中国汉族人儿茶酚胺氧位甲基转移酶基因多态性
邵明 刘焯霖 陶恩祥 陈彪
关键词：儿茶酚胺氧位甲基转移酶(catechol-O-methyltransferase, COMT, EC.2.1.1.6) 基因多态性；汉族 儿茶酚胺氧位甲基转移酶(catechol-O-methyltransferase, COMT, EC.2.1.1.6)是一种在人体内广泛存在的酶，它催化儿茶酚胺第3位羟基甲基化，降解儿茶酚胺，是具有生物活性或毒性的儿茶酚胺的主要代谢酶。最近的研究发现COMT的基因第4号外显子存在一个G→A的点突变，使其编码的108位氨基酸由缬氨酸(Val)变成蛋氨酸(Met)，导致COMT酶的活性减低。我们对一组中国汉族人的COMT基因在该位点的多态性做了初步研究，并与其他种族的人群进行了对比分析。
1 材料和方法
1.1 115名健康成年汉族人来自门诊健康查体者，无遗传病家族史，无肿瘤、风湿病及神经系统疾病等。其中男性54名，女性61名，年龄40～72岁。
, 百拇医药
1.2 DNA的提取 抽静脉血10 ml，肝素抗凝，利用常规酚、氯仿抽提法提取DNA，采取紫外分光光度法将DNA稀释至500 mg/L。
1.3 多态性分析 利用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术，按文献[1]设计引物，其序列为：5′-TCGTGGACGCCGTGATTCAGG-3′；5′-AGGTCTGACAAC-GGGTCAGGC-3′。PCR的反应条件：先在95 ℃预变性2 min，再按下列温度和时间循环35次：94 ℃ 30 s；57 ℃ 30 s；72 ℃ 45 s；最后在72 ℃下延伸5 min，其PCR产物为217 bp的DNA片段。将扩增产物5 μl，加入10 U NIa Ⅲ限制性内切酶，反应体积为12 μl。在37℃水浴6 h，最后以10%聚丙酰胺凝胶电泳及EB染色。PCR产物为217 bp，在外显子4上有一恒定的NIa Ⅲ切点，切下81 bp，余下136 bp片段。野生型(G/G)无NIa Ⅲ内切酶的酶切位点，电泳显示81、136 bp两个片段，突变型(AA)
, 百拇医药
有NIa Ⅲ内切酶的酶切位点，电泳显示40、81、96 bp 3个片段，杂合子(G/A)为40、81、96、136 bp 4个片段，如图1。
图1 COMT基因4号外显子扩增产物的NIa Ⅲ酶切分析 1：pGEM-7zf(+)/Hae Ⅲ DNA标准；2、4、5、7:G/G基因型；3：A/G基因型；6、8：A/A基因型
2 结果
115名中国人汉族位点多态性频率及基因型多态性分布见表1、2。
表1 115名汉族人COMT基因多态性频率分布(n=230)
, 百拇医药 性别
染色体数
A等位基因频率
G等位基因频率
男
108
0.13 (30)
0.87( 78)
女
122
0.14 (31)
0.86( 91)
总计
, 百拇医药
230
0.27 (61)
0.73(169)
表2 115名汉族人COMT基因型频率分布(n=115)
基因型
人数
频率
G/G
60
0.52
G/A
49
, 百拇医药 0.43
A/A
6
0.05
表3 不同人种COMT基因多态性分布比较
组别
例数
基因型(频率)
染色体数
等位基因(频率)
G/G
G/A
A/A
, 百拇医药
G
A
白种人[4]
173
40 (0.23)
88 (0.51)
45 (0.26)
346
168(0.49)
178(0.51)
英国人[5]
78
, 百拇医药
20 (0.26)
33 (0.42)
25 (0.32)
156
73(0.47)
83(0.53)
日本人[1]
153
73 (0.48)
70 (0.46)
9(0.60)
306
, http://www.100md.com
218(0.71)
88(0.29)
中国人
115
60 (0.52)
49 (0.43)
6(0.50)
310
169(0.73)
61(0.27)
由表1，2可见，中国汉族人COMT的G等位基因的频率为73%，A等位基因的频率为27%，COMT各基因型频率分布为：野生型G/G为52%，杂合型G/A为43%，突变纯合子型A/A为5%，其基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。 3 讨论
, 百拇医药
COMT有可溶性(S-COMT)和膜结合性(MB-COMT)两种分子形式，在人类其编码基因是同一个，位于22号染色体的长臂11区带(22q11)。通过对红细胞COMT活性研究发现该酶的活性个体间差异很大[2]，在人群中可以分成低活性、中等活性、高活性3种表型，并通过遗传分析，发现其表型是由COMTH(高活性)和COMTL(低活性)两个等位基因所决定的，以共显性的方式遗传，并推测西方白种人COMTH和COMTL的等位基因频率为0.5、0.5；黑人为0.74、0.36，有明显的种族差异。其基因已被测序，通过对不同组织和个体COMT活性的对照研究，发现在人类COMT基因第4外显子存在一个G→A点突变，使其编码的108位氨基酸由缬氨酸(Val)→蛋氨酸(Met)，导致COMT酶的活性改变[2，3]。当其108位氨基酸为Met时，该酶的活性变为不耐热，即使在生理条件下，其活性也大大降低，该研究的结果与以往的研究结果是一致的。我们的结果显示，中国人COMT等位基因以G为主，占73%，基因型以G/G为主，占52%，而低活性的纯合子A/A只占5%，杂合子G/A占43%。从表3中可以看出，不同人种间COMT的COMTH与COMTL等位基因分布频率不同。中国汉族人群的COMT基因高活性的等位基因、高活性的基因型明显高于西方人种(P<0.001)，与同是亚洲东方人种的日本人无差异(P>0.05)，而同是西方人种的英国人和高加索白人无明显差异(P>0.05)，说明COMT基因多态性东方人和西方人种间存在明显差异。
, http://www.100md.com
该多态性的差异可能可以解释不同的人种或不同的个体在一些疾病发生、发展的差异。虽然，COMT的基因第4号外显子的G→A的点突变导致COMT活性可以相差4～6倍，但目前尚未见到低活性的COMT突变基因型(AA)可肯定导致某一特定疾病的报道，中国人5%的A/A基因型个体均为健康成人。但是，由于该酶在多巴胺的代谢中起着重要的作用，因而推测它可能与某些疾病的遗传易患性有关。如Tiihonen等[6]研究发现Ⅰ型(25岁以后出现)酒精成瘾患者当中A等位基因频率明显高于对照组，提示低活性的个体易于酒精依赖。有研究表明A等位基因可能与双相情感性精神病、精神分裂、帕金森病有关[1，7，8]，但都有不支持的报道。还有A等位基因导致的COMT活性降低可能是某些绝经后妇女患乳腺癌的重要因素的报道[9]。故对其多态性与相关疾病的关系有必要深入研究。该酶还是儿茶酚类药物如某些抗高血压、哮喘、帕金森病药物的主要代谢酶，因此，该酶的活性或该位点的多态性可能影响相关药物的疗效或副作用。目前研究较多的是COMT与左旋多巴胺的副作用。Rivera-Calimlin等[10]报道在白种人中，红细胞COMT高活性的帕金森病患者用左旋多巴后较低活性COMT的患者更容易出现异动症，且菲律宾人种和白种人在服相当剂量的左旋多巴时，前者更易出现异动症，表明存在种族差异，与我们的研究结果一致。
, 百拇医药
通信作者：邵明(E-mail:shaom@163.net)
作者单位：邵明(510282 广州，第一军医大学珠江医院神经内科)
刘焯霖(中山医科大学神经病学教研室)
陶恩祥(中山医科大学神经病学教研室)
陈彪(The Parkinson's Institute of U S A)
参考文献
[1]Kunugi H, Nanko S, Ueki. High and low activity alleles of catechol-O-methyltransferase gene:ethnic difference and possible association with Parkinson's disease. Neurosci Lett, 1997, 221∶202-204.
, http://www.100md.com
[2]Spielman RS, Weinshilboum RM. Genetics of red cell COMT activity:analysis of thermal stability and family data. Am J Med Genet, 1981, 10∶279-290.
[3]Lotta T, Vidgren J, Tilgmann C. Kinnetic of human soluble and membrane-bound catechol-O-methyltransferase: a revised mechanism and description of the thermolabile variant of the enzyme. Biochemistry, 1995, 34∶4202-4210.
[4]Hoda F, Nicholl D, Bennett P, et al. No association between Parkinson's disease and low-activity alleles of catechol-O-methyltransferase. Biochem Biophys Res Commun, 1996, 228∶780-784.
, 百拇医药
[5]Daniel JK, Williams NM, Willians BSCJ, et al. No evidence for allelic association between schizophrenia and a polymorphism determining high or low catechol-O-methyltransferase activity. Am J Psychiatry, 1996, 153∶268-270.
[6]Tiihonen J, Hallikainen T, Lachman H, et al. Association between the functional variant of the catechol-O-methyltransferase (COMT) gene and type 1 alcoholism. Mol Psychiatry, 1999, 4∶286-289.
[7]Kirov G, Murphy KC, Arranz MJ, et al. Low activity allele of catechol-O-methyltransferase gene associated with rapid cycling bipolar disorder. Mol Psychiatry, 1998, 3∶342-345.
, 百拇医药
[8]Lachman HM, Nolan KA, Mohr P, et al. Association between catechol-O-methyltransferase genotype and violence in schizophrenia and schizoaffective disorder. Am J Psychiatry, 1998, 155∶835-837.
[9]Lavigne JA, Helzlsouer KJ, Huang HY, et al. An association between the allele coding for a low activity variant of catechol-O-methyltransferase and the risk for breast cancer. Cancer Res, 1997, 57∶5493-5497.
[10]Rivera-Calimlim L, Reilly DK. Difference in erythrocyte catechol-O-methyltransferase activity between Orientals and Caucasians: difference in levodopa tolerance. Clin Pharmacol Ther, 1984,35∶804-809., 百拇医药
关键词：儿茶酚胺氧位甲基转移酶(catechol-O-methyltransferase, COMT, EC.2.1.1.6) 基因多态性；汉族 儿茶酚胺氧位甲基转移酶(catechol-O-methyltransferase, COMT, EC.2.1.1.6)是一种在人体内广泛存在的酶，它催化儿茶酚胺第3位羟基甲基化，降解儿茶酚胺，是具有生物活性或毒性的儿茶酚胺的主要代谢酶。最近的研究发现COMT的基因第4号外显子存在一个G→A的点突变，使其编码的108位氨基酸由缬氨酸(Val)变成蛋氨酸(Met)，导致COMT酶的活性减低。我们对一组中国汉族人的COMT基因在该位点的多态性做了初步研究，并与其他种族的人群进行了对比分析。
1 材料和方法
1.1 115名健康成年汉族人来自门诊健康查体者，无遗传病家族史，无肿瘤、风湿病及神经系统疾病等。其中男性54名，女性61名，年龄40～72岁。
, 百拇医药
1.2 DNA的提取 抽静脉血10 ml，肝素抗凝，利用常规酚、氯仿抽提法提取DNA，采取紫外分光光度法将DNA稀释至500 mg/L。
1.3 多态性分析 利用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术，按文献[1]设计引物，其序列为：5′-TCGTGGACGCCGTGATTCAGG-3′；5′-AGGTCTGACAAC-GGGTCAGGC-3′。PCR的反应条件：先在95 ℃预变性2 min，再按下列温度和时间循环35次：94 ℃ 30 s；57 ℃ 30 s；72 ℃ 45 s；最后在72 ℃下延伸5 min，其PCR产物为217 bp的DNA片段。将扩增产物5 μl，加入10 U NIa Ⅲ限制性内切酶，反应体积为12 μl。在37℃水浴6 h，最后以10%聚丙酰胺凝胶电泳及EB染色。PCR产物为217 bp，在外显子4上有一恒定的NIa Ⅲ切点，切下81 bp，余下136 bp片段。野生型(G/G)无NIa Ⅲ内切酶的酶切位点，电泳显示81、136 bp两个片段，突变型(AA)
, 百拇医药
有NIa Ⅲ内切酶的酶切位点，电泳显示40、81、96 bp 3个片段，杂合子(G/A)为40、81、96、136 bp 4个片段，如图1。
图1 COMT基因4号外显子扩增产物的NIa Ⅲ酶切分析 1：pGEM-7zf(+)/Hae Ⅲ DNA标准；2、4、5、7:G/G基因型；3：A/G基因型；6、8：A/A基因型
2 结果
115名中国人汉族位点多态性频率及基因型多态性分布见表1、2。
表1 115名汉族人COMT基因多态性频率分布(n=230)
, 百拇医药 性别
染色体数
A等位基因频率
G等位基因频率
男
108
0.13 (30)
0.87( 78)
女
122
0.14 (31)
0.86( 91)
总计
, 百拇医药
230
0.27 (61)
0.73(169)
表2 115名汉族人COMT基因型频率分布(n=115)
基因型
人数
频率
G/G
60
0.52
G/A
49
, 百拇医药 0.43
A/A
6
0.05
表3 不同人种COMT基因多态性分布比较
组别
例数
基因型(频率)
染色体数
等位基因(频率)
G/G
G/A
A/A
, 百拇医药
G
A
白种人[4]
173
40 (0.23)
88 (0.51)
45 (0.26)
346
168(0.49)
178(0.51)
英国人[5]
78
, 百拇医药
20 (0.26)
33 (0.42)
25 (0.32)
156
73(0.47)
83(0.53)
日本人[1]
153
73 (0.48)
70 (0.46)
9(0.60)
306
, http://www.100md.com
218(0.71)
88(0.29)
中国人
115
60 (0.52)
49 (0.43)
6(0.50)
310
169(0.73)
61(0.27)
由表1，2可见，中国汉族人COMT的G等位基因的频率为73%，A等位基因的频率为27%，COMT各基因型频率分布为：野生型G/G为52%，杂合型G/A为43%，突变纯合子型A/A为5%，其基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。 3 讨论
, 百拇医药
COMT有可溶性(S-COMT)和膜结合性(MB-COMT)两种分子形式，在人类其编码基因是同一个，位于22号染色体的长臂11区带(22q11)。通过对红细胞COMT活性研究发现该酶的活性个体间差异很大[2]，在人群中可以分成低活性、中等活性、高活性3种表型，并通过遗传分析，发现其表型是由COMTH(高活性)和COMTL(低活性)两个等位基因所决定的，以共显性的方式遗传，并推测西方白种人COMTH和COMTL的等位基因频率为0.5、0.5；黑人为0.74、0.36，有明显的种族差异。其基因已被测序，通过对不同组织和个体COMT活性的对照研究，发现在人类COMT基因第4外显子存在一个G→A点突变，使其编码的108位氨基酸由缬氨酸(Val)→蛋氨酸(Met)，导致COMT酶的活性改变[2，3]。当其108位氨基酸为Met时，该酶的活性变为不耐热，即使在生理条件下，其活性也大大降低，该研究的结果与以往的研究结果是一致的。我们的结果显示，中国人COMT等位基因以G为主，占73%，基因型以G/G为主，占52%，而低活性的纯合子A/A只占5%，杂合子G/A占43%。从表3中可以看出，不同人种间COMT的COMTH与COMTL等位基因分布频率不同。中国汉族人群的COMT基因高活性的等位基因、高活性的基因型明显高于西方人种(P<0.001)，与同是亚洲东方人种的日本人无差异(P>0.05)，而同是西方人种的英国人和高加索白人无明显差异(P>0.05)，说明COMT基因多态性东方人和西方人种间存在明显差异。
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该多态性的差异可能可以解释不同的人种或不同的个体在一些疾病发生、发展的差异。虽然，COMT的基因第4号外显子的G→A的点突变导致COMT活性可以相差4～6倍，但目前尚未见到低活性的COMT突变基因型(AA)可肯定导致某一特定疾病的报道，中国人5%的A/A基因型个体均为健康成人。但是，由于该酶在多巴胺的代谢中起着重要的作用，因而推测它可能与某些疾病的遗传易患性有关。如Tiihonen等[6]研究发现Ⅰ型(25岁以后出现)酒精成瘾患者当中A等位基因频率明显高于对照组，提示低活性的个体易于酒精依赖。有研究表明A等位基因可能与双相情感性精神病、精神分裂、帕金森病有关[1，7，8]，但都有不支持的报道。还有A等位基因导致的COMT活性降低可能是某些绝经后妇女患乳腺癌的重要因素的报道[9]。故对其多态性与相关疾病的关系有必要深入研究。该酶还是儿茶酚类药物如某些抗高血压、哮喘、帕金森病药物的主要代谢酶，因此，该酶的活性或该位点的多态性可能影响相关药物的疗效或副作用。目前研究较多的是COMT与左旋多巴胺的副作用。Rivera-Calimlin等[10]报道在白种人中，红细胞COMT高活性的帕金森病患者用左旋多巴后较低活性COMT的患者更容易出现异动症，且菲律宾人种和白种人在服相当剂量的左旋多巴时，前者更易出现异动症，表明存在种族差异，与我们的研究结果一致。
, 百拇医药
通信作者：邵明(E-mail:shaom@163.net)
作者单位：邵明(510282 广州，第一军医大学珠江医院神经内科)
刘焯霖(中山医科大学神经病学教研室)
陶恩祥(中山医科大学神经病学教研室)
陈彪(The Parkinson's Institute of U S A)
参考文献
[1]Kunugi H, Nanko S, Ueki. High and low activity alleles of catechol-O-methyltransferase gene:ethnic difference and possible association with Parkinson's disease. Neurosci Lett, 1997, 221∶202-204.
, http://www.100md.com
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[3]Lotta T, Vidgren J, Tilgmann C. Kinnetic of human soluble and membrane-bound catechol-O-methyltransferase: a revised mechanism and description of the thermolabile variant of the enzyme. Biochemistry, 1995, 34∶4202-4210.
[4]Hoda F, Nicholl D, Bennett P, et al. No association between Parkinson's disease and low-activity alleles of catechol-O-methyltransferase. Biochem Biophys Res Commun, 1996, 228∶780-784.
, 百拇医药
[5]Daniel JK, Williams NM, Willians BSCJ, et al. No evidence for allelic association between schizophrenia and a polymorphism determining high or low catechol-O-methyltransferase activity. Am J Psychiatry, 1996, 153∶268-270.
[6]Tiihonen J, Hallikainen T, Lachman H, et al. Association between the functional variant of the catechol-O-methyltransferase (COMT) gene and type 1 alcoholism. Mol Psychiatry, 1999, 4∶286-289.
[7]Kirov G, Murphy KC, Arranz MJ, et al. Low activity allele of catechol-O-methyltransferase gene associated with rapid cycling bipolar disorder. Mol Psychiatry, 1998, 3∶342-345.
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[8]Lachman HM, Nolan KA, Mohr P, et al. Association between catechol-O-methyltransferase genotype and violence in schizophrenia and schizoaffective disorder. Am J Psychiatry, 1998, 155∶835-837.
[9]Lavigne JA, Helzlsouer KJ, Huang HY, et al. An association between the allele coding for a low activity variant of catechol-O-methyltransferase and the risk for breast cancer. Cancer Res, 1997, 57∶5493-5497.
[10]Rivera-Calimlim L, Reilly DK. Difference in erythrocyte catechol-O-methyltransferase activity between Orientals and Caucasians: difference in levodopa tolerance. Clin Pharmacol Ther, 1984,35∶804-809., 百拇医药