990，143(3): 420-430.
[收稿日期] 2000-05-31
[修回日期] 2000-07-24, 百拇医药
单位：张巧艳(第二军医大学药学院生药学教研室，上海 200433)；秦路平(第二军医大学药学院生药学 教研室，上海 200433)；田野萍(基础医学部免疫学教研室)；郑汉臣(第二军医大学药学院生药学教研室，上海 200433) 黄茅(药学院药理学教研室)；刘祖德(长征医院骨科)
关键词：蛇床子素；骨质疏松；成骨细胞；碱性磷酸酶；胶原合成
第二军医大学学报001010 [摘要] 目的：研究蛇床子素(osthole)在体外对新生大鼠颅盖骨 成骨细胞增殖及成骨作用的影响。方法：酶消化法分离培养新生大鼠 颅盖骨成骨细胞；改良Gomori钙钴法染色鉴定，3H-胸腺嘧啶和3H-脯氨酸掺入法分别 测定细胞增殖和胶原合成；磷酸苯二钠法测定细胞内骨碱性磷酸酶(ALP)活性；并以抗骨 质疏松症药物依普黄酮(ipriflavone, IP)作为阳性对照药物。结果：蛇床子素对新生大鼠颅盖骨成骨细胞的增殖、ALP的活性和胶原合成都有促进作用。其对 成骨细胞的增殖作用比IP强，但对胶原合成的促进作用弱于IP。结论：蛇床子素通过增加成骨细胞数量、促进细胞胶原蛋白及ALP的合成而促进成骨作用。
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[中图分类号] R 285.5 [文献标识码] A
[文章编号] 0258-879X(2000)10-0935-03
Effect of osthole on osteoblasts in neonatal rat calvarial cultures
ZHANG Qiao-Yan, QIN Lu-Ping,ZHENG Han-Chen
(epartment of Pharmacognosy, College of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
TIAN Ye-Ping
, 百拇医药 (Department of Immunology, Department of Basic Medicine)
HUANG Mao
(Department of Pharmacology, College of Pharmacy)
LIU Zu-De
(Department of Orthopaedic, Changzheng Hospital)
[ABSTRACT] Objective: To study the effects of osthole on prol iferation and differentiation of osteoblasts in neonatal rat calvarial cultures in vitro. Methods: Osteoblasts were isolated from neonatal r at calvaria through trypsin and collagenase digestion. Quality of the cells was assessed by special ALP histochemistry. The proliferation and collagen synthesis of osteoblasts were assayed by 3 H-TdR and 3 H-proline incorporation. The activity of ALP was measured by p-nitrophenyl sodium pho sphate assay. Ipriflavone (IP) was used as positive control drug. Result s: Osthole significantly promoted osteoblast proliferation, alkaline pho sphatase activity and collagen synthesis. The effect of osthole was more potent than IP in bone cell proliferation, but was weaker than IP in collagen synthesis . Conclusion: Osthole has osteoblastic effect by increasing oste oblast proliferation, ALP activity and collagen synthesis.
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[KEY WORDS] osthole; osteoporosis; osteoblasts; alkaline phosphatase; collagen synthesis
蛇床子素(osthole)是从中药蛇床子(系伞形科植物蛇床Cnidium monnieri Cuss. 的干燥成熟果实[1])中提取精制的一种香豆素类成分。现代药理研究证明,蛇床子 素在大鼠体内能明显抑制去卵巢诱导的骨高转换，防止骨质丢失，具抗骨质疏松的作用 [2]。依普黄酮(ipriflavone)是60年代后期匈牙利研究者合成的一种异黄酮衍生物， 为7-异丙氧基异黄酮。早期的研究证实，依普黄酮可通过增加成骨细胞的数量而增加骨形 成，同时对胶原的合成有刺激作用[3]。本实验旨在研究体外环境下，蛇床子素对 新生大鼠颅盖骨成骨细胞的作用，阐明蛇床子素防治骨质疏松症的细胞学机制，为蛇床子 素用于防治骨质疏松症提供实验依据。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 和试剂 蛇床子素为作者从中药蛇床子(1999年10月购于江苏徐州新沂市药材公司 ，由郑汉臣教授鉴定)中提取，经波谱鉴定，纯度为93.8%。依普黄酮为华西医科大学 骨质疏松药物研究实验室翁玲玲老师惠赠。动物：出生2～3 d的Wistar大鼠(第二军医大学 实验动物中心提供)。RPMI 1640培养基、胰蛋白酶(活力1∶250)均为Gibco公司产品；小 牛血清为杭州四季青生物工程材料研究所产品；胶原酶Ⅰ型为Worthington生化公司产品； 3H-TdR购自上海原子能研究所；3H-脯氨酸购自中国原子能科学研究院；对硝基苯酚 磷酸钠购自上海生化试剂公司。
1.2 细胞培养 新生大鼠颅盖骨成骨细 胞参照刘祖德等培养方法[4]。原代细胞长成致密单层后，用0.25%胰蛋白酶进行消 化，以1∶3比例传代，以后每2 d换液1次，长成致密单层后用于实验。
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1.3 细胞鉴定 (1)倒置显微镜下观察：培养第2天大部分细胞贴壁，贴壁后主 要为梭形、圆形或鳞片状；3～4 d时细胞突起伸展，相互搭连成片，长满瓶底时，细胞为梭 形及立方块状，排列紧密，并可见圆形及鳞片状细胞。随着培养时间的延长，可见成骨细胞 呈多层生长。(2)碱性磷酸酶染色：在原代培养成骨细胞时，于6孔培养板内置一盖玻片， 分别于培养的第6天和第10天，用Gomori钙钴法行碱性磷酸酶染色，结果大多数细胞的细胞 质及细胞膜上形成了灰黑至深黑色的颗粒状或片状沉淀，证明该细胞具有分泌碱性磷酸酶的 活性，为成骨细胞[4]。
1.4 细胞增殖实验 96孔培养板，每孔加入100 μl细胞悬液(1×105个/ml), 在37℃，5%CO2孵育箱中培养24 h，使细胞贴壁，换含不同浓度蛇床子素的培养液，同时 设不加蛇床子素的阴性对照和含1×10-6 mol/L依普黄酮的阳性对照，继续培养48， 72 h，并于结束培养前12 h，每孔加入37 kBq的3H-TdR。培养结束后，弃上清液，每孔 加入0.25%的胰蛋白酶100 μl，于37℃消化20 min，收集细胞于玻璃纤维素滤纸上，用液 体闪烁计数仪测其放射性。
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1.5 碱性磷酸酶活性测定 24孔培养板，每孔加入1 ml 细胞悬液(1×105个/m l)，余同1.4项。继续培养2，6和10 d后，弃上清液，用PBS洗细胞3次，参照文献[5] 的方法进行测定，碱性磷酸酶的活性以每孔生成的对硝基苯酚的纳摩尔数表示。
1.6 胶原合成测定 除用不同浓度蛇床子素的培养液继续培养48 h，在结束培养 前12 h，每孔加入37 kBq 3 H-脯氨酸外，余同1.4项。
1.7 统计学处理 所有数据均以
±s表示，采用t检验。2 结 果
2.1 蛇床子素对成骨细胞增殖的影响 结 果见表1。蛇床子素 1×10-8～1×10-5 mol/L浓度对成骨细胞的增殖有明显的 促进作用。在48 h时间点，以1×10-8及1×10-7 mol/L浓度作用较强，分 别比阴性对照增加54.8%及81.8%，比阳性对照药物依普黄酮增加5.3%及23.6%。在72 h 时间点，以1×10-6及1×10-5 mol/L浓度作用较强，分别比阴性对照增加70.8 %及61.9%，比阳性对照药物依普黄酮增加35.3%及28.3%。在高浓度(1×10-4 mol/L)作用下蛇床子素对成骨细胞的增殖作用与对照相比无显著性差异。
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表 1 蛇床子素对新生大鼠颅盖骨
成骨细胞增殖的影响
Tab 1 Effects of osthole on proliferation of
osteoblasts i n neonatal rat calvaria cultures(n=4,
±s) Osthole concentration(cB/mol*L-1)3 H-thymidine incorporation (A/Bq)
48 h
72 h
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Control
31.20±3.85
29.65±4.52
1×10-8
48.31±5.54**
40.22±4.89**
1×10-7
56.72±6.71**△
39.27±0.84**
1 ×10-6
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45.39±4.25**
50.64±4.82**△
1×10-5
45.85±6.57**
48.01±6.05**
1×10-4
34.63±1.46
29.77±2.97
Ipriflavone(1×10-6)
, 百拇医药 45.86±3.14**
37.43±1.60*
* P<0.05； ** P<0.01 vs contro l； △ P<0.05 vs ipriflavone2.2 蛇床子素对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响 从表2可以看出，由成骨细胞分 泌的碱性磷酸酶活性随着培养时间的延长而逐渐增强，但第10天后活性开始下降，第15天降 至23.20 nmol/well。用蛇床子素刺激后，与阴性对照相比，2 d时，碱性磷酸酶活性受到抑 制，6 d时，1×10-7～1×10-5 mol/L的蛇床子素浓度依赖性地增加成骨细胞 碱性磷酸酶的活性；10 d时，这种增加作用又减弱。阳性对照药物依普黄酮对成骨细胞碱性 磷酸酶活性的影响在第2，6天时与阴性对照相比无明显差异，第10天时活性高于阴性对照， 但无显著性差异。
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2.3 蛇床子素对成骨细胞合成胶原的影响 结果见表3。 在1×10-8 及1×10-7 mol/L蛇床子素作用下，3H-脯氨酸的掺入量较高，分别比阴性对照 增加33.1%和21.7%，说明蛇床子素对成骨细胞合成胶原具有显著的促进作用。阳性对照药物 依普黄酮对成骨细胞合成胶原的作用明显强于蛇床子素。
表 2 蛇床子素对新生大鼠颅盖骨
成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响
Tab 2 Effects of osthole on the alkaline phosphatase
activity of osteoblasts in neonatal rat calvaria cultures(n=3,
±s) Osthole, 百拇医药
concentration
(cB/mol.L-1)
ALP activity(cB/nmol.well-1)
2 d
6 d
10 d
Control
16.01±1.91
67.64±2.81
70.98±3.38
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1×10-8
9.47±0.43
65.23±4.34
72.19±7.72
1×10-7
10.17±0.72
78.60±6.84
67.45±5.15
1×10-6
9.41±0.70
82.95±6.02*
, 百拇医药
72.79±4.57
1×10-5
8.89±0.65
87.26±5.55**
72.16±5.35
1×10-4
8.59±1.06
66.38±0.53
73.26±5.73
Ipriflavone(1×10-6)
, http://www.100md.com
15.68±0.43
68.79±5.41
82.27±6.88
*P<0.05, ** P<0.01 vs control表 3 蛇床子素对新生大鼠颅
盖骨成骨细胞合成胶原的影响
Tab 3 Effects of osthole on collagen synthesis of
osteoblasts in neonatal rat calvaria cultures(n=6,
±s) Concentration(cB/mol.L-1), 百拇医药
3 H-proline incorporation/(A/Bq)
Osthole
Ipriflavone
Control
104.14± 9.79
104.14± 9.79
1×10-10
108.95±11.39
89.91± 7.69
1×10-9
, 百拇医药
107.84±10.28
214.65± 4.40**△△
1×10-8
138.64±10.88**
191.46±10.22**△△
1×10-7
126.72±13.41**
155.76± 5.39**△△
1×10-6
, 百拇医药
105.49±11.98
131.19±10.97**△△
1×10-5
114.63±10.94
112.83±10.97
**P<0.01 vs control; △△ P<0.01 vs osth ole3 讨 论
实验结果表明，蛇床子素能够刺激成骨细胞3H-胸腺嘧啶和3H-脯氨酸掺入量，提示蛇 床子素具有刺激大鼠成骨细胞的增殖和骨胶原合成作用；在成骨细胞碱性磷酸酶活性最高时 ，蛇床子素显著增加成骨细胞碱性磷酸酶的活性，这些结果与蛇床子素在整体动 物实验中抗骨质疏松的作用相一致。所以，蛇床子素在整体水平增加骨量的基础是促进成骨 细胞的成骨作用。
, 百拇医药
碱性磷酸酶是参与骨代谢的重要蛋白质，通过分解磷酸酯的无机磷，增加其局部浓度，促 进基质矿化。新生大鼠成骨细胞碱性磷酸酶的活性在细胞分化的早期(6～10 d)达到最高 ，在矿化阶段则下降，此点与文献报道相一致[6]。本实验发现，蛇床子素在1× 10-6～1×10-5 mol/L时，在成骨细胞分化阶段(6 d)明显增加碱性磷酸酶的 活性，并且与对照相比具有显著性差异。依普黄酮对碱性磷酸酶的分泌无明显的作用。
胶原是骨细胞外最丰富的基质蛋白，骨基质的90%由胶原组成，在维持纤维连接组织的结构 及功能上起重要作用。分析测定蛇床子素和依普黄酮对成骨细胞3H-脯氨酸掺入作用后发 现，蛇床子素和依普黄酮都能刺激成骨细胞合成胶原，但蛇床子素的作用比依普黄酮弱。这 与文献报道的依普黄酮刺激成骨细胞分泌胶原的作用相一致。
[基金项目]国家自然科学基金资助项目(39770905).
, 百拇医药
[作者简介]张巧艳(1965-)，女(汉族)，博士生，主管药师.
[参 考 文 献]
[1] 中华人民共和国药典委员会编. 中华人民共和国药典.1995年版，一 部[M]. 广州：广东科技出版社，1995. 276.
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, 百拇医药
[4] 刘祖德，臧鸿声，欧阳跃平. 新生大鼠颅骨成骨性细胞体外生长过程研究[J ]. 解剖学报，1995，26(2)：157-159.
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[6] Owen TA, Aronow M, Shaloub V, et al. Progressive development of r at osteoblast phenotype in vitro reciprocal relationship in expression of ge nes associated with osteoblast proliferation and differentiation during formatio n of bone extracellular matrix[J]. J Cell Physiol，1990，143(3): 420-430.
[收稿日期] 2000-05-31
[修回日期] 2000-07-24, 百拇医药