猪耳廓软骨细胞外分泌基质的检测
作者：李宇 王传家 吴利标 许红权
单位：(汕头大学医学院第一附属医院整形外科 515031)
关键词：组织工程；软骨细胞；糖胺多糖
广东医学001007
【摘要】目的 通过体外传代培养猪耳廓软骨细胞，并连续检测软骨细胞形成外分泌基质的能力，寻找出最适宜接种的种子细胞。方法 通过Ⅱ型胶原酶消化法获得高活性的软骨细胞，定量接种6×106个细胞于培养皿，每周传代1次，连续5周，留取所有培养液用阿利新蓝法测定软骨细胞外分泌基质糖胺多糖(GAG)；利用光镜观察原代及传代软骨细胞的生长情况。结果 第1，2，3，4，5周软骨细胞外分泌基质GAG平均含量分别为：612，1235，1462，1138和710 μg。结论 体外培养的第2代软骨细胞功能和活性最佳，传代第2周是最佳接种时间。
, 百拇医药
Glycosaminoglycan secretion in porcine auricle chondrocytes culture
Li Yu,Wang Chuanjia,Wu Libiao,et al.
(Department of Plastic Surgery,First Affiliated Hospital,Medical College,Shantou University,Shantou 515031)
【Abstract】Objective To determine the optimal time of cultured chondrocytes for innoculation by quantitating the secretion of glycosaminoglycan(GAG).Methods Chondrocytes were cultured in plate(6×106 cells) and passed on each week,for 5 consecutive weeks.Secretion of GAG was determined by DMS- GAG colorimetry assay from week 1 to weekr 5.Results The average GAG was 612,1235,1462,1138 and 710 μg respectively from week 1 to week 5.Conclusion GAG synthesized by cultured chondrocytes increases significantly at week 3,and decreases after week 4.Cultured chondrocytes were most active during week 2,optimal of innoculation.
, 百拇医药
【Key words】Tissue engineering Chondrocyte Glycosaminoglycan
组织工程化软骨形成的重要条件之一，就是获得一定数量的、保持一定功能活性的软骨细胞。然而，软骨细胞属于增生能力极弱的终末分化细胞，在体外培养过程中，经过一段时间后，细胞极易老化，从而丧失分泌基质的功能，因此，对体外培养软骨细胞分泌的外分泌基质进行连续定量检测，有助于筛选、优化种子细胞，找到体外培养的软骨细胞接种于生物支架的最佳时间。
1 材料与方法
1.1 猪耳廓软骨细胞的提取 在无菌操作下，切下满月小猪(雌雄不限，贵州香猪)耳廓，仔细剥离皮肤和软骨膜，用眼科剪将软骨组织剪成2～3 mm大小的方块，置于离心管中，氯霉素冲洗液冲洗3次，再以磷酸盐缓冲盐水冲洗2遍，加入2倍于软骨体积的0.15%Ⅱ型胶原酶(Sigma公司),在37℃恒温振荡器内消化。12～18 h后软骨碎片完全溶解，细胞从基质中释放出来。经过滤、漂洗、计数制成细胞悬液。
, 百拇医药
1.2 软骨细胞的原代培养[1，2] 将软骨细胞悬液密度调整至6×106/ml，以1 ml分别接种于塑料培养皿，加入6 ml培养液(F-12培养液加10%胎牛血清)，置入37℃恒温培养箱(5% CO2)培养。
1.3 软骨细胞传代培养 细胞生长增殖形成单层细胞后，镜下观察80%汇合，即进行传代。经清洗、消化、过滤、离心收集，用血细胞计数板计数，Hams F-12培养液稀释为6×106/ml，以1 ml分别接种到培养皿内，加入6 ml培养液,置于37℃恒温培养箱(5% CO2)内培养，倒置显微镜下观察细胞形态及活力。
1.4 软骨细胞外分泌基质GAG的定量检测 阿利新蓝法(Alcian Blue)[3,4]测定培养液中GAG 含量。定量接种6×106个细胞于培养皿，每周传代1次，留取所有培养液进行检测。吸1 ml培养液，加入1.5%阿利新蓝溶液1.5 ml，室温放置10 min，480 nm比色，根据标准曲线求得样本GAG含量。
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2 结果
2.1 倒置显微镜观察软骨细胞生长情况 对刚分离的原代及传代细胞在倒置显微镜下观察。晃动培养皿，细胞不再随培养液移动时所需时间为贴壁时间。细胞从圆形到伸出伪足呈多边形为细胞伸展时间。刚分离出的软骨细胞呈圆形，有较强折光性。贴壁时间平均10 h，延伸时间约24 h，7 d左右形成单层细胞，细胞排列紧密，呈多角形。传代后，软骨细胞贴壁时间平均3 h，延伸时间约7 h。连续培养至第6周，见细胞形态向成纤维细胞型转化，呈梭形，细胞间隙变大，轮廓增强，胞浆内可见空泡、脂滴，增殖速度减慢。
2.2 软骨细胞外分泌基质GAG含量测定 第1，2，3，4，5周软骨细胞外分泌基质GAG平均含量分别为：612，1 235，1 462，1 138和710 μg。表明体外培养的软骨细胞从第2周开始大量合成糖胺多糖类基质，4周后合成GAG含量开始降低，软骨细胞功能和活力减退。
3 讨论
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细胞外基质(ECM)是细胞附着的基本框架和代谢场所，是维持细胞正常生存、分化和运动的外环境。软骨细胞分泌ECM的主要分为3类：胶原类，以Ⅱ型胶原为主，是维持组织强度的来源；蛋白多糖类，主要为酸性糖胺多糖(GAG)，包括硫酸软骨素、硫酸角质素和肝素；结构糖蛋白，如纤维粘连蛋白。其中GAG是软骨主要的细胞外基质。以上各成分具有活跃的生理功能，它们积极参与细胞粘附、运动和分化等功能，可作为软骨细胞体外培养功能鉴定的主要指标。
软骨创伤后的修复甚为困难，因为软骨细胞属于增生能力极弱的终末细胞，缺乏再生能力。组织受损后，其周围正常软骨细胞不能迅速增生，产生新的基质来修复。实验表明经离体消化获得的软骨细胞却能够在体外合适的环境中分裂、增生，分泌细胞外基质。软骨细胞的体外培养、扩增，保持功能活性是组织工程化软骨形成的重要条件之一。确定体外培养过程中形成大量有活性的软骨细胞的最佳时相，是组织工程化软骨修复软骨缺损的关键。
阿利新蓝- GAG比色法是一种较好的测定细胞外基质中GAG含量的方法，其基本原理：GAG可溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，形成GAG-DMS复合物，测定光吸收定量。本实验通过对体外软骨细胞所分泌基质连续定量检测，动态观察体外培养的软骨细胞的功能活性，发现第2代传代细胞分泌GAG的能力最强。 通过对体外培养的软骨细胞分泌的GAG的定量、连续检测，表明软骨细胞在体外能分裂、增生和分泌基质，可动态观察体外培养的软骨细胞的功能活性，为组织工程化软骨修复软骨缺损提供最佳的细胞来源。
, 百拇医药
软骨细胞在体外培养期间仍保持高度功能活性的最佳接种浓度和最佳接种时间是值得研究的课题。本实验发现，传代的第2周(第2代的猪软骨细胞)是最佳接种时间。不难看出，要获得大量的软骨细胞需要切取大块的软骨组织，不符合组织工程化软骨修复软骨缺损的要求和目的。如何促进软骨细胞的生长，减慢软骨细胞衰老的速度，是组织工程化软骨修复软骨缺损亟待解决的问题。随着对细胞因子、生长因子及转基因技术研究的深入，必将使组织工程化软骨修复软骨缺损的应用产生革命性的变化。
参考文献
1，李 宇,吴利标,许建衡，等.猪耳廓软骨细胞体外培养.广东医学,1999,20(11):827
2，鄂 征，主编.组织培养和分子细胞学技术.第2版.北京:北京出版社,1997.87～88
3，Goldberg RL,Kolibas LM.An improved method for determing proteglycans synthesized by chondrocytes in culture.Connect Tissue Res,1990,24:265
4，刘秉慈.细胞外基质成分的实验技术.见：方福德,周 吕,丁 濂等，主编.现代医学实验技巧全书(上册).北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社 ,1995.679～692
(收稿日期：2000-03-10), 百拇医药
单位：(汕头大学医学院第一附属医院整形外科 515031)
关键词：组织工程；软骨细胞；糖胺多糖
广东医学001007
【摘要】目的 通过体外传代培养猪耳廓软骨细胞，并连续检测软骨细胞形成外分泌基质的能力，寻找出最适宜接种的种子细胞。方法 通过Ⅱ型胶原酶消化法获得高活性的软骨细胞，定量接种6×106个细胞于培养皿，每周传代1次，连续5周，留取所有培养液用阿利新蓝法测定软骨细胞外分泌基质糖胺多糖(GAG)；利用光镜观察原代及传代软骨细胞的生长情况。结果 第1，2，3，4，5周软骨细胞外分泌基质GAG平均含量分别为：612，1235，1462，1138和710 μg。结论 体外培养的第2代软骨细胞功能和活性最佳，传代第2周是最佳接种时间。
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Glycosaminoglycan secretion in porcine auricle chondrocytes culture
Li Yu,Wang Chuanjia,Wu Libiao,et al.
(Department of Plastic Surgery,First Affiliated Hospital,Medical College,Shantou University,Shantou 515031)
【Abstract】Objective To determine the optimal time of cultured chondrocytes for innoculation by quantitating the secretion of glycosaminoglycan(GAG).Methods Chondrocytes were cultured in plate(6×106 cells) and passed on each week,for 5 consecutive weeks.Secretion of GAG was determined by DMS- GAG colorimetry assay from week 1 to weekr 5.Results The average GAG was 612,1235,1462,1138 and 710 μg respectively from week 1 to week 5.Conclusion GAG synthesized by cultured chondrocytes increases significantly at week 3,and decreases after week 4.Cultured chondrocytes were most active during week 2,optimal of innoculation.
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【Key words】Tissue engineering Chondrocyte Glycosaminoglycan
组织工程化软骨形成的重要条件之一，就是获得一定数量的、保持一定功能活性的软骨细胞。然而，软骨细胞属于增生能力极弱的终末分化细胞，在体外培养过程中，经过一段时间后，细胞极易老化，从而丧失分泌基质的功能，因此，对体外培养软骨细胞分泌的外分泌基质进行连续定量检测，有助于筛选、优化种子细胞，找到体外培养的软骨细胞接种于生物支架的最佳时间。
1 材料与方法
1.1 猪耳廓软骨细胞的提取 在无菌操作下，切下满月小猪(雌雄不限，贵州香猪)耳廓，仔细剥离皮肤和软骨膜，用眼科剪将软骨组织剪成2～3 mm大小的方块，置于离心管中，氯霉素冲洗液冲洗3次，再以磷酸盐缓冲盐水冲洗2遍，加入2倍于软骨体积的0.15%Ⅱ型胶原酶(Sigma公司),在37℃恒温振荡器内消化。12～18 h后软骨碎片完全溶解，细胞从基质中释放出来。经过滤、漂洗、计数制成细胞悬液。
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1.2 软骨细胞的原代培养[1，2] 将软骨细胞悬液密度调整至6×106/ml，以1 ml分别接种于塑料培养皿，加入6 ml培养液(F-12培养液加10%胎牛血清)，置入37℃恒温培养箱(5% CO2)培养。
1.3 软骨细胞传代培养 细胞生长增殖形成单层细胞后，镜下观察80%汇合，即进行传代。经清洗、消化、过滤、离心收集，用血细胞计数板计数，Hams F-12培养液稀释为6×106/ml，以1 ml分别接种到培养皿内，加入6 ml培养液,置于37℃恒温培养箱(5% CO2)内培养，倒置显微镜下观察细胞形态及活力。
1.4 软骨细胞外分泌基质GAG的定量检测 阿利新蓝法(Alcian Blue)[3,4]测定培养液中GAG 含量。定量接种6×106个细胞于培养皿，每周传代1次，留取所有培养液进行检测。吸1 ml培养液，加入1.5%阿利新蓝溶液1.5 ml，室温放置10 min，480 nm比色，根据标准曲线求得样本GAG含量。
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2 结果
2.1 倒置显微镜观察软骨细胞生长情况 对刚分离的原代及传代细胞在倒置显微镜下观察。晃动培养皿，细胞不再随培养液移动时所需时间为贴壁时间。细胞从圆形到伸出伪足呈多边形为细胞伸展时间。刚分离出的软骨细胞呈圆形，有较强折光性。贴壁时间平均10 h，延伸时间约24 h，7 d左右形成单层细胞，细胞排列紧密，呈多角形。传代后，软骨细胞贴壁时间平均3 h，延伸时间约7 h。连续培养至第6周，见细胞形态向成纤维细胞型转化，呈梭形，细胞间隙变大，轮廓增强，胞浆内可见空泡、脂滴，增殖速度减慢。
2.2 软骨细胞外分泌基质GAG含量测定 第1，2，3，4，5周软骨细胞外分泌基质GAG平均含量分别为：612，1 235，1 462，1 138和710 μg。表明体外培养的软骨细胞从第2周开始大量合成糖胺多糖类基质，4周后合成GAG含量开始降低，软骨细胞功能和活力减退。
3 讨论
, 百拇医药
细胞外基质(ECM)是细胞附着的基本框架和代谢场所，是维持细胞正常生存、分化和运动的外环境。软骨细胞分泌ECM的主要分为3类：胶原类，以Ⅱ型胶原为主，是维持组织强度的来源；蛋白多糖类，主要为酸性糖胺多糖(GAG)，包括硫酸软骨素、硫酸角质素和肝素；结构糖蛋白，如纤维粘连蛋白。其中GAG是软骨主要的细胞外基质。以上各成分具有活跃的生理功能，它们积极参与细胞粘附、运动和分化等功能，可作为软骨细胞体外培养功能鉴定的主要指标。
软骨创伤后的修复甚为困难，因为软骨细胞属于增生能力极弱的终末细胞，缺乏再生能力。组织受损后，其周围正常软骨细胞不能迅速增生，产生新的基质来修复。实验表明经离体消化获得的软骨细胞却能够在体外合适的环境中分裂、增生，分泌细胞外基质。软骨细胞的体外培养、扩增，保持功能活性是组织工程化软骨形成的重要条件之一。确定体外培养过程中形成大量有活性的软骨细胞的最佳时相，是组织工程化软骨修复软骨缺损的关键。
阿利新蓝- GAG比色法是一种较好的测定细胞外基质中GAG含量的方法，其基本原理：GAG可溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，形成GAG-DMS复合物，测定光吸收定量。本实验通过对体外软骨细胞所分泌基质连续定量检测，动态观察体外培养的软骨细胞的功能活性，发现第2代传代细胞分泌GAG的能力最强。 通过对体外培养的软骨细胞分泌的GAG的定量、连续检测，表明软骨细胞在体外能分裂、增生和分泌基质，可动态观察体外培养的软骨细胞的功能活性，为组织工程化软骨修复软骨缺损提供最佳的细胞来源。
, 百拇医药
软骨细胞在体外培养期间仍保持高度功能活性的最佳接种浓度和最佳接种时间是值得研究的课题。本实验发现，传代的第2周(第2代的猪软骨细胞)是最佳接种时间。不难看出，要获得大量的软骨细胞需要切取大块的软骨组织，不符合组织工程化软骨修复软骨缺损的要求和目的。如何促进软骨细胞的生长，减慢软骨细胞衰老的速度，是组织工程化软骨修复软骨缺损亟待解决的问题。随着对细胞因子、生长因子及转基因技术研究的深入，必将使组织工程化软骨修复软骨缺损的应用产生革命性的变化。
参考文献
1，李 宇,吴利标,许建衡，等.猪耳廓软骨细胞体外培养.广东医学,1999,20(11):827
2，鄂 征，主编.组织培养和分子细胞学技术.第2版.北京:北京出版社,1997.87～88
3，Goldberg RL,Kolibas LM.An improved method for determing proteglycans synthesized by chondrocytes in culture.Connect Tissue Res,1990,24:265
4，刘秉慈.细胞外基质成分的实验技术.见：方福德,周 吕,丁 濂等，主编.现代医学实验技巧全书(上册).北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社 ,1995.679～692
(收稿日期：2000-03-10), 百拇医药