普罗布考对过氧化氢诱导平滑肌细胞增殖的影响
普罗布考对过氧化氢诱导平滑肌细胞增殖的影响
顾江涛 吴宗贵 沈茜 徐玉莲
摘 要 目的:探讨普罗布考(Probucol) 对H2O2诱导的平滑肌细胞(SMCs) 增殖的抑制作用。方法:采用细胞计数法和3H-TdR掺入法观察0.1～100 μmol/L Probucol对新生牛血清(NCS)和过氧化氢(H2O2)促SMCs增殖的抑制作用。结果:10 μmol/L及100 μmol/L Probucol作用96 h，可抑制10%NCS刺激的SMCs增殖；而1,10 及100 μmol/L Probucol作用72 h及96 h，均明显抑制10 μmol/L H2O2刺激的SMCs增殖，且呈浓度依赖性(P<0.05,P<0.01)。结论:Probucol抑制NCS，H2O2刺激下体外培养的SMCs增殖，提示其对于动脉粥样硬化和经皮腔内冠状动脉成形术后再狭窄的防治可能具有应用前景。
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关键词：普罗布考；平滑肌细胞；增殖
动脉血管平滑肌细胞(SMCs)增殖是引起动脉粥样硬化(AS)和经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)后再狭窄(RS)病变的重要机制之一[1]。寻找有效抑制SMCs增殖的药物是AS，RS防治研究中的一项重要课题。氧化活性物质刺激是AS，RS形成的重要病因之一。血管内皮细胞代谢以及一系列内皮源性因子释放的生理过程将产生高浓度的氧化活性物质。当局部血管损伤后，氧化活性物质浓度也明显升高[2]。过氧化氢(H2O2)可作为氧化活性物质代表，实验发现H2O2诱导人和鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)内血管内皮生长因子(VEGF)mRNA呈剂量依赖性表达增高。在人AS病损及动物球囊损伤模型中，可检测到病变局部及新生内膜处VEGF比对照组表达增高4倍以上[3]。抗氧化剂普罗布考(Probucol)是一种有效、新型的调节血脂和抗AS药。近几年国外研究发现此药可能可以抑制PTCA术后RS，此结论还需进一步实验证实，其发生机制也有待进一步研究[4]。本研究旨在探讨Probucol对SMCs增殖的影响，以期揭示Probucol在AS，RS防治中的某些作用机制，并支持其临床应用。
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1 材料和方法
1.1 主要实验用品 RPMI 1640培养液、新生牛血清(NCS)：Gibco公司产品。 Probucol标准品：相对分子质量:516.16,承德普宁制药厂，用时溶于二甲基亚砜(DMSO，德国Merck公司产品)，DMSO终浓度低于0.1%[5]。H2O2：分析纯，上海桃浦化工厂产品，含量不低于30%。胰蛋白酶：Difco进口分装；3H-胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR)：上海原子能研究所，放射比活度：1.11×1 014 Bq/mmol，总活度：3.7×109 Bq。SMC抗体：兔抗人平滑肌肌动蛋白(SMA)，丹麦Dako公司产品。
1.2 动脉SMCs培养[6]纯种雄性200～250 g SD大鼠(第二军医大学实验动物中心提供)，乙醚麻醉，无菌下速取主动脉胸段，按Hirata组织贴块法将中层平滑肌组织块种植入培养瓶壁，加入RPMI 1640培养液(含15% NCS，1%青链霉素)，置37℃，5% CO2孵箱内贴附，约2～5 h后，轻轻翻转培养瓶，使组织块浸入培养液中，静置培养。细胞从组织块边缘长出，3 d换新鲜培养液一次，待长成致密的细胞层，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，传代培养。SMCs的鉴定：倒置相差显微镜观察可见SMCs呈梭形，平行生长，束状排列，密集与稀疏处相互交错呈“峰谷”状；经抗SMA单抗免疫组化染色，可见染成棕黄色的阳性细胞，证实为SMCs，纯度为95%以上。实验采用3～8代细胞。细胞同步化：将培养至3～8代生长状态良好的SMCs消化后加入含10% NCS的RPMI 1640培养液制成单细胞悬液，以5×104 个/ml，100 μl/孔接种于96 孔板中，孵育24 h后换成含0.5% NCS的 RPMI 1640培养上清，培养56 h，使90%细胞静止于G0/G1期，备用。
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1.3 3H-TdR掺入法[7]测定SMCs增殖 各组细胞于终止培养前18～24 h掺入3H-TdR 3.7×106 Bq/孔，到达相应的观察时间点后终止培养，弃上清，0.25%胰酶充分消化，用多头细胞收集仪收集样品于玻璃纤维滤纸上，烘干。将收集了不同样品的滤纸分别夹入液闪瓶，加入闪烁液，在β液闪仪中测每分钟脉冲计数值(cpm)，并换算成Bq值。
1.4 细胞计数法观察SMCs的增殖情况 各组细胞到达相应的观察时间点后终止培养，经0.25%胰酶充分消化，以200 μl/孔加入培养板中，用0.01 mol/L PBS吹打成均匀的细胞悬液，采用细胞计数板计数。
1.5 Probucol对NCS促SMCs增殖作用的影响观察 实验分为(1) 对照组：10%NCS；(2)用药组：10%NCS+ Probucol，Probucol终浓度分别为0.1，1，10，100 μmol/L；(3)溶媒组：0.1% DMSO+10% NCS。采用细胞计数法和3H-TdR掺入法测定细胞增殖情况。
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1.6 Probucol对H2O2促SMCs增殖作用的影响观察 根据文献报道，适当浓度的H2O2可明显促进SMCs增殖[8]，我们在预实验中发现10 μmol/L H2O2对SMCs促增殖作用最显著，故本实验选用10 μmol/L H2O2作为刺激SMCs有效增殖的浓度。实验分为(1)对照组： 10 μmol/L H2O2；(2)用药组：10 μmol/L H2O2 + Probucol，Probucol终浓度分别为0.1，1，10，100 μmol/L；(3)溶媒组： 0.1% DMSO+2% NCS。采用细胞计数法和3H-TdR掺入法测定细胞增殖情况。
1.7 统计学处理 数据用
±s表示，组间均数比较采用SAS软件进行方差分析。
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2 结 果
2.1 Probucol对NCS促大鼠主动脉SMCs增殖作用的影响 不同浓度(0.1，1，10，100 μmol/L)Probucol作用于培养的大鼠主动脉SMCs 48，72 h后，细胞计数及3H-TdR掺入值与对照组比较均无显著性差异(P>0.05)，说明此时Probucol对10% NCS引起的SMCs增殖无明显抑制作用。而不同浓度Probucol作用96 h后， 10及100 μmol/L Probucol组细胞增殖才受到明显抑制，且呈浓度依赖关系(P<0.05，P<0.01)；由细胞计数值计算得出的细胞生长抑制率分别为(17.8±2.5)%和(22.2±1.9)%， 由3H-TdR掺入值计算得出的抑制率分别为(20.6±3.2)%和 (36.0±2.4)%。表1显示了部分结果。
2.2 Probucol对10 μmol/L H2O2促大鼠主动脉SMCs增殖作用的影响 不同浓度(0.1，1，10，100 μmol/L)Probucol作用于SMCs 48 h后，细胞计数及3H-TdR掺入值与对照组比较均无显著性差异(P>0.05)，说明此时Probucol对10 μmol/L H2O2引起的SMCs增殖无明显抑制作用。而当作用时间延长至72 及96 h时，1，10及100 μmol/L Probucol组与对照组比较细胞计数及3H-TdR掺入值均明显降低(P<0.05,P<0.01)，呈浓度依赖性(表2)。其中作用72 h后，上述3种浓度下由细胞计数值计算得出的抑制率分别为 (16.3±0.8)%,(31.5±1.4)%,(48.0±3.3)%，由3H-TdR 掺入量得出的抑制率分别为(21.4±2.6)%,(39.2±3.2)%,(67.4±4.6)%;作用96 h后由细胞计数得出的抑制率分别为(16.5±1.8)%,(29.8±2.7)%,(47.9±3.0)%，由3H-TdR掺入量得出的抑制率分别为(24.6±2.1)%,(32.8±2.9)%,(50.6±3.7)% 。
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表 1 不同时间、浓度Probucol对10%NCS促SMCs增殖作用的影响
Tab 1 Effects of Probucol on SMCs proliferfation stimulated by NCS
(n=6，±s)
Group
Cell number (×104 )
Incorporation of3H-TdR (A/Bq)
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72 h
96 h
72h
96 h
Control(10%NCS)
8.25±1.34
11.25±2.14
48.87±12.67
64.70±14.38
Probucol (cB/μmol.L-1)
0.1
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8.00±0.96
10.25±1.77
50.17±16.50
66.33±13.50
1
8.18±0.46
10.95±1.15
50.07±11.45
58.75±10.83
10
7.88±1.58
9.05±1.86*△
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47.50±9.77
51.40±13.08*△
100
8.16±1.51
7.35±1.39**△△▲▲
46.50±17.18
41.43±11.40**△△▲▲
0.1%DMSO
9.05±1.48
11.75±0.98
49.25±14.17
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61.48±16.50
*P<0.05,**P <0.01 vs control group; △P<0.05， △△P <0.01 vs 1 μmol/L Probucol group; ▲▲P<0.01 vs 10 μmol/L Probucol group表 2 不同时间、浓度Probucol对10 μmol/L H2O2促SMCs增殖作用的影响
Tab 2 Effects of Probucol on SMCs proliferfation evoked by H2O2
(n=6，±s)
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Group
Cell number(×104 )
Incorporation of 3 H-TdR (A/Bq)
48 h
72 h
96 h
48 h
72 h
96 h
A
6.15±1.30
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8.18±1.15
6.05±0.45
25.43±6.67
52.13±8.45
24.27±7.08
B
6.35±0.80
7.95±0.65
5.85±1.01
27.00±9.18
49.83±11.45
22.97±9.67
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C
6.85±1.20
6.85±1.35*△
5.05±1.00*△
28.27±10.40
48.32±5.83*△
21.43±6.06*△
D
5.96±0.65
5.60±1.70**△△
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4.25±1.55**△△
26.33±4.38
30.75±10.50 **△△
16.67±4.40**△△
E
6.05±1.15
4.25±0.75**△△▲▲
3.15±0.45**△△▲▲
25.68±6.50
18.67±4.85**△△▲▲
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12.33±3.26**△△▲▲
F
5.75±0.68
5.86±0.56
4.25±0.62
16.33±4.80
9.67±3.77
8.67±4.18
A：10 μmol/L H2O2；B：10 μmol/L H2O2 +0.1 μmol/L Probucol；C：10 μmol/L H2O2 +1 μmol/L Probucol；D：10 μmol/L H2O2 +10 μmol/L Probucol； E：10 μmol/L H2O2 +100 μmol/L Probucol ； F：0.1%DMSO +2% NCS； *P<0.05,** P <0.01 vs group A; △P<0.05,△△P <0.01 vs group B; ▲▲P <0.01 vs group D
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3 讨 论
PTCA术后RS及AS病变发生机制可能是多种因素、多条途径共同作用的结果。局部血管损伤引起炎症反应、血栓形成，氧化活性物质刺激等是AS，RS形成的病因基础。其中氧化活性物质刺激引起局部血管损伤已被认为是一个非常重要的因素，它破坏了周围环境的分子，使脂蛋白氧化变性，形成泡沫细胞。它可激活核转录因子，引起多种细胞因子、酶、粘附分子分泌，刺激早期生长信号如蛋白激酶C(PKC)活化，促进原癌基因c-fos，c-myc表达，从而促进了SMCs增殖、迁移和细胞外基质增生[9]。PTCA术后，粒细胞在血管内膜局部聚集释放大量超氧阴离子和其他氧化剂。此外，粒细胞也在血管周围外膜层聚集，这与以后血管局部瘢痕形成、血管收缩导致血管重构密切相关[2]。
Probucol是一种亲脂性抗氧化剂，具有调剂血脂，抗AS作用，动物及临床实验显示它对PTCA术后RS有明显抑制作用[3]。本研究证实Probucol对NCS和H2O2促SMCs增殖均有抑制作用，且呈浓度依赖性。由于NCS含多种生长因子和细胞增殖物质，故作用通路及机制较复杂。已有实验证实Probucol可阻止血小板源生长因子(PDGF)、白介素1(IL-1)分泌，引起血管细胞粘附分子1(VCAM-1)、单核细胞集落刺激因子(M-CSF)基因表达下调[10]。Probucol作为抗氧化剂在体内可能抑制了内源性氧化活性物质对细胞的毒性作用，抑制上述某些细胞因子的分泌，抑制了VSMCs过度增殖，这些作用是此药用于体内可能有效抑制AS，RS的基本点。随着我们对氧化活性物质在体内作用的深入认识，本研究结果显示了Probucol在抑制血管损伤后内膜增生和粥样硬化形成具有积极作用，其复杂的作用机制尚需进一步研究。
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参考文献
[1]刘凡光.血管成形术后平滑肌细胞增殖的机制[J].国外医学.心血管疾病分册,1997,24(6):10-12.
[2]Cane A,Breton M,Koumanov K,et al.Oxidant-induced arachidonic acid release and impairment of fatty acid acylation in vascular smooth muscle cells[J].Am J Physiol,1998,274(4 Pt 1):C1040-1046.
[3]Ruef JR,Hu ZY,Yin LY,et al.Induction of vascular endothelial growth factor in ballon-injured baboon arteries.A novel role for reactive oxygen species in atherosclerosis[J].Circ Res,1997,81(1):24-33.
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[4]Yokoi H,Daida H,Kuwabara Y,et al.Effectiveness of an antioxidant in preventing restenosis after percutaneous transluminal coronary angioplasty[J].J Am Coll Cardiol,1997,30(4):855-862.
[5]Akeson AL,Woods CW,Mosher LB,et al.Inhibition of IL-1β expression in THP-1 cells by Probucol and tocopherol[J].Atherosclerosis,1991,86(2-3):261-270.
[6]Hirata Y,Tarugi Y,Takata S.CGRP receptor in cultured vascular smooth muscle and endothelial cells[J].Biochem Biophys Res Commun,1988,151(3):1113-1121.
, http://www.100md.com
[7]Sun Q.Growth stimulation of 3T3 fibroblasts by cystatin[J].Exp Cell Res,1989,180(1):150-160.
[8]Herbert JM,Bono F,Savi P.The mitogenic effect of H2O2 for vascular smooth muscle cells is mediated by an increase of the affinity of basic fibroblast growth factor for its receptor[J].FEBS Letters,1996,395(1):43-47.
[9]Rao GN,Berk BC.Active oxygen species stimulate vascular smooth muscle cell growth and proto-oncogene expression[J].Circ Res,1992,70(3):593-599.
[10]Fruebis J,Gonzalez V,Silvestre M,et al.Effect of Probucol treatment on gene expression of VCAM-1,MCP-1 and M-CSF in the aotic wall of LDLreceptor-deficient rabbits during early atherogenesis[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,1997,17(7):1281-1302., 百拇医药
顾江涛 吴宗贵 沈茜 徐玉莲
摘 要 目的:探讨普罗布考(Probucol) 对H2O2诱导的平滑肌细胞(SMCs) 增殖的抑制作用。方法:采用细胞计数法和3H-TdR掺入法观察0.1～100 μmol/L Probucol对新生牛血清(NCS)和过氧化氢(H2O2)促SMCs增殖的抑制作用。结果:10 μmol/L及100 μmol/L Probucol作用96 h，可抑制10%NCS刺激的SMCs增殖；而1,10 及100 μmol/L Probucol作用72 h及96 h，均明显抑制10 μmol/L H2O2刺激的SMCs增殖，且呈浓度依赖性(P<0.05,P<0.01)。结论:Probucol抑制NCS，H2O2刺激下体外培养的SMCs增殖，提示其对于动脉粥样硬化和经皮腔内冠状动脉成形术后再狭窄的防治可能具有应用前景。
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关键词：普罗布考；平滑肌细胞；增殖
动脉血管平滑肌细胞(SMCs)增殖是引起动脉粥样硬化(AS)和经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)后再狭窄(RS)病变的重要机制之一[1]。寻找有效抑制SMCs增殖的药物是AS，RS防治研究中的一项重要课题。氧化活性物质刺激是AS，RS形成的重要病因之一。血管内皮细胞代谢以及一系列内皮源性因子释放的生理过程将产生高浓度的氧化活性物质。当局部血管损伤后，氧化活性物质浓度也明显升高[2]。过氧化氢(H2O2)可作为氧化活性物质代表，实验发现H2O2诱导人和鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)内血管内皮生长因子(VEGF)mRNA呈剂量依赖性表达增高。在人AS病损及动物球囊损伤模型中，可检测到病变局部及新生内膜处VEGF比对照组表达增高4倍以上[3]。抗氧化剂普罗布考(Probucol)是一种有效、新型的调节血脂和抗AS药。近几年国外研究发现此药可能可以抑制PTCA术后RS，此结论还需进一步实验证实，其发生机制也有待进一步研究[4]。本研究旨在探讨Probucol对SMCs增殖的影响，以期揭示Probucol在AS，RS防治中的某些作用机制，并支持其临床应用。
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1 材料和方法
1.1 主要实验用品 RPMI 1640培养液、新生牛血清(NCS)：Gibco公司产品。 Probucol标准品：相对分子质量:516.16,承德普宁制药厂，用时溶于二甲基亚砜(DMSO，德国Merck公司产品)，DMSO终浓度低于0.1%[5]。H2O2：分析纯，上海桃浦化工厂产品，含量不低于30%。胰蛋白酶：Difco进口分装；3H-胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR)：上海原子能研究所，放射比活度：1.11×1 014 Bq/mmol，总活度：3.7×109 Bq。SMC抗体：兔抗人平滑肌肌动蛋白(SMA)，丹麦Dako公司产品。
1.2 动脉SMCs培养[6]纯种雄性200～250 g SD大鼠(第二军医大学实验动物中心提供)，乙醚麻醉，无菌下速取主动脉胸段，按Hirata组织贴块法将中层平滑肌组织块种植入培养瓶壁，加入RPMI 1640培养液(含15% NCS，1%青链霉素)，置37℃，5% CO2孵箱内贴附，约2～5 h后，轻轻翻转培养瓶，使组织块浸入培养液中，静置培养。细胞从组织块边缘长出，3 d换新鲜培养液一次，待长成致密的细胞层，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，传代培养。SMCs的鉴定：倒置相差显微镜观察可见SMCs呈梭形，平行生长，束状排列，密集与稀疏处相互交错呈“峰谷”状；经抗SMA单抗免疫组化染色，可见染成棕黄色的阳性细胞，证实为SMCs，纯度为95%以上。实验采用3～8代细胞。细胞同步化：将培养至3～8代生长状态良好的SMCs消化后加入含10% NCS的RPMI 1640培养液制成单细胞悬液，以5×104 个/ml，100 μl/孔接种于96 孔板中，孵育24 h后换成含0.5% NCS的 RPMI 1640培养上清，培养56 h，使90%细胞静止于G0/G1期，备用。
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1.3 3H-TdR掺入法[7]测定SMCs增殖 各组细胞于终止培养前18～24 h掺入3H-TdR 3.7×106 Bq/孔，到达相应的观察时间点后终止培养，弃上清，0.25%胰酶充分消化，用多头细胞收集仪收集样品于玻璃纤维滤纸上，烘干。将收集了不同样品的滤纸分别夹入液闪瓶，加入闪烁液，在β液闪仪中测每分钟脉冲计数值(cpm)，并换算成Bq值。
1.4 细胞计数法观察SMCs的增殖情况 各组细胞到达相应的观察时间点后终止培养，经0.25%胰酶充分消化，以200 μl/孔加入培养板中，用0.01 mol/L PBS吹打成均匀的细胞悬液，采用细胞计数板计数。
1.5 Probucol对NCS促SMCs增殖作用的影响观察 实验分为(1) 对照组：10%NCS；(2)用药组：10%NCS+ Probucol，Probucol终浓度分别为0.1，1，10，100 μmol/L；(3)溶媒组：0.1% DMSO+10% NCS。采用细胞计数法和3H-TdR掺入法测定细胞增殖情况。
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1.6 Probucol对H2O2促SMCs增殖作用的影响观察 根据文献报道，适当浓度的H2O2可明显促进SMCs增殖[8]，我们在预实验中发现10 μmol/L H2O2对SMCs促增殖作用最显著，故本实验选用10 μmol/L H2O2作为刺激SMCs有效增殖的浓度。实验分为(1)对照组： 10 μmol/L H2O2；(2)用药组：10 μmol/L H2O2 + Probucol，Probucol终浓度分别为0.1，1，10，100 μmol/L；(3)溶媒组： 0.1% DMSO+2% NCS。采用细胞计数法和3H-TdR掺入法测定细胞增殖情况。
1.7 统计学处理 数据用
±s表示，组间均数比较采用SAS软件进行方差分析。, http://www.100md.com
2 结 果
2.1 Probucol对NCS促大鼠主动脉SMCs增殖作用的影响 不同浓度(0.1，1，10，100 μmol/L)Probucol作用于培养的大鼠主动脉SMCs 48，72 h后，细胞计数及3H-TdR掺入值与对照组比较均无显著性差异(P>0.05)，说明此时Probucol对10% NCS引起的SMCs增殖无明显抑制作用。而不同浓度Probucol作用96 h后， 10及100 μmol/L Probucol组细胞增殖才受到明显抑制，且呈浓度依赖关系(P<0.05，P<0.01)；由细胞计数值计算得出的细胞生长抑制率分别为(17.8±2.5)%和(22.2±1.9)%， 由3H-TdR掺入值计算得出的抑制率分别为(20.6±3.2)%和 (36.0±2.4)%。表1显示了部分结果。
2.2 Probucol对10 μmol/L H2O2促大鼠主动脉SMCs增殖作用的影响 不同浓度(0.1，1，10，100 μmol/L)Probucol作用于SMCs 48 h后，细胞计数及3H-TdR掺入值与对照组比较均无显著性差异(P>0.05)，说明此时Probucol对10 μmol/L H2O2引起的SMCs增殖无明显抑制作用。而当作用时间延长至72 及96 h时，1，10及100 μmol/L Probucol组与对照组比较细胞计数及3H-TdR掺入值均明显降低(P<0.05,P<0.01)，呈浓度依赖性(表2)。其中作用72 h后，上述3种浓度下由细胞计数值计算得出的抑制率分别为 (16.3±0.8)%,(31.5±1.4)%,(48.0±3.3)%，由3H-TdR 掺入量得出的抑制率分别为(21.4±2.6)%,(39.2±3.2)%,(67.4±4.6)%;作用96 h后由细胞计数得出的抑制率分别为(16.5±1.8)%,(29.8±2.7)%,(47.9±3.0)%，由3H-TdR掺入量得出的抑制率分别为(24.6±2.1)%,(32.8±2.9)%,(50.6±3.7)% 。
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表 1 不同时间、浓度Probucol对10%NCS促SMCs增殖作用的影响
Tab 1 Effects of Probucol on SMCs proliferfation stimulated by NCS
(n=6，
±s)Group
Cell number (×104 )
Incorporation of3H-TdR (A/Bq)
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72 h
96 h
72h
96 h
Control(10%NCS)
8.25±1.34
11.25±2.14
48.87±12.67
64.70±14.38
Probucol (cB/μmol.L-1)
0.1
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8.00±0.96
10.25±1.77
50.17±16.50
66.33±13.50
1
8.18±0.46
10.95±1.15
50.07±11.45
58.75±10.83
10
7.88±1.58
9.05±1.86*△
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47.50±9.77
51.40±13.08*△
100
8.16±1.51
7.35±1.39**△△▲▲
46.50±17.18
41.43±11.40**△△▲▲
0.1%DMSO
9.05±1.48
11.75±0.98
49.25±14.17
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61.48±16.50
*P<0.05,**P <0.01 vs control group; △P<0.05， △△P <0.01 vs 1 μmol/L Probucol group; ▲▲P<0.01 vs 10 μmol/L Probucol group表 2 不同时间、浓度Probucol对10 μmol/L H2O2促SMCs增殖作用的影响
Tab 2 Effects of Probucol on SMCs proliferfation evoked by H2O2
(n=6，
±s), 百拇医药
Group
Cell number(×104 )
Incorporation of 3 H-TdR (A/Bq)
48 h
72 h
96 h
48 h
72 h
96 h
A
6.15±1.30
, 百拇医药
8.18±1.15
6.05±0.45
25.43±6.67
52.13±8.45
24.27±7.08
B
6.35±0.80
7.95±0.65
5.85±1.01
27.00±9.18
49.83±11.45
22.97±9.67
, 百拇医药
C
6.85±1.20
6.85±1.35*△
5.05±1.00*△
28.27±10.40
48.32±5.83*△
21.43±6.06*△
D
5.96±0.65
5.60±1.70**△△
, 百拇医药
4.25±1.55**△△
26.33±4.38
30.75±10.50 **△△
16.67±4.40**△△
E
6.05±1.15
4.25±0.75**△△▲▲
3.15±0.45**△△▲▲
25.68±6.50
18.67±4.85**△△▲▲
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12.33±3.26**△△▲▲
F
5.75±0.68
5.86±0.56
4.25±0.62
16.33±4.80
9.67±3.77
8.67±4.18
A：10 μmol/L H2O2；B：10 μmol/L H2O2 +0.1 μmol/L Probucol；C：10 μmol/L H2O2 +1 μmol/L Probucol；D：10 μmol/L H2O2 +10 μmol/L Probucol； E：10 μmol/L H2O2 +100 μmol/L Probucol ； F：0.1%DMSO +2% NCS； *P<0.05,** P <0.01 vs group A; △P<0.05,△△P <0.01 vs group B; ▲▲P <0.01 vs group D
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3 讨 论
PTCA术后RS及AS病变发生机制可能是多种因素、多条途径共同作用的结果。局部血管损伤引起炎症反应、血栓形成，氧化活性物质刺激等是AS，RS形成的病因基础。其中氧化活性物质刺激引起局部血管损伤已被认为是一个非常重要的因素，它破坏了周围环境的分子，使脂蛋白氧化变性，形成泡沫细胞。它可激活核转录因子，引起多种细胞因子、酶、粘附分子分泌，刺激早期生长信号如蛋白激酶C(PKC)活化，促进原癌基因c-fos，c-myc表达，从而促进了SMCs增殖、迁移和细胞外基质增生[9]。PTCA术后，粒细胞在血管内膜局部聚集释放大量超氧阴离子和其他氧化剂。此外，粒细胞也在血管周围外膜层聚集，这与以后血管局部瘢痕形成、血管收缩导致血管重构密切相关[2]。
Probucol是一种亲脂性抗氧化剂，具有调剂血脂，抗AS作用，动物及临床实验显示它对PTCA术后RS有明显抑制作用[3]。本研究证实Probucol对NCS和H2O2促SMCs增殖均有抑制作用，且呈浓度依赖性。由于NCS含多种生长因子和细胞增殖物质，故作用通路及机制较复杂。已有实验证实Probucol可阻止血小板源生长因子(PDGF)、白介素1(IL-1)分泌，引起血管细胞粘附分子1(VCAM-1)、单核细胞集落刺激因子(M-CSF)基因表达下调[10]。Probucol作为抗氧化剂在体内可能抑制了内源性氧化活性物质对细胞的毒性作用，抑制上述某些细胞因子的分泌，抑制了VSMCs过度增殖，这些作用是此药用于体内可能有效抑制AS，RS的基本点。随着我们对氧化活性物质在体内作用的深入认识，本研究结果显示了Probucol在抑制血管损伤后内膜增生和粥样硬化形成具有积极作用，其复杂的作用机制尚需进一步研究。
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参考文献
[1]刘凡光.血管成形术后平滑肌细胞增殖的机制[J].国外医学.心血管疾病分册,1997,24(6):10-12.
[2]Cane A,Breton M,Koumanov K,et al.Oxidant-induced arachidonic acid release and impairment of fatty acid acylation in vascular smooth muscle cells[J].Am J Physiol,1998,274(4 Pt 1):C1040-1046.
[3]Ruef JR,Hu ZY,Yin LY,et al.Induction of vascular endothelial growth factor in ballon-injured baboon arteries.A novel role for reactive oxygen species in atherosclerosis[J].Circ Res,1997,81(1):24-33.
, 百拇医药
[4]Yokoi H,Daida H,Kuwabara Y,et al.Effectiveness of an antioxidant in preventing restenosis after percutaneous transluminal coronary angioplasty[J].J Am Coll Cardiol,1997,30(4):855-862.
[5]Akeson AL,Woods CW,Mosher LB,et al.Inhibition of IL-1β expression in THP-1 cells by Probucol and tocopherol[J].Atherosclerosis,1991,86(2-3):261-270.
[6]Hirata Y,Tarugi Y,Takata S.CGRP receptor in cultured vascular smooth muscle and endothelial cells[J].Biochem Biophys Res Commun,1988,151(3):1113-1121.
, http://www.100md.com
[7]Sun Q.Growth stimulation of 3T3 fibroblasts by cystatin[J].Exp Cell Res,1989,180(1):150-160.
[8]Herbert JM,Bono F,Savi P.The mitogenic effect of H2O2 for vascular smooth muscle cells is mediated by an increase of the affinity of basic fibroblast growth factor for its receptor[J].FEBS Letters,1996,395(1):43-47.
[9]Rao GN,Berk BC.Active oxygen species stimulate vascular smooth muscle cell growth and proto-oncogene expression[J].Circ Res,1992,70(3):593-599.
[10]Fruebis J,Gonzalez V,Silvestre M,et al.Effect of Probucol treatment on gene expression of VCAM-1,MCP-1 and M-CSF in the aotic wall of LDLreceptor-deficient rabbits during early atherogenesis[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,1997,17(7):1281-1302., 百拇医药