水飞蓟宾对大鼠肝贮脂细胞HSC-T6增殖和胶原合成的影响

http://www.100md.com 《第二军医大学学报》 2000年第10期

     作者：张珉 张俊平 王杰松 周斌 郭澄 谢渭芬 张纯 钱定华

    单位：张珉(第二军医大学药学院生化药学教研室，上海 200433)；张俊平(第二军医大学药学院生化药学教研室，上海 200433)；王杰松(第二军医大学药学院生化药学教研室，上海 200433)；周斌(第二军医大学药学院生化药学教研室，上海 200433)；郭澄(长征医院药学部) 谢渭芬(消化内科) 张纯(长征医院药学部)；钱定华(第二军医大学药学院生化药学教研室，上海 200433)

    关键词：水飞蓟宾；贮脂细胞；增殖；胶原合成

    第二军医大学学报001009 [摘要] 目的：观察水飞蓟宾对大鼠肝贮 脂细胞HSC-T6增殖和胶原合成的影响，探讨其保护肝脏及抗硬化机制。方法：采用结晶紫染色法测定细胞增殖，³H-脯氨酸掺入法测定胶原合成。结 果：水飞蓟宾(6.25～50 μg/ml)以浓度依赖方式抑制血清、巨噬细胞条件培 养液以及血小板源生长因子或转化生长因子β₁诱导的细胞增殖和胶原合成。结 论：抑制贮脂细胞增殖和胶原合成可能是水飞蓟宾保护肝脏抗硬化机制之一。

    [中图分类号] R 285.5 [文献标识码] A

    [文章编号] 0258-879X(2000)10-0932-03

    Effects of silibinin on proliferation and collagen synthesis of hepatic stellate cells， HSC-T6 in rats

    ZHANG Min, ZHANG Jun-Ping, WANG Jie-Song, ZHOU Bin,QIAN Ding-Hua

    (Department of Biochemical Pharmacy, College of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)

    GUO Cheng,ZHANG Chun

    (Department of Pharmacy, Changzheng Hospital)

    XIE Wei-Fen

    (Department of Gas troenterology)

    [ABSTRACT] Objective:To study the hepato-protective and anti fibrotic properties of silibinin, and its effects on proliferation and collagen synthesis of immortalized rat hepatic stellate cell line, HSC-T6 cells. Methods: Cell proliferation was measured by cristal violet staining as sa y. Collagen synthesis was determined by ³ H-proline incorporation. Results: Silibinin (6.25-50 μg/ml) concentration-dependentl y reduced the increase of cell proliferation and collagen synthesis of HSC-T6 cells stimulated by serum, macrophage conditioned medium and cytokines platelet -derived growth factor or transforming growth factor β₁. Conclusion: Inhibition of hepatic stellate cell proliferation and collagen synthesi s may be one important mechanism of hepatoprotective and antifibrotic properties of silibinin.

    [KEY WORDS]silibinin; hepatic stellate cell s; proliferation; collagen synthesis

    肝纤维化是各型肝病所共有的病理特征，是肝硬化的中间环节。在肝纤维化发生、发展 过程中，肝贮脂细胞(hepatic stellate cells)起着重要作用。肝贮脂细胞的过度增殖，大 量合成胶原等细胞外基质与纤维化肝脏中细胞外基质的过度沉积密切相关^[1]。水 飞蓟宾为天然的黄酮木脂素类化合物，对急慢性肝炎和肝硬化有较好的疗效^[2]。 为了解水飞蓟宾保肝抗硬化机制，我们以大鼠肝贮脂细胞HSC-T6^[3]为靶细胞，选 择血清、巨噬细胞条件培养液(macrophage conditioned medium, MCM)和血小板源生长因子 (PDGF)或转化生长因子β₁(TGFβ₁)等刺激因素，观察水飞蓟宾对HSC-T6细胞增殖和胶 原合成的影响。

    1 材料和方法

    1.1 药品和试剂 水飞蓟宾由朝晖药厂提供(含量96%；mp.167～168℃)，用二甲 亚砜(DMSO)配制成50 mg/ml，实验时用DMEM培养液稀释至所需浓度。PDGF和TGFβ₁为Sigm a公司产品。³H-脯氨酸为中科院北京原子能研究所产品。结晶紫及其他化学试剂均为分 析纯国产试剂。

    1.2 细胞与培养 大鼠肝贮脂细胞HSC-T6细胞由Friedman SL博士提供。细胞用 含有10%新生小牛血清(NCS，杭州四季青生物工程材料研究所)的DMEM培养液(Gibco产品)传 代培养。

    1.3 巨噬细胞条件培养液的制备 参照文献[4]，ICR小鼠腹腔巨噬细胞先后用 卡西霉素1 μmol/L和脂多糖100 μg/L刺激培养，然后用PBS洗涤3次，再用DMEM培养液孵育 24 h，收集细胞上清-30℃贮存备用。

    1.4 HSC-T6细胞增殖实验 96孔细胞培养板每孔加入1×10⁴个HSC-T6细胞， 在37℃ 5% CO₂孵箱中孵育24 h，然后加入100 μl含有不同药物浓度和10% NCS的DMEM培 养液或无药培养液(含最大药物浓度时的溶剂量)，继续培养48 h后结晶紫染色法测定吸光度 值D(595)。试验PDGF或巨噬细胞条件培养液(MCM)对细胞增殖的影响，则将细胞培养上 清液弃去，加入含0.5% NCS的培养液孵育48 h，然后加入药物与PDGF或MCM，再孵育24 h, 最后测定D(595) ^[5] 。

    1.5 HSC-T6胶原合成的测定 采用³H-脯氨酸同位素法。将细胞密度调整为2. 5×10⁵个/ml，在96孔板上每孔加100 μl，培养24 h使之形成单层。然后加入含50 μg/m l维生素C，药物与10% NCS或MCM或TGFβ₁再培养48 h，同时加入每孔³H-脯氨酸18.5 kBq。细胞用胰酶消化后，收集于玻璃纤维滤纸上，用液闪仪测定细胞³H-脯氨酸掺入值 。

    1.6 统计学处理 采用t检验判断差异的显著性。

    2 结 果

    2.1 水飞蓟宾对血清促HSC -T6细胞增殖和胶原合成的影响 与HSC-T6共同培养48 h, 水飞蓟宾25，50 μg/ ml能显著地抑制10%的NCS刺激的HSC-T6细胞增殖，其抑制率分别为29%和53%。在消除了 增殖的影响因素下，水飞蓟宾与HSC-T6细胞作用48 h，可浓度依赖地抑制血清促细胞胶原 合成作用(表1)。 表 1 水飞蓟宾对血清刺激的HSC-T6

    细胞增殖和胶原合成的影响

    Tab 1 Effect of silibinin on serum stimulated HSC-T6

    cell proliferation and collagen synthesis(±s) Group

    Proliferation[n=6, D(595)]

    Collagen synthesis

    (n=3, A/Bq)

    Control^a

    1.00±0.05

    163±24

    Silibinin(ρ_B/μg^.ml^-1)

    6.25

    0.98±0.11

    137±29

    12.5

    0.92±0.12

    102±28^*

    25.0

    0.71±0.05^**

    85±14^**

    50.0

    0.47±0.08^**

    80±26<sup>**

    a</sup> With the highest concentration of DMSO; ^* P<0.05,^**P<0.01 vs control

    2.2 水飞蓟宾对MCM促HSC-T6细胞增殖和胶原合成的影响 DMSO与MCM稀释比为1 ∶4同HSC-T6细胞作用，MCM可显著促进细胞增殖和胶原合成，增加百分率分别为37.8%和10 6.1% (P<0.01)。水飞蓟宾与MCM(1∶4)同时加入细胞，呈浓度依赖性地减少MCM促H SC-T6细胞增殖和胶原合成的作用，水飞蓟宾25 μg/ml分别抑制MCM促增殖和胶原合成50% 和91.0%，50 μg/ml时则完全抑制MCM的作用(表2)。

    表 2 水飞蓟宾对巨噬细胞条件培养液刺激

    的HSC-T6细胞增殖和胶原合成的影响

    Tab 2 Effect of silibinin on macrophage conditioned

    medium(MCM) stimulated HSC-T6 cell proliferation

    and collagen synthesis(±s) Group

    Proliferation[n=6, D(595)]

    Collagen synthesis

    (n=3, A/Bq)

    DMEM^a

    0.74±0.01

    532± 22

    Control^b

    1.02±0.01^**

    1 095±213^**

    Silibinin(ρ_B/μg^.ml^-1)

    6.25

    0.96±0.11

    1 032±142

    12.5

    0.90±0.13

    814± 33

    25.0

    0.88±0.13^△

    582± 14^△

    50.0

    0.74±0.06^△△

    392± 9<sup>△△

    a</sup> With 0.5 % NCS； ^b With the highest concentration o f DMSO and MCM (1∶4); ^** P<0.01 vs DMEM； ^△ P<0.05； ^△△ P<0.01 vs control

    2.3 水飞蓟宾对PDGF促HSC-T6细胞增殖和TGFβ₁促 胶原合成的影响 PDGF 10 ng/ml能显著促进HSC-T6细胞增殖，增殖率为42.86% 。TGFβ₁ 2 ng/ml能增加细胞胶原合成86.1% (P<0.01)。水飞蓟宾能浓度依赖地抑制 PDGF和TGFβ₁的作用，25 μg/ml可完全抑制PDGF的促增殖作用，抑制TGFβ₁促胶原合 成作用92.6%，50 μg/ml则完全抑制(表3)。

    3 讨 论

    肝纤维化的主要表现为贮脂细胞的大量增殖和细胞外基质的过度合成。现已证实，肝贮脂细 胞是细胞外基质的主要产生细胞。本实验以激活的永生型大鼠肝贮脂细胞HSC-T6为靶细胞 ，选择血清、MCM和细胞因子PDGF或TGFβ₁ 3种不同的刺激因素，观察水飞蓟宾体外抗肝 纤维化作用。实验结果表明：水飞蓟宾一方面能显著抑制血清、MCM和PDGF促肝贮 脂细胞增殖作用，另一方面还能显著抑制血清、MCM和TGFβ₁促胶原合成作用。提示 这些作用可能是水飞蓟宾保 肝抗硬化的作用机制之一。贮脂细胞活化、增殖以及合成各种细胞外基质成分受到多种因 素的影响。血清中含有大 量的生物活性物质，活化的单核、巨噬细胞能释放多种促纤维化细胞因子，如PDGF，TGFβ ₁，TNF，FGF，EGF，IL-1，IL-6等，其中PDGF，TGFβ₁是两个最重要的促纤维化因子 。PDGF显著促进激活的肝贮脂细胞增殖，TGFβ₁则刺激过度合成胶原^[6,7]。在 细胞增殖实验中，25 μg/ml水飞蓟宾可完全抑制PDGF的作用，抑制MCM和血清的促增殖作用 达50%和29%。在胶原合成实验中，25 μg/ml水飞蓟宾分别抑制TGFβ₁，MCM、血清促胶原 合成作用92.6%，91.0%和47.6%, 说明水飞蓟宾主要是通过抑制细胞因子PDGF和TGFβ 1起作用。

    表 3 水飞蓟宾对血小板源生长因子促HSC-T6细胞

    增殖和转化生长因子β₁促胶原合成的影响

    Tab 3 Effect of silibinin on HSC-T6 cell proliferation

    stimulated by PDGF and collagen synthesis

    stimulated by TGFβ₁(±s) Group

    Proliferation[n=6, D(595)]

    Collagen synthesis

    (n=3, A/Bq)

    DMEM^a

    0.63±0.03

    195±13Control^b

    

    0.90±0.07^**

    355±37^**

    Silibinin(ρ_B/μg*ml^-1)

    6.25

    0.87±0.07

    361±19

    12.5

    0.77±0.11^△△

    251±18^△△

    25.0

    0.64±0.06^△△

    206± 5^△△

    50.0

    0.44±0.04^△△

    167±10<sup>△△

    a</sup> With 0.5 % NCS； ^b With the highest concentration o f DMSO and PDGF(10 ng/ml) or TGFβ₁(2 ng/ml); ^** P<0.01 vs DMEM； ^△△ P<0.01 vs control 水飞蓟宾具有很强的抗氧化作用，其抗氧化作用是否与抑制肝贮脂细胞增殖和胶原合成有关 尚不清楚。文献报道氧化应激能刺激肝贮脂细胞增殖和胶原合成。Garcia-Trevijano等 [8]报道TGFβ₁能诱导贮脂细胞内过氧化氢蓄积，上调α(Ⅰ)原胶原基因表 达，认为TGFβ₁诱导α(Ⅰ)原胶原基因表达是通过过氧化氢依赖途径。氧自由基主要通过 细胞色素P4502E1(CYP2E1)产生。Nieto等^[9]报道CYP2E1介导了氧化应激诱导的贮 脂细胞α₂(Ⅰ)原胶原基因表达。因此，值得进一步探讨水飞蓟宾与氧化应激的关系。

    [基金项目] 国家自然科学基金资助项目(39670837).

    [作者简介] 张珉(1972-)，女(汉族)，博士生.

    [参 考 文 献]

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    [4] 田 鸣，张俊平，钱定华，等. 蛋白激酶C抑制剂和钙调素抑制剂对小鼠腹腔巨 噬细胞释放肿瘤坏死因子的抑制作用 [J]. 中国药理学报，1993，14(5):447-449.

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    [8] Garcia-Trevijano ER, Iraburu MJ, Fontana L, et al. Transforming growth factor beta 1 induces the expression of alpha 1 (Ⅰ) procollagen mRN A by a hydrogen peroxide-C/EBP beta-dependent mechanism in rat hepatic st ellate cells [J]. Hepatology, 1999 , 29(3): 960-970.

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    [收稿日期] 2000-06-01

    [修回日期] 2000-09-10

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