病毒性心肌炎患者血白细胞中肠道病毒的检测及意义
作者：杨笛 耿茜 方五旺 张寄南 马文珠
单位：(210029 南京医科大学第一附属医院心内科、心血管病研究所)
关键词：套式PCR；肠道病毒RNA；病毒性心肌炎；肌钙蛋白I
江苏医药001004 【摘要】 目的 建立肠道病毒(EVs)检测方法，探讨EVs感染与心肌损伤的关系。方法 用套式逆转录聚合酶链反应(nPCR)方法，对225例临床拟诊病毒性心肌炎(VMC)患者血白细胞中EVsRNA进行检测，并用ELISA方法检测患者血清心肌肌钙蛋白I(cTnI)。结果 46例EVs-RNA阳性，检出率为20.4%；13例正常对照均阴性。EVs-RNA阳性患者血清cTnI水平(13.3±12.3ng/ml)略高于EVs-RNA阴性患者血清cTnI水平(11.6±13.7ng/ml)。14例EVs-RNA阳性患者随访4个月，血清cTnI水平从19.7±9.8ng/ml增至32.0±8.5ng/ml，呈明显增高趋势。结论 nPCR方法是检测EVs感染的可靠方法。EVs-RNA的存在可能是心肌炎不良愈后的指标之一。
, 百拇医药
Significance of enteroviral RNA detection by nested PCR in white blood cell of patients with viral myocarditis
YANG Di GENG Qian FANG Wuwang et al.
(Resarch Institute of Cardiovascular Disease，First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029)
【Abstract】 Objective To develop a method through molecular biology for having diagnostic evidence of enteroviral RNA from biological samples.Methods The method of nested polymerase-chain reaction (nPCR) was used to determine enteroviral RNA in white blood cell from patients with a tentative diagnosis of viral myocarditis (VMC) and normal individuals.Serum cardiac troponin I(cTnI) was also detected by ELISA.Results Positive enteroviral RNA was obtained in 46 of 225(20.4%)patients and none in normal controls.cTnI as slightly higher in EVs positive patients than that in EVs negative patients.Afler four months follow-up，cTnI tended to increase significantly from 19.7±9.8ng/ml to 32.0±8.5ng/ml in 14 patients that were enteroviral RNA positive.Conclusion The results suggest that nPCR is a useful method for diagnosing VMC.The presence of enteroviral RNA may be an adverse prognostic indicator of clinical outcome in patients with myocarditis.
, 百拇医药
【Key words】 Nested PCR Enteroviral RNA Viral myocarditis Cardiac troponin I
肠道病毒(EVs)是临床VMC的主要病原体，50%以上的病例是由EVs感染引起的。获得病毒感染的直接证据，对VMC的临床诊断有重要价值，也是长期困扰临床医生的难题。传统的病毒检测方法如中和抗体测定和病毒分离阳性率低、非特异性高，对诊断EVs感染作用有限。本文应用nPCR法检测临床拟诊心肌炎患者外周血白细胞中EVs-RNA，旨在建立一种快速、敏感、特异的EVs感染检测方法，为临床诊断VMC提供病原学依据。同时检测患者cTnI，探讨EVs感染与心肌损伤的关系。
材料与方法
一、对象和标本：1997年2月～2000年2月，我院心内科门诊和住院225例拟诊VMC患者，男109例，女116例，平均年龄30.9±14.1(7～59)岁；正常人13例，采血时无呼吸道、肠道疾患及心血管病史；均采集外周静脉血。
, 百拇医药
二、柯萨奇B3病毒株(CVB3)，10-4TCID50。
三、RNA提取：低渗法分离白细胞，参照异硫氰酸胍一步法提取白细胞RNA和CVB3RNA。
四、扩增引物：位于EVs-RNA 5’端高度保守区[1](表1)，P1与P4作为外层引物，P2与P3作为内层引物，由上海细胞生物研究所合成。
表1 肠道病毒引物 引物
序列(5’—3’)
位置
P1
CGG TGG CTG CGT TGG CGG CC
, 百拇医药
354—373
P2
GGC CCC TGA ATG CGG CTA AT
451—470
P3
AAA CAC GGA CAC CCA AAG TA
561—544
P4
ATTGTGACCATAAGCAGCCA
599—580
五、EVs-RNA检测：用美国Promega公司AMV逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA，用外层引物进行第一次扩增，94℃变性40秒，53℃退火60秒，72℃延伸60秒，扩增32个循环，再延伸反应5分钟。以第一次扩增产物为模板，用内层引物进行第二次扩增，94℃变性40秒，55℃退火60秒，72℃延伸60秒，扩增30个循环，再延伸反应5分钟，2%琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果。每次检测均以CVB3病毒株为阳性对照，无RNase水为阴性对照。
, 百拇医药
六、扩增敏感性检测：将CVB3 RNA梯度稀释至10-5倍，同时逆转录、扩增，电泳分析结果。
七、cTnI检测：用抗人cTnI单抗，ELISA法[2]测定患者血清cTnI。
八、统计学处理：数据以
±s表示，采用t检验。
结果
一、CVB3病毒株用外层引物扩增得到246bp阳性条带，再用内层引物扩增得到112bp阳性条带，阴性对照扩增结果为阴性(图1)。
图1 CVB3 RNA Nested PCR扩增产物电泳结果
, 百拇医药
1、DNA marker；2、nPCR产物；3、PCR产物；4、阴性对照
二、nPCR敏感性：用外层引物第一次扩增后，10倍稀释的CVB3 RNA可观察到246bp扩增条带；再用内层引物进行二次扩增，仍可检测到经10 000倍稀释的CVB3 RNA的112bp扩增条带(图2)。
图2 CVB3 RNA浓度梯度扩增产物电泳结果
RNA梯度：1、1；2、10-1；3、10-2；4、10-3；5、10-4；6、10-5
三、225例外周血白细胞中EVs-RNA阳性46例，检出率20.4%，正常对照13例均阴性。
, 百拇医药
四、46例EVs-RNA阳性患者血清cTnI水平13.3±12.3ng/ml，略高于179例EVs-RNA阴性者(11.6±13.7ng/ml)，无显著性差异(P>0.05)。
五、46例VMC者随访最长4个月，血清cTnI检测结果见图3。
图3 VMC患者血清cTnI随访检测 与初测值比P<0.05
讨论
本文建立nPCR方法检测EVS-RNA，结果CVB3 RNA扩增阳性，阴性对照扩增阴性，表明本文方法具有特异性。CVB3 RNA经100倍稀释，用常规单次PCR扩增阴性，而用二次扩增的nPCR扩增，CVB3 RNA经10?000倍稀释后扩增仍阳性，表明nPCR方法较常规单次PCR方法敏感性更高。用nPCR扩增，使检测的敏感性几乎达最高水平，甚至可检出单拷贝的EVs，并可同时扩增多种EVs[1]。
, 百拇医药
本文临床拟诊VMC患者外周血白细胞EVs-RNA检出率20.4%，13例正常对照均阴性，支持EVs感染在VMC发病中起重要作用的观点，同时表明本检测方法是EVs感染检测的可靠方法。
心肌中EVs-RNA的存在可导致心肌的受损。cTnI是反映心肌损伤的高敏感和高特异的生化指标[3]，心肌炎时伴有心肌损伤，血清cTnI水平升高[4]，VMC患者首次血清cTnI阳性率达55.7%[5]。本文VMC患者血清cTnI水平EVs-RNA阳性者较阴性患者升高，但无显著差异。对14例EVs-RNA阳性VMC患者随访检测发现，其血清cTnI水平呈明显增高趋势，反映心肌持续受损，提示EVs-RNA的存在进一步加重心肌损伤，可能是心肌炎不良预后的指标之一。文献报告cTnI持续升高的VMC患者症状好转缓慢，病程延长[5]；EVs持续感染，导致心肌持续损伤，是VMC发展为扩张型心肌病(DCM)的重要因素[6，7]；在cTnI升高及EVs阳性的VMC患者血清内出现M受体抗体，减少M受体数目，降低亲和力，导致M受体下调和去敏，示VMC向DCM转化[8]。因此，EVs-RNA检测对VMC的转归和预后判断有一定价值。
, 百拇医药
本文建立的人血标本EVs-RNA nPCR检测方法，具快速、简便、高敏感和高特异等特点，适用于临床EVs感染的检测，有助于VMC的早期诊断。如与血清cTnI联合检测，更有诊断价值，不仅可互相印证，还可根据cTnI和EVs感染持续时间，初步判断VMC的转归。
基金项目：国家“九五”攻关基金(96-906-02-13)、江苏省科委社会发展基金(BS97028与BS98039)及江苏省卫生厅项目(H9701)
参考文献
1，Severini GC，Mestroni N，Falaschi A，et al.Nested polymerase chain reaction for high-sensitivity detection of enetrovial RNA in biological samples.J Clin Microbiol，1993，31：1345-1349.
, http://www.100md.com
2，张寄南，杨国平，苏恩本，等.血清肌钙蛋白Ⅰ诊断急性心肌梗塞的研究.中华心血管病杂志，1997，25：379-382.
3，Hamm CW，Katus HA.New biochemical markers for myocardial cell injury.Curr Opin Cardiol，1995，10：335.
4，Smith SC，Ladenson JK，Mason JW，et al.Elevations of cardiac troponin I associated with myocarditis：experimental and clinical correlates.Circulation，1997，95：163-168.
5，张寄南，苏恩本，魏瑾，等.血清肌钙蛋白Ⅰ升高与病毒性心肌炎诊断与病程关系探讨.中华心血管病杂志，1999，27：421-424.
, 百拇医药
6，Andredletti L，Umlarft F，Weyer K，et al.Detection of enteroviral RNA by polymerase chain reaction in endomyocardial tissue of patients with chronic cardiac diseases.J Med Virol，1996，48：53-59.
7，Satch M，Tamura G，Segawa L，et al.Enterovirus persistence and myocardial damage detected by 111Inmonoclonal antimyosin antibodies in patients with dilated cardiomyopathy.Rur Heart J，1996，17，545-549.
8，苏恩本，杨笛，王晖，等.病毒性心肌炎与扩张型心肌病心肌血清抗M受体抗体研究.中华心血管病杂志，1998，26：18-20.
收稿：2000-06-12
修回：2000-06-20, http://www.100md.com
单位：(210029 南京医科大学第一附属医院心内科、心血管病研究所)
关键词：套式PCR；肠道病毒RNA；病毒性心肌炎；肌钙蛋白I
江苏医药001004 【摘要】 目的 建立肠道病毒(EVs)检测方法，探讨EVs感染与心肌损伤的关系。方法 用套式逆转录聚合酶链反应(nPCR)方法，对225例临床拟诊病毒性心肌炎(VMC)患者血白细胞中EVsRNA进行检测，并用ELISA方法检测患者血清心肌肌钙蛋白I(cTnI)。结果 46例EVs-RNA阳性，检出率为20.4%；13例正常对照均阴性。EVs-RNA阳性患者血清cTnI水平(13.3±12.3ng/ml)略高于EVs-RNA阴性患者血清cTnI水平(11.6±13.7ng/ml)。14例EVs-RNA阳性患者随访4个月，血清cTnI水平从19.7±9.8ng/ml增至32.0±8.5ng/ml，呈明显增高趋势。结论 nPCR方法是检测EVs感染的可靠方法。EVs-RNA的存在可能是心肌炎不良愈后的指标之一。
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Significance of enteroviral RNA detection by nested PCR in white blood cell of patients with viral myocarditis
YANG Di GENG Qian FANG Wuwang et al.
(Resarch Institute of Cardiovascular Disease，First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029)
【Abstract】 Objective To develop a method through molecular biology for having diagnostic evidence of enteroviral RNA from biological samples.Methods The method of nested polymerase-chain reaction (nPCR) was used to determine enteroviral RNA in white blood cell from patients with a tentative diagnosis of viral myocarditis (VMC) and normal individuals.Serum cardiac troponin I(cTnI) was also detected by ELISA.Results Positive enteroviral RNA was obtained in 46 of 225(20.4%)patients and none in normal controls.cTnI as slightly higher in EVs positive patients than that in EVs negative patients.Afler four months follow-up，cTnI tended to increase significantly from 19.7±9.8ng/ml to 32.0±8.5ng/ml in 14 patients that were enteroviral RNA positive.Conclusion The results suggest that nPCR is a useful method for diagnosing VMC.The presence of enteroviral RNA may be an adverse prognostic indicator of clinical outcome in patients with myocarditis.
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【Key words】 Nested PCR Enteroviral RNA Viral myocarditis Cardiac troponin I
肠道病毒(EVs)是临床VMC的主要病原体，50%以上的病例是由EVs感染引起的。获得病毒感染的直接证据，对VMC的临床诊断有重要价值，也是长期困扰临床医生的难题。传统的病毒检测方法如中和抗体测定和病毒分离阳性率低、非特异性高，对诊断EVs感染作用有限。本文应用nPCR法检测临床拟诊心肌炎患者外周血白细胞中EVs-RNA，旨在建立一种快速、敏感、特异的EVs感染检测方法，为临床诊断VMC提供病原学依据。同时检测患者cTnI，探讨EVs感染与心肌损伤的关系。
材料与方法
一、对象和标本：1997年2月～2000年2月，我院心内科门诊和住院225例拟诊VMC患者，男109例，女116例，平均年龄30.9±14.1(7～59)岁；正常人13例，采血时无呼吸道、肠道疾患及心血管病史；均采集外周静脉血。
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二、柯萨奇B3病毒株(CVB3)，10-4TCID50。
三、RNA提取：低渗法分离白细胞，参照异硫氰酸胍一步法提取白细胞RNA和CVB3RNA。
四、扩增引物：位于EVs-RNA 5’端高度保守区[1](表1)，P1与P4作为外层引物，P2与P3作为内层引物，由上海细胞生物研究所合成。
表1 肠道病毒引物 引物
序列(5’—3’)
位置
P1
CGG TGG CTG CGT TGG CGG CC
, 百拇医药
354—373
P2
GGC CCC TGA ATG CGG CTA AT
451—470
P3
AAA CAC GGA CAC CCA AAG TA
561—544
P4
ATTGTGACCATAAGCAGCCA
599—580
五、EVs-RNA检测：用美国Promega公司AMV逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA，用外层引物进行第一次扩增，94℃变性40秒，53℃退火60秒，72℃延伸60秒，扩增32个循环，再延伸反应5分钟。以第一次扩增产物为模板，用内层引物进行第二次扩增，94℃变性40秒，55℃退火60秒，72℃延伸60秒，扩增30个循环，再延伸反应5分钟，2%琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果。每次检测均以CVB3病毒株为阳性对照，无RNase水为阴性对照。
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六、扩增敏感性检测：将CVB3 RNA梯度稀释至10-5倍，同时逆转录、扩增，电泳分析结果。
七、cTnI检测：用抗人cTnI单抗，ELISA法[2]测定患者血清cTnI。
八、统计学处理：数据以
±s表示，采用t检验。结果
一、CVB3病毒株用外层引物扩增得到246bp阳性条带，再用内层引物扩增得到112bp阳性条带，阴性对照扩增结果为阴性(图1)。
图1 CVB3 RNA Nested PCR扩增产物电泳结果
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1、DNA marker；2、nPCR产物；3、PCR产物；4、阴性对照
二、nPCR敏感性：用外层引物第一次扩增后，10倍稀释的CVB3 RNA可观察到246bp扩增条带；再用内层引物进行二次扩增，仍可检测到经10 000倍稀释的CVB3 RNA的112bp扩增条带(图2)。
图2 CVB3 RNA浓度梯度扩增产物电泳结果
RNA梯度：1、1；2、10-1；3、10-2；4、10-3；5、10-4；6、10-5
三、225例外周血白细胞中EVs-RNA阳性46例，检出率20.4%，正常对照13例均阴性。
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四、46例EVs-RNA阳性患者血清cTnI水平13.3±12.3ng/ml，略高于179例EVs-RNA阴性者(11.6±13.7ng/ml)，无显著性差异(P>0.05)。
五、46例VMC者随访最长4个月，血清cTnI检测结果见图3。
图3 VMC患者血清cTnI随访检测 与初测值比P<0.05
讨论
本文建立nPCR方法检测EVS-RNA，结果CVB3 RNA扩增阳性，阴性对照扩增阴性，表明本文方法具有特异性。CVB3 RNA经100倍稀释，用常规单次PCR扩增阴性，而用二次扩增的nPCR扩增，CVB3 RNA经10?000倍稀释后扩增仍阳性，表明nPCR方法较常规单次PCR方法敏感性更高。用nPCR扩增，使检测的敏感性几乎达最高水平，甚至可检出单拷贝的EVs，并可同时扩增多种EVs[1]。
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本文临床拟诊VMC患者外周血白细胞EVs-RNA检出率20.4%，13例正常对照均阴性，支持EVs感染在VMC发病中起重要作用的观点，同时表明本检测方法是EVs感染检测的可靠方法。
心肌中EVs-RNA的存在可导致心肌的受损。cTnI是反映心肌损伤的高敏感和高特异的生化指标[3]，心肌炎时伴有心肌损伤，血清cTnI水平升高[4]，VMC患者首次血清cTnI阳性率达55.7%[5]。本文VMC患者血清cTnI水平EVs-RNA阳性者较阴性患者升高，但无显著差异。对14例EVs-RNA阳性VMC患者随访检测发现，其血清cTnI水平呈明显增高趋势，反映心肌持续受损，提示EVs-RNA的存在进一步加重心肌损伤，可能是心肌炎不良预后的指标之一。文献报告cTnI持续升高的VMC患者症状好转缓慢，病程延长[5]；EVs持续感染，导致心肌持续损伤，是VMC发展为扩张型心肌病(DCM)的重要因素[6，7]；在cTnI升高及EVs阳性的VMC患者血清内出现M受体抗体，减少M受体数目，降低亲和力，导致M受体下调和去敏，示VMC向DCM转化[8]。因此，EVs-RNA检测对VMC的转归和预后判断有一定价值。
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本文建立的人血标本EVs-RNA nPCR检测方法，具快速、简便、高敏感和高特异等特点，适用于临床EVs感染的检测，有助于VMC的早期诊断。如与血清cTnI联合检测，更有诊断价值，不仅可互相印证，还可根据cTnI和EVs感染持续时间，初步判断VMC的转归。
基金项目：国家“九五”攻关基金(96-906-02-13)、江苏省科委社会发展基金(BS97028与BS98039)及江苏省卫生厅项目(H9701)
参考文献
1，Severini GC，Mestroni N，Falaschi A，et al.Nested polymerase chain reaction for high-sensitivity detection of enetrovial RNA in biological samples.J Clin Microbiol，1993，31：1345-1349.
, http://www.100md.com
2，张寄南，杨国平，苏恩本，等.血清肌钙蛋白Ⅰ诊断急性心肌梗塞的研究.中华心血管病杂志，1997，25：379-382.
3，Hamm CW，Katus HA.New biochemical markers for myocardial cell injury.Curr Opin Cardiol，1995，10：335.
4，Smith SC，Ladenson JK，Mason JW，et al.Elevations of cardiac troponin I associated with myocarditis：experimental and clinical correlates.Circulation，1997，95：163-168.
5，张寄南，苏恩本，魏瑾，等.血清肌钙蛋白Ⅰ升高与病毒性心肌炎诊断与病程关系探讨.中华心血管病杂志，1999，27：421-424.
, 百拇医药
6，Andredletti L，Umlarft F，Weyer K，et al.Detection of enteroviral RNA by polymerase chain reaction in endomyocardial tissue of patients with chronic cardiac diseases.J Med Virol，1996，48：53-59.
7，Satch M，Tamura G，Segawa L，et al.Enterovirus persistence and myocardial damage detected by 111Inmonoclonal antimyosin antibodies in patients with dilated cardiomyopathy.Rur Heart J，1996，17，545-549.
8，苏恩本，杨笛，王晖，等.病毒性心肌炎与扩张型心肌病心肌血清抗M受体抗体研究.中华心血管病杂志，1998，26：18-20.
收稿：2000-06-12
修回：2000-06-20, http://www.100md.com