荧光定量聚合酶链反应与分支链DNA信号扩增法检测血清HBV DNA的比较
作者：袁静 马为民 周伯平 徐六妹 王火生 John S Tam
单位：袁静 马为民 周伯平 徐六妹 王火生(广东省深圳市肝病研究所 518020)；John S Tam(香港中文大学微生物系)
关键词：乙型肝炎病毒核酸；荧光定量聚合酶链反应；分支链DNA信号扩增法
广东医学001013
【摘要】目的 了解荧光定量聚合酶链反应(PCR)法与分支链DNA信号扩增(bDNA)法在检测血清中HBV DNA含量上的优缺点。方法 分别用这两种方法平行检测44份乙型肝炎患者的血清标本，并与定性PCR检测结果比较。同时用荧光定量PCR法观察15例乙肝患者干扰素治疗期间HBV DNA含量变化。结果 ①荧光定量PCR法和bDNA法比较，
前者测出的HBV DNA含量均值为(3.50×105±33.6) copies/μl；后者为(3.07×105±12.9) copies/μl，两者比较差异无显著性(P>0.05)。
前者的HBV DNA阳性率79.5%；后者及常规PCR定性法均为59.1%。荧光定量PCR法的阳性检出率显著高于bDNA法及常规定性PCR法(P<0.05)。②15例中 5例获完全应答的乙型肝炎患者其血清HBV DNA含量在治疗16周内均逐渐下降至完全转阴。结论 荧光定量PCR法与bDNA法在检测血清HBV DNA含量上,结果大多一致，且敏感性强，检验也较简便、价廉，并能较好评价和检测乙肝患者抗病毒疗效,宜于临床推广。
, 百拇医药
The comparison between the amplisensor quantitative PCR assay and the branched-DNA signal-amplification assay in detecting HBV DNA in serum
Yuan Jing,Ma Weimin,Zhou Boping,et al.
(Shenzhen Research Institute of Hepatology,Shenzhen 518020)
【Abstract】Objective To compare the amplisensor quantitative PCR assay with the branched-DNA signal-amplification assay in detecting HBV DNA in clinic.Methods Sera from 44 hepatitis B patients were measured by the two assays and also by qualitative PCR assay.Data from these three assays were compared.In addition,the changes of HBV DNA quantitative value in 15 hepatitis B patients with Interferon therapy were studied.Results ①The data of HBV DNA quantitative value measured by these two methods had no significant difference.②The HBV DNA positive rate of the amplisensor quantitative PCR assay is much higher than that of both the bDNA assay and the HBV DNA qualitative assay.③ The HBV DNA quantitative value in 5 patients (5/15) declined gradually and became negative within 16 weeks of interferon therapy.Conclusions Compared with the bDNA assay,the amplisensor quantitative PCR assay is more sensitive,reliable,simpler and cheaper,and is therefore more useful to evaluate the effect of anti-viral therapy.
, 百拇医药
【Key words】HBV DNA The amplisensor quantitative PCR assay The branched-DNA signal amplification assay
乙型肝炎病毒感染的病原诊断及抗病毒疗效判断主要依赖于血清特异性抗原抗体和HBV DNA的检测。聚合酶链反应(PCR)是检测乙型肝炎病毒DNA的最敏感技术。应用荧光定量PCR技术检测病毒基因水平，国内外已有报道[1，2]。为了考核该法的可靠性和实用性，本文分别用荧光定量PCR法和分支链DNA信号扩增法(bDNA)两种方法，平行检测了44份乙肝患者血清标本，以比较二者的敏感性、特异性以及在临床应用上的优缺点。
1 材料与方法
1.1 血清标本来源 44份血清标本均取自1998～1999年我院门诊及住院的乙型肝炎患者。其中，男27例，女17例；平均年龄(26.9±9.6)岁。所选病例均符合1995年北京全国第五届传染病与寄生虫病会议修订的诊断标准。
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1.2 血清标本的采集 采用灭菌的一次性带盖塑料管，清晨空腹抽取静脉血5 ml，离心分离血清，-30℃冻存备用，集中检测。
1.3 方法
1.3.1 荧光定量PCR检测HBV DNA含量 采用美国Biotronic公司AG9600Amplisensor Assay系统，按照试剂盒说明书操作程序进行检测。①HBV DNA提取：血清100 μl加裂解液125μl，水浴后离心。②不对称扩增：取上清液5 μl，加入不对称扩增反应液10μl(含不对称扩增引物，dNTPs,Taq酶及PCR缓冲液)，扩增22个循环，循环参数为95℃，25 s；60℃，25 s；72℃，30 s；最后延伸1 min。③信号扩增：加入信号扩增混合液(含信号扩增引物及PCR反应缓冲液)5 μl，然后按上述参数进行PCR扩增。④使用AG-9600荧光DNA分析检测仪，并根据纯化HBV DNA建立的直线回归方程，直接作HBV DNA定量分析和数据读取。
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1.3.2 分支链DNA信号扩增法检测HBV DNA含量 采用美国Chiron公司提供的QuantiplexTMHBV DNA Assay(bDNA)试剂盒，严格按说明书操作程序进行检测。①HBV DNA提取并与捕获探针，靶探针的杂交。向表面覆盖有捕获探针的微孔板中每孔加入10μl裂解液和10μl血清，水浴后迅速加入10μl靶探针反应液；水浴30 min后加入10μl中和反应液，水浴16～20 h。②与分支链DNA及酶标记探针杂交。加入含有分支链DNA的扩增反应液40μl，水浴后洗涤，再加入酶标记探针反应液40μl，水浴，洗涤。加入显色底物30μl，然后在荧光测量仪上37℃，25 min。③使用QuantiplexTMHBV DNA Assay的荧光测量仪，作数据读取和HBV DNA定量分析。
1.3.3 质量监控 每次实验荧光定量PCR法各设阳性、阴性、空白及最大信号对照各两孔，bDNA法各设阳性对照、阴性对照和阳性控制。每份标本均作双孔检测，两孔结果相符取均值计算，若两孔结果不符即重做。并严格参照Kwok等[4]提出的防污染措施进行实验操作。
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1.3.4 定性PCR检测HBV DNA ①Taq DNA聚合酶由华美公司提供，dNTPs购自Promega公司。②引物为HBV C区序列，引物B1为5′-ACT GTT CAA GCC TCC AAG CT-3′(nt1832-1851),B2为5′-AGG AGT GCG AAT CCA CAC TC-3′(nt2241-2260),扩增产物429bp，委托上海生物工程公司合成。
1.3.5 HBV-markers的检测 采用美国ABBOTT公司提供的IMX EIA系统，严格按试剂盒说明书操作程序进行检测。
1.4 统计学方法 本组测定资料结果采用χ2检验和t检验。
2 结果
2.1 荧光定量PCR法与bDNA法对44份血清HBV DNA定量测定结果 荧光定量PCR法测定的HBV DNA含量均值为(3.50×105±33.6) copies/μl;而bDNA法为(3.07×105±12.9)copies/μl;二者比较差异无显著性(t=0.1263,P>0.25)。
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2.2 3种方法检测HBV DNA的阳性率比较 荧光定量PCR法的HBV DNA阳性率明显高于bDNA法及定性PCR法，而bDNA法与定性PCR法的HBV DNA阳性率大致相同(P>0.05)。见表1。
表1 3种方法检测HBV DNA阳性率比较 组别
合计例数
HBV-DNA阳性数
阳性率(%)
荧光定量PCR法
44
35
80
bDNA法
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44
26
59
定性PCR法
44
26
59△
*与荧光定量PCR法比较，χ2=4.33,P<0.05;△与bDNA法比较，χ2=0，P>0.05
2.3 血清HBV DNA含量与干扰素疗效关系 见图1。
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图1 5例干扰素治疗有效者HBV DNA含量动态变化
在干扰素治疗期间，用荧光定量PCR法动态检测15例乙肝患者血清HBV DNA含量变化，结果显示：5例(33%)在治疗4周左右HBV DNA含量逐渐下降，在16周内HBV DNA全部转阴，其ALT也降到正常，并一直维持正常。另10例患者(67%)在16周内HBV DNA含量无明显变化。
3 讨论
乙型肝炎病毒(HBV)感染的病原诊断主要依赖于血清特异性抗原、抗体和HBV DNA的检测，而外周血中HBV DNA是病毒复制最直接和可靠的标志。因此，定量检测外周血中HBV DNA含量对于监测病情，评价乙肝患者抗病毒疗效具有重要临床意义。本文用荧光定量PCR及bDNA法平行检测44份乙肝患者血清标本，同时作定性PCR检测。另外，对其中17份血标本按美国Abbott公司提供的IMX系统进行HBV-markers检测，以了解荧光定量PCR法在临床应用中的可行性。
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结果显示，荧光定量PCR法与bDNA法在检测HBV DNA含量时，两者的结果差异无显著性 ；而且，检测HBV DNA阳性率荧光定量PCR法(80%)也显著高于bDNA法(59%)与定性PCR法(59%)(P<0.05)。本文结果说明，荧光定量PCR法可应用于临床HBV DNA含量的检测，而且灵敏度明显高于bDNA法 ,这与文献报道是一致的。分析其原因，可能是由于前者将模板DNA进行了套式PCR扩增[2]。而bDNA实质是一种三明治式杂交法，其并未将模板DNA进行PCR扩增[3]。
对干扰素治疗期间血清中HBV DNA含量进行动态监测，结果显示，5例干扰素治疗有效者HBV DNA含量在16周内逐渐下降到完全阴转；而另10例干扰素无效者HBV DNA含量在16周内无明显变化。提示用荧光定量PCR法动态监测HBV DNA水平，有助于临床上评价和监测抗病毒疗效。这与文献报道一致[2]。
综上所述，荧光定量PCR法在检测血清中HBV DNA含量上较bDNA法敏感性强，特异性相当，且相对检验较简便、价廉，更有利于临床上通过HBV DNA水平的改变来评价和监测抗病毒疗效，宜于临床推广。但目前两种方法的检测步骤都太复杂，检测结果有极少数差异较大，本次实验的血清标本数还太少，这些都有待于进一步的探索和研究。
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参考文献
1，Hagiwara H,Hayashi N,Mita E,et al.Quantitative analysis of hepatitis C virus RNA in serum during interferon alfa therapy.Gastroenterology，1993,104:877
2，张复春，吴婉芬，董惠卿，等.定量聚合酶链反应检测血清中HBV DNA及其临床应用.中华传染病杂志，1997,15:24
3，黄呈辉，刘德恭，汪俊韬.HBV DNA定量检测及临床应用的研究进展.国外医学流行病学与传染病学分册，1996,23:154
(收稿日期：2000-01-25), http://www.100md.com
单位：袁静 马为民 周伯平 徐六妹 王火生(广东省深圳市肝病研究所 518020)；John S Tam(香港中文大学微生物系)
关键词：乙型肝炎病毒核酸；荧光定量聚合酶链反应；分支链DNA信号扩增法
广东医学001013
【摘要】目的 了解荧光定量聚合酶链反应(PCR)法与分支链DNA信号扩增(bDNA)法在检测血清中HBV DNA含量上的优缺点。方法 分别用这两种方法平行检测44份乙型肝炎患者的血清标本，并与定性PCR检测结果比较。同时用荧光定量PCR法观察15例乙肝患者干扰素治疗期间HBV DNA含量变化。结果 ①荧光定量PCR法和bDNA法比较，
前者测出的HBV DNA含量均值为(3.50×105±33.6) copies/μl；后者为(3.07×105±12.9) copies/μl，两者比较差异无显著性(P>0.05)。前者的HBV DNA阳性率79.5%；后者及常规PCR定性法均为59.1%。荧光定量PCR法的阳性检出率显著高于bDNA法及常规定性PCR法(P<0.05)。②15例中 5例获完全应答的乙型肝炎患者其血清HBV DNA含量在治疗16周内均逐渐下降至完全转阴。结论 荧光定量PCR法与bDNA法在检测血清HBV DNA含量上,结果大多一致，且敏感性强，检验也较简便、价廉，并能较好评价和检测乙肝患者抗病毒疗效,宜于临床推广。, 百拇医药
The comparison between the amplisensor quantitative PCR assay and the branched-DNA signal-amplification assay in detecting HBV DNA in serum
Yuan Jing,Ma Weimin,Zhou Boping,et al.
(Shenzhen Research Institute of Hepatology,Shenzhen 518020)
【Abstract】Objective To compare the amplisensor quantitative PCR assay with the branched-DNA signal-amplification assay in detecting HBV DNA in clinic.Methods Sera from 44 hepatitis B patients were measured by the two assays and also by qualitative PCR assay.Data from these three assays were compared.In addition,the changes of HBV DNA quantitative value in 15 hepatitis B patients with Interferon therapy were studied.Results ①The data of HBV DNA quantitative value measured by these two methods had no significant difference.②The HBV DNA positive rate of the amplisensor quantitative PCR assay is much higher than that of both the bDNA assay and the HBV DNA qualitative assay.③ The HBV DNA quantitative value in 5 patients (5/15) declined gradually and became negative within 16 weeks of interferon therapy.Conclusions Compared with the bDNA assay,the amplisensor quantitative PCR assay is more sensitive,reliable,simpler and cheaper,and is therefore more useful to evaluate the effect of anti-viral therapy.
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【Key words】HBV DNA The amplisensor quantitative PCR assay The branched-DNA signal amplification assay
乙型肝炎病毒感染的病原诊断及抗病毒疗效判断主要依赖于血清特异性抗原抗体和HBV DNA的检测。聚合酶链反应(PCR)是检测乙型肝炎病毒DNA的最敏感技术。应用荧光定量PCR技术检测病毒基因水平，国内外已有报道[1，2]。为了考核该法的可靠性和实用性，本文分别用荧光定量PCR法和分支链DNA信号扩增法(bDNA)两种方法，平行检测了44份乙肝患者血清标本，以比较二者的敏感性、特异性以及在临床应用上的优缺点。
1 材料与方法
1.1 血清标本来源 44份血清标本均取自1998～1999年我院门诊及住院的乙型肝炎患者。其中，男27例，女17例；平均年龄(26.9±9.6)岁。所选病例均符合1995年北京全国第五届传染病与寄生虫病会议修订的诊断标准。
, 百拇医药
1.2 血清标本的采集 采用灭菌的一次性带盖塑料管，清晨空腹抽取静脉血5 ml，离心分离血清，-30℃冻存备用，集中检测。
1.3 方法
1.3.1 荧光定量PCR检测HBV DNA含量 采用美国Biotronic公司AG9600Amplisensor Assay系统，按照试剂盒说明书操作程序进行检测。①HBV DNA提取：血清100 μl加裂解液125μl，水浴后离心。②不对称扩增：取上清液5 μl，加入不对称扩增反应液10μl(含不对称扩增引物，dNTPs,Taq酶及PCR缓冲液)，扩增22个循环，循环参数为95℃，25 s；60℃，25 s；72℃，30 s；最后延伸1 min。③信号扩增：加入信号扩增混合液(含信号扩增引物及PCR反应缓冲液)5 μl，然后按上述参数进行PCR扩增。④使用AG-9600荧光DNA分析检测仪，并根据纯化HBV DNA建立的直线回归方程，直接作HBV DNA定量分析和数据读取。
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1.3.2 分支链DNA信号扩增法检测HBV DNA含量 采用美国Chiron公司提供的QuantiplexTMHBV DNA Assay(bDNA)试剂盒，严格按说明书操作程序进行检测。①HBV DNA提取并与捕获探针，靶探针的杂交。向表面覆盖有捕获探针的微孔板中每孔加入10μl裂解液和10μl血清，水浴后迅速加入10μl靶探针反应液；水浴30 min后加入10μl中和反应液，水浴16～20 h。②与分支链DNA及酶标记探针杂交。加入含有分支链DNA的扩增反应液40μl，水浴后洗涤，再加入酶标记探针反应液40μl，水浴，洗涤。加入显色底物30μl，然后在荧光测量仪上37℃，25 min。③使用QuantiplexTMHBV DNA Assay的荧光测量仪，作数据读取和HBV DNA定量分析。
1.3.3 质量监控 每次实验荧光定量PCR法各设阳性、阴性、空白及最大信号对照各两孔，bDNA法各设阳性对照、阴性对照和阳性控制。每份标本均作双孔检测，两孔结果相符取均值计算，若两孔结果不符即重做。并严格参照Kwok等[4]提出的防污染措施进行实验操作。
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1.3.4 定性PCR检测HBV DNA ①Taq DNA聚合酶由华美公司提供，dNTPs购自Promega公司。②引物为HBV C区序列，引物B1为5′-ACT GTT CAA GCC TCC AAG CT-3′(nt1832-1851),B2为5′-AGG AGT GCG AAT CCA CAC TC-3′(nt2241-2260),扩增产物429bp，委托上海生物工程公司合成。
1.3.5 HBV-markers的检测 采用美国ABBOTT公司提供的IMX EIA系统，严格按试剂盒说明书操作程序进行检测。
1.4 统计学方法 本组测定资料结果采用χ2检验和t检验。
2 结果
2.1 荧光定量PCR法与bDNA法对44份血清HBV DNA定量测定结果 荧光定量PCR法测定的HBV DNA含量均值为(3.50×105±33.6) copies/μl;而bDNA法为(3.07×105±12.9)copies/μl;二者比较差异无显著性(t=0.1263,P>0.25)。
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2.2 3种方法检测HBV DNA的阳性率比较 荧光定量PCR法的HBV DNA阳性率明显高于bDNA法及定性PCR法，而bDNA法与定性PCR法的HBV DNA阳性率大致相同(P>0.05)。见表1。
表1 3种方法检测HBV DNA阳性率比较 组别
合计例数
HBV-DNA阳性数
阳性率(%)
荧光定量PCR法
44
35
80
bDNA法
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44
26
59
定性PCR法
44
26
59△
*与荧光定量PCR法比较，χ2=4.33,P<0.05;△与bDNA法比较，χ2=0，P>0.05
2.3 血清HBV DNA含量与干扰素疗效关系 见图1。
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图1 5例干扰素治疗有效者HBV DNA含量动态变化
在干扰素治疗期间，用荧光定量PCR法动态检测15例乙肝患者血清HBV DNA含量变化，结果显示：5例(33%)在治疗4周左右HBV DNA含量逐渐下降，在16周内HBV DNA全部转阴，其ALT也降到正常，并一直维持正常。另10例患者(67%)在16周内HBV DNA含量无明显变化。
3 讨论
乙型肝炎病毒(HBV)感染的病原诊断主要依赖于血清特异性抗原、抗体和HBV DNA的检测，而外周血中HBV DNA是病毒复制最直接和可靠的标志。因此，定量检测外周血中HBV DNA含量对于监测病情，评价乙肝患者抗病毒疗效具有重要临床意义。本文用荧光定量PCR及bDNA法平行检测44份乙肝患者血清标本，同时作定性PCR检测。另外，对其中17份血标本按美国Abbott公司提供的IMX系统进行HBV-markers检测，以了解荧光定量PCR法在临床应用中的可行性。
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结果显示，荧光定量PCR法与bDNA法在检测HBV DNA含量时，两者的结果差异无显著性 ；而且，检测HBV DNA阳性率荧光定量PCR法(80%)也显著高于bDNA法(59%)与定性PCR法(59%)(P<0.05)。本文结果说明，荧光定量PCR法可应用于临床HBV DNA含量的检测，而且灵敏度明显高于bDNA法 ,这与文献报道是一致的。分析其原因，可能是由于前者将模板DNA进行了套式PCR扩增[2]。而bDNA实质是一种三明治式杂交法，其并未将模板DNA进行PCR扩增[3]。
对干扰素治疗期间血清中HBV DNA含量进行动态监测，结果显示，5例干扰素治疗有效者HBV DNA含量在16周内逐渐下降到完全阴转；而另10例干扰素无效者HBV DNA含量在16周内无明显变化。提示用荧光定量PCR法动态监测HBV DNA水平，有助于临床上评价和监测抗病毒疗效。这与文献报道一致[2]。
综上所述，荧光定量PCR法在检测血清中HBV DNA含量上较bDNA法敏感性强，特异性相当，且相对检验较简便、价廉，更有利于临床上通过HBV DNA水平的改变来评价和监测抗病毒疗效，宜于临床推广。但目前两种方法的检测步骤都太复杂，检测结果有极少数差异较大，本次实验的血清标本数还太少，这些都有待于进一步的探索和研究。
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参考文献
1，Hagiwara H,Hayashi N,Mita E,et al.Quantitative analysis of hepatitis C virus RNA in serum during interferon alfa therapy.Gastroenterology，1993,104:877
2，张复春，吴婉芬，董惠卿，等.定量聚合酶链反应检测血清中HBV DNA及其临床应用.中华传染病杂志，1997,15:24
3，黄呈辉，刘德恭，汪俊韬.HBV DNA定量检测及临床应用的研究进展.国外医学流行病学与传染病学分册，1996,23:154
(收稿日期：2000-01-25), http://www.100md.com