利用重组抗原检测抗SSB自身抗体及其临床意义
利用重组抗原检测抗SSB自身抗体及其临床意义
邓安梅 仲人前 陈孙孝 施笑梅 孔宪涛
摘 要 目的:利用重组抗原检测自身免疫疾病患者血清中抗SSB自身抗体并探讨其临床意义。方法:应用DNA重组技术构建SSB基因工程菌,并表达SSB融合蛋白。经GST柱层析法纯化后,分别经蛋白质印迹(WBT)法和酶联免疫吸附(ELISA)法检测20份干燥综合征患者、60份系统性红斑狼疮患者和30份正常人血清。结果:经常规试剂盒检测为SSB(+)的24份患者血清，利用重组抗原检测均阳性；经常规试剂盒检测为SSB(-)的56份患者血清，利用重组抗原检测有11份阳性(WBT法4份，ELISA法7份)。结论:利用重组抗原检测抗SSB自身抗体敏感性较高。利用重组抗原对自身抗体进行定性、定量分析有助于对自身免疫疾病的诊断。
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关键词：自身抗原，SSB；自身免疫疾病；蛋白质印迹法；酶联免疫吸附法
在自身免疫病的发病机制中，自身抗原和抗体的反应起着重要的作用。在系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征(SS)中，SSB是重要的自身抗原[1],抗SSB抗体的检测是诊断SLE,SS的重要的实验室检查指标之一。传统上检测抗SSB抗体多用从动物组织中提取的SSB,其制备较为复杂,难以对检测结果进行质量控制,也难以对自身抗原-抗体之间的分子作用作进一步研究[2]。因此,我们尝试用重组抗原检测抗SSB自身抗体,以利于疾病的早期诊断。
1 材料和方法
1.1 材料 人肝λgt11 cDNA 文库(Dr.R.Davis 赠送)；pGEX-2T质粒和JM109菌株均为本实验室保存；Taq DNA多聚酶，EcoR Ⅰ内切酶，BamH Ⅰ内切酶，T4 DNA连接酶均购自Promega公司。常规检查采用德国欧蒙公司的间接免疫荧光试剂盒及国产ENA(可溶性可抽提核抗原)检测试剂盒(恒佳生物技术公司)。
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1.2 血清 标准抗SSB阳性血清由美国疾病控制中心(CDC)提供。患者血清来自本院1994年8月至1997年8月收治的住院患者，其中SLE 60例、SS 20例。所有患者均符合美国风湿学会制定的诊断标准[3,4]。30份正常对照血清取自献血员。
1.3 SSB的基因克隆与序列测定 以标准抗SSB血清为免疫探针，筛选人肝λgt11 cDNA文库,挑取表达SSB的阳性克隆。对阳性克隆中含有的cDNA片段进行DNA测序鉴定，参考文献[5]的方法进行。
1.4 表达型SSB重组菌的构建 自行设计用于特异性扩增SSB cDNA的一对引物。3′端引物:5′GGCGAATCCCTGGTCTCCGGCACCATT3′；5′端引物:5′AAGGGATCCTACCGACTTTTACCACTA 3′。PCR反应体系及扩增条件参见文献[6]。将经过DNA测序鉴定的纯化的PCR扩增产物经BamHⅠ，EcoRⅠ双酶切后，定向插入pGEX-2T，转导入宿主菌JM109。经双酶切和琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒。
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1.5 SSB重组融合蛋白在大肠杆菌的表达、鉴定与纯化 挑取经鉴定后的重组克隆于LB/Amp培养液、37℃培养至光密度(D)值为0.6,以IPTG诱导表达3 h。收集菌液，经超声破碎,用含8 mol/L尿素的裂解缓冲液溶解包含体，而后加入900 μl氧化还原缓冲液进行复性。将样本液反复流经GST亲和层析柱，再用含5 mmol/L还原型谷胱甘肽的PBS溶液洗脱柱上的融合蛋白,收集洗脱液,进行10%SDS-PAGE电泳，用蛋白质印迹(WBT)法分析重组融合蛋白的抗原特异性。
1.6 利用重组融合抗原对自身抗体的检测
1.6.1 WBT法 重组蛋白经电泳后转印至硝酸纤维素膜，用含3%BSA的PBS(pH 7.4)封闭1 h；而后依次加入抗SSB标准血清、 HRP标记兔抗人IgG抗体，加入3，3-二氨联苯胺溶液和30%H2O2。
1.6.2 ELISA法 重组融合抗原用包被缓冲液CBS(碳酸氢钠缓冲液pH 9.5)调节至4 μg/ml,4℃过夜(16 h)。而后依次加入被检血清、HRP标记兔抗人IgG抗体，加显色剂3,3-二氨基联苯胺和H2O2,3～5 min后加入0.1 ml 2 mol/L硫酸终止反应,经酶比色仪450 nm比色。设相应的血清稀释液抗原抗体反应产物在450 nm时产生的1个D数字为1个抗体单位(U)。
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2 结 果
2.1 重组质粒的构建与鉴定 经EcoRⅠ酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，可见SSB重组质粒释放出约1.6 kb的片段(图1)。测序结果表明,重组质粒中插入的1.6 kb cDNA片段的第73～1 296个核苷酸与Genebank中的人SSB基因序列相一致。
2.2 SSB重组融合蛋白的表达、纯化 经琼脂糖凝胶电泳显示，大约在1.2 kb处可见清晰的特异性扩增条带。DNA测序表明它是SSB基因的精确拷贝。用双酶切法证实质粒载体中含有以正确方向插入、符合预期长度的目的基因(图2)。
图 1 经EcoRⅠ酶切后的SSB重组质粒电泳图
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Fig 1 The SSB recombinant plasmid after
digestion of EcoRⅠ enzyme
1:SSB recombinant plasmid;2:SSA-60 recombinant plasmid;
3:DNA Mr marker
图 2 SSB-pGEX-2T重组子电泳图
Fig 2 The SSB-pGEX-2T plasmid after
, 百拇医药
digestion of EcoRⅠ and BamHⅠ enzyme
1： SSB recombinant plasmid;2： The PCR product of SSB;
3： DNA Mr marker
经IPTG诱导表达的大肠杆菌菌液经10%SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色后，在相对分子质量约73 000处有一浓染蛋白条带，而未经IPTG诱导的菌体蛋白在此处呈阴性。经GST层析柱纯化后,获得纯化的融合蛋白(图3)。
图 3 重组融合蛋白电泳图
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Fig 3 The SDS-PAGE of SSB-GST fusion protein
1:The lysis of E.coli JM109 containing pGEX-2T plasmid;
2:Protein Mr marker; 3:The lysis of E.coli JM109
containing SSB-pGEX-2T plasmid;
4:Purified SSB-GST fusion protein
2.3 重组融合抗原检测抗血清 不同标准抗血清WBT反应证明,重组抗原能与标准抗SSB血清反应，与其他抗血清无交叉反应(图4)。
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图 4 SSB重组融合抗原的免疫印迹
Fig 4 Immunoblotting of SSB fusion protein
1:Standard anti-U1 RNP serum；2:Standard anti-SSA-60 serum；
3:Standard anti-SSA-52 serum；4:Standard anti-SSB serum
在ELISA法检测时，正常对照组值为(76±40) U,因此以大于276 U(
±5s)为阳性标准,小于276 U为阴性标准。结果显示，经常规试剂盒检测为SSB(+)的24份血清,用重组抗原WBT法或ELISA法检测均阳性。经常规试剂盒检测为SSB(-)的56份血清中，用重组抗原经WBT法检测有4份血清为SSB(+)，而ELISA法检测有7份血清阳性。在ELISA法检测中，分别加入标准抗SSA-60、抗SSA-52、抗Sm、抗U1 RNP血清，反应均为阴性，表明此重组抗原ELISA法检测抗SSB抗体具有特异性。本研究将同一份血清标本检测10次，所得结果的CV值为10.7%；将同一份血清分装冻存标本在3个月内检测10次，所得结果的CV值为12.4%，表明本研究建立的重组抗原ELISA检测法重复性和精确性较好。
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3 讨 论
本研究采用标准抗SSB血清筛选人肝λgt11噬菌体cDNA文库，对所得阳性克隆的DNA序列进行了测定，结果表明重组质粒中插入的1.6 kb cDNA片段的第73～1 510个核苷酸与Genebank中的人SSB基因序列相一致。含重组质粒的大肠杆菌JM109经IPTG诱导，其裂解液经SDS-PAGE电泳在近73 000处出现大量蛋白表达，不含目的基因的大肠杆菌JM109在相应的位置未有浓蛋白条带，而含空载体pGEX-2T的大肠杆菌JM109经IPTG诱导后也出现大量蛋白表达，但位置在26 000处，这与载体表达的谷胱甘肽-S-转移酶有关。根据氨基酸组成推算，SSB重组蛋白的相对分子质量为47 000,再加上载体pGEX-2T本身可表达的原核多肽谷胱甘肽-S-转移酶(GST)为26 000,融合蛋白相对分子质量预计在73 000左右，我们的结果与之相符。
在本研究的初期，我们收集少量重组菌液并用煮沸法得到的上清，经鉴定具有较好的抗原性。但这种方法不宜用在大量提取和进一步提纯单一蛋白质上。由于超声破碎法具有简便易行的优点，因而我们采取先反复冻融后超声破碎的方法，以使细菌破碎完全。经破碎前后菌液涂片革兰染色证实，破碎前的杆状细菌经超声后成均匀细粒状。在进一步的实验中，我们发现在破碎后离心上清液中几乎没有煮沸法中证实的融合蛋白条带，于是推测大肠杆菌高效表达外源基因时，表达蛋白在细胞质内聚集，形成包含体。因此，我们采用8 mol/L尿素溶解包含体，加入10 mmol/L DTT作为还原剂，之后用含还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的氧化还原缓冲液稀释，以使表达蛋白质完全还原，恢复正常构型。结果表明，经尿素溶解包含体后，再流经GST亲和层析柱，可得到纯化的GST融合蛋白，分子量符合预期结果。实验结果表明，SSB-GST融合蛋白具有理想的抗原性，可用于检测自身抗体，建立的重组抗原ELISA检测法重复性和精确性较好。
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研究表明[7]，在SS患者中，抗SSB自身抗体与脉管炎、紫癜、白细胞减少和高γ球蛋白血症等临床症状相关。在高滴度抗SSB患者中，高γ球蛋白血症和涎管异常的频率显著增高。我们以前对于自身免疫病患者中ENA(可溶性可抽提核抗原)条带与体液免疫激活状态的研究发现，自身免疫病患者中ENA条带越多，体液免疫激活程度越高，IgG水平越高[8]。因此，可利用重组抗原检测ENA来了解患者体液免疫状况及与临床症状的关系。
目前WBT法检测ENA不失为一种简便、快速、准确性较高的方法，我们设想将融合蛋白中的GST成分切除,以探讨纯抗原成分检测抗血清的效果，此工作尚待进行。ELISA法具有定量的作用,所以可对患者病程进行监测,并判断预后,对我们了解抗原抗体在疾病机制中所起的作用有帮助。但其准确界限对于提高敏感性而又不降低特异性而言很重要,需我们在以后的工作中摸索确定。
参考文献
, 百拇医药
[1]Reichlin M.Autoantibodies to the RoRNP particles[J].Clin Exp Immunol,1995,99(1):7-8.
[2]邓安梅,仲人前,孔宪涛.SSB/La抗原研究进展及临床应用[J].中国免疫学杂志,1997，13(增刊)：92-94.
[3]Tan EM.Revised criteria for systemic lupus erythematosus[J].Arthritis Rheum,1982,25(12):1271-1272.
[4]Tan EM.Criteria for diagnosis of Sjogren′s syndrome[J].Rheum Dis Clin North Am,1994,20(4):391-392.
[5]卢圣栋 主编.现代分子生物学实验技术[M].北京:高等教育出版社，1993.293-298.
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[6]邓安梅，仲人前，孔宪涛.自身抗原Ro-60 cDNA克隆构建及表达[J].第二军医大学学报,1998,19(1):20-22.
[7]Meilof JF.Autoantibodies and their target antigens in Sjogren syndrome[J].Netherlands Med,1995,40(11):1405-1409.
[8]Deng AM,Zhong RQ,Chen SX,et al.Anti-ENA autoantibody profiles and humoral immune activation[J].J Med Coll PLA,1999,14(1):38-42., http://www.100md.com
邓安梅 仲人前 陈孙孝 施笑梅 孔宪涛
摘 要 目的:利用重组抗原检测自身免疫疾病患者血清中抗SSB自身抗体并探讨其临床意义。方法:应用DNA重组技术构建SSB基因工程菌,并表达SSB融合蛋白。经GST柱层析法纯化后,分别经蛋白质印迹(WBT)法和酶联免疫吸附(ELISA)法检测20份干燥综合征患者、60份系统性红斑狼疮患者和30份正常人血清。结果:经常规试剂盒检测为SSB(+)的24份患者血清，利用重组抗原检测均阳性；经常规试剂盒检测为SSB(-)的56份患者血清，利用重组抗原检测有11份阳性(WBT法4份，ELISA法7份)。结论:利用重组抗原检测抗SSB自身抗体敏感性较高。利用重组抗原对自身抗体进行定性、定量分析有助于对自身免疫疾病的诊断。
, http://www.100md.com
关键词：自身抗原，SSB；自身免疫疾病；蛋白质印迹法；酶联免疫吸附法
在自身免疫病的发病机制中，自身抗原和抗体的反应起着重要的作用。在系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征(SS)中，SSB是重要的自身抗原[1],抗SSB抗体的检测是诊断SLE,SS的重要的实验室检查指标之一。传统上检测抗SSB抗体多用从动物组织中提取的SSB,其制备较为复杂,难以对检测结果进行质量控制,也难以对自身抗原-抗体之间的分子作用作进一步研究[2]。因此,我们尝试用重组抗原检测抗SSB自身抗体,以利于疾病的早期诊断。
1 材料和方法
1.1 材料 人肝λgt11 cDNA 文库(Dr.R.Davis 赠送)；pGEX-2T质粒和JM109菌株均为本实验室保存；Taq DNA多聚酶，EcoR Ⅰ内切酶，BamH Ⅰ内切酶，T4 DNA连接酶均购自Promega公司。常规检查采用德国欧蒙公司的间接免疫荧光试剂盒及国产ENA(可溶性可抽提核抗原)检测试剂盒(恒佳生物技术公司)。
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1.2 血清 标准抗SSB阳性血清由美国疾病控制中心(CDC)提供。患者血清来自本院1994年8月至1997年8月收治的住院患者，其中SLE 60例、SS 20例。所有患者均符合美国风湿学会制定的诊断标准[3,4]。30份正常对照血清取自献血员。
1.3 SSB的基因克隆与序列测定 以标准抗SSB血清为免疫探针，筛选人肝λgt11 cDNA文库,挑取表达SSB的阳性克隆。对阳性克隆中含有的cDNA片段进行DNA测序鉴定，参考文献[5]的方法进行。
1.4 表达型SSB重组菌的构建 自行设计用于特异性扩增SSB cDNA的一对引物。3′端引物:5′GGCGAATCCCTGGTCTCCGGCACCATT3′；5′端引物:5′AAGGGATCCTACCGACTTTTACCACTA 3′。PCR反应体系及扩增条件参见文献[6]。将经过DNA测序鉴定的纯化的PCR扩增产物经BamHⅠ，EcoRⅠ双酶切后，定向插入pGEX-2T，转导入宿主菌JM109。经双酶切和琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒。
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1.5 SSB重组融合蛋白在大肠杆菌的表达、鉴定与纯化 挑取经鉴定后的重组克隆于LB/Amp培养液、37℃培养至光密度(D)值为0.6,以IPTG诱导表达3 h。收集菌液，经超声破碎,用含8 mol/L尿素的裂解缓冲液溶解包含体，而后加入900 μl氧化还原缓冲液进行复性。将样本液反复流经GST亲和层析柱，再用含5 mmol/L还原型谷胱甘肽的PBS溶液洗脱柱上的融合蛋白,收集洗脱液,进行10%SDS-PAGE电泳，用蛋白质印迹(WBT)法分析重组融合蛋白的抗原特异性。
1.6 利用重组融合抗原对自身抗体的检测
1.6.1 WBT法 重组蛋白经电泳后转印至硝酸纤维素膜，用含3%BSA的PBS(pH 7.4)封闭1 h；而后依次加入抗SSB标准血清、 HRP标记兔抗人IgG抗体，加入3，3-二氨联苯胺溶液和30%H2O2。
1.6.2 ELISA法 重组融合抗原用包被缓冲液CBS(碳酸氢钠缓冲液pH 9.5)调节至4 μg/ml,4℃过夜(16 h)。而后依次加入被检血清、HRP标记兔抗人IgG抗体，加显色剂3,3-二氨基联苯胺和H2O2,3～5 min后加入0.1 ml 2 mol/L硫酸终止反应,经酶比色仪450 nm比色。设相应的血清稀释液抗原抗体反应产物在450 nm时产生的1个D数字为1个抗体单位(U)。
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2 结 果
2.1 重组质粒的构建与鉴定 经EcoRⅠ酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，可见SSB重组质粒释放出约1.6 kb的片段(图1)。测序结果表明,重组质粒中插入的1.6 kb cDNA片段的第73～1 296个核苷酸与Genebank中的人SSB基因序列相一致。
2.2 SSB重组融合蛋白的表达、纯化 经琼脂糖凝胶电泳显示，大约在1.2 kb处可见清晰的特异性扩增条带。DNA测序表明它是SSB基因的精确拷贝。用双酶切法证实质粒载体中含有以正确方向插入、符合预期长度的目的基因(图2)。
图 1 经EcoRⅠ酶切后的SSB重组质粒电泳图
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Fig 1 The SSB recombinant plasmid after
digestion of EcoRⅠ enzyme
1:SSB recombinant plasmid;2:SSA-60 recombinant plasmid;
3:DNA Mr marker
图 2 SSB-pGEX-2T重组子电泳图
Fig 2 The SSB-pGEX-2T plasmid after
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digestion of EcoRⅠ and BamHⅠ enzyme
1： SSB recombinant plasmid;2： The PCR product of SSB;
3： DNA Mr marker
经IPTG诱导表达的大肠杆菌菌液经10%SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色后，在相对分子质量约73 000处有一浓染蛋白条带，而未经IPTG诱导的菌体蛋白在此处呈阴性。经GST层析柱纯化后,获得纯化的融合蛋白(图3)。
图 3 重组融合蛋白电泳图
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Fig 3 The SDS-PAGE of SSB-GST fusion protein
1:The lysis of E.coli JM109 containing pGEX-2T plasmid;
2:Protein Mr marker; 3:The lysis of E.coli JM109
containing SSB-pGEX-2T plasmid;
4:Purified SSB-GST fusion protein
2.3 重组融合抗原检测抗血清 不同标准抗血清WBT反应证明,重组抗原能与标准抗SSB血清反应，与其他抗血清无交叉反应(图4)。
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图 4 SSB重组融合抗原的免疫印迹
Fig 4 Immunoblotting of SSB fusion protein
1:Standard anti-U1 RNP serum；2:Standard anti-SSA-60 serum；
3:Standard anti-SSA-52 serum；4:Standard anti-SSB serum
在ELISA法检测时，正常对照组值为(76±40) U,因此以大于276 U(
±5s)为阳性标准,小于276 U为阴性标准。结果显示，经常规试剂盒检测为SSB(+)的24份血清,用重组抗原WBT法或ELISA法检测均阳性。经常规试剂盒检测为SSB(-)的56份血清中，用重组抗原经WBT法检测有4份血清为SSB(+)，而ELISA法检测有7份血清阳性。在ELISA法检测中，分别加入标准抗SSA-60、抗SSA-52、抗Sm、抗U1 RNP血清，反应均为阴性，表明此重组抗原ELISA法检测抗SSB抗体具有特异性。本研究将同一份血清标本检测10次，所得结果的CV值为10.7%；将同一份血清分装冻存标本在3个月内检测10次，所得结果的CV值为12.4%，表明本研究建立的重组抗原ELISA检测法重复性和精确性较好。, http://www.100md.com
3 讨 论
本研究采用标准抗SSB血清筛选人肝λgt11噬菌体cDNA文库，对所得阳性克隆的DNA序列进行了测定，结果表明重组质粒中插入的1.6 kb cDNA片段的第73～1 510个核苷酸与Genebank中的人SSB基因序列相一致。含重组质粒的大肠杆菌JM109经IPTG诱导，其裂解液经SDS-PAGE电泳在近73 000处出现大量蛋白表达，不含目的基因的大肠杆菌JM109在相应的位置未有浓蛋白条带，而含空载体pGEX-2T的大肠杆菌JM109经IPTG诱导后也出现大量蛋白表达，但位置在26 000处，这与载体表达的谷胱甘肽-S-转移酶有关。根据氨基酸组成推算，SSB重组蛋白的相对分子质量为47 000,再加上载体pGEX-2T本身可表达的原核多肽谷胱甘肽-S-转移酶(GST)为26 000,融合蛋白相对分子质量预计在73 000左右，我们的结果与之相符。
在本研究的初期，我们收集少量重组菌液并用煮沸法得到的上清，经鉴定具有较好的抗原性。但这种方法不宜用在大量提取和进一步提纯单一蛋白质上。由于超声破碎法具有简便易行的优点，因而我们采取先反复冻融后超声破碎的方法，以使细菌破碎完全。经破碎前后菌液涂片革兰染色证实，破碎前的杆状细菌经超声后成均匀细粒状。在进一步的实验中，我们发现在破碎后离心上清液中几乎没有煮沸法中证实的融合蛋白条带，于是推测大肠杆菌高效表达外源基因时，表达蛋白在细胞质内聚集，形成包含体。因此，我们采用8 mol/L尿素溶解包含体，加入10 mmol/L DTT作为还原剂，之后用含还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的氧化还原缓冲液稀释，以使表达蛋白质完全还原，恢复正常构型。结果表明，经尿素溶解包含体后，再流经GST亲和层析柱，可得到纯化的GST融合蛋白，分子量符合预期结果。实验结果表明，SSB-GST融合蛋白具有理想的抗原性，可用于检测自身抗体，建立的重组抗原ELISA检测法重复性和精确性较好。
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研究表明[7]，在SS患者中，抗SSB自身抗体与脉管炎、紫癜、白细胞减少和高γ球蛋白血症等临床症状相关。在高滴度抗SSB患者中，高γ球蛋白血症和涎管异常的频率显著增高。我们以前对于自身免疫病患者中ENA(可溶性可抽提核抗原)条带与体液免疫激活状态的研究发现，自身免疫病患者中ENA条带越多，体液免疫激活程度越高，IgG水平越高[8]。因此，可利用重组抗原检测ENA来了解患者体液免疫状况及与临床症状的关系。
目前WBT法检测ENA不失为一种简便、快速、准确性较高的方法，我们设想将融合蛋白中的GST成分切除,以探讨纯抗原成分检测抗血清的效果，此工作尚待进行。ELISA法具有定量的作用,所以可对患者病程进行监测,并判断预后,对我们了解抗原抗体在疾病机制中所起的作用有帮助。但其准确界限对于提高敏感性而又不降低特异性而言很重要,需我们在以后的工作中摸索确定。
参考文献
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[1]Reichlin M.Autoantibodies to the RoRNP particles[J].Clin Exp Immunol,1995,99(1):7-8.
[2]邓安梅,仲人前,孔宪涛.SSB/La抗原研究进展及临床应用[J].中国免疫学杂志,1997，13(增刊)：92-94.
[3]Tan EM.Revised criteria for systemic lupus erythematosus[J].Arthritis Rheum,1982,25(12):1271-1272.
[4]Tan EM.Criteria for diagnosis of Sjogren′s syndrome[J].Rheum Dis Clin North Am,1994,20(4):391-392.
[5]卢圣栋 主编.现代分子生物学实验技术[M].北京:高等教育出版社，1993.293-298.
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[6]邓安梅，仲人前，孔宪涛.自身抗原Ro-60 cDNA克隆构建及表达[J].第二军医大学学报,1998,19(1):20-22.
[7]Meilof JF.Autoantibodies and their target antigens in Sjogren syndrome[J].Netherlands Med,1995,40(11):1405-1409.
[8]Deng AM,Zhong RQ,Chen SX,et al.Anti-ENA autoantibody profiles and humoral immune activation[J].J Med Coll PLA,1999,14(1):38-42., http://www.100md.com