微囊内胰岛数量对实验性糖尿病模型鼠疗效的影响
作者：姜枫勤 王恒孝 任青华 刘金生 刘金城
单位：山东省医科院基础医学研究所 济南 250000
关键词：胰岛；糖尿病；微囊；移植；新生猪；大鼠
中国现代医学杂志001103 用一步法微囊技术包裹新生猪胰岛，并控制微囊内胰岛数量，分别移植 于链脲霉素(STZ)制备的糖尿病模型大鼠，每组10只，对照组微囊内3～4个胰岛，实验组微 囊内含一个胰岛。植入胰岛数量均为2?000个/鼠，移植后的第10天各组大鼠均停用胰 岛素。 结果表明：实验组大鼠血糖值为(6.64±1.10)mmol/L。半数以上血糖在正常范围并存活 达147d以 上。对照组为(9.83±1.33)mmol/L。血糖维持该水平70余天后逐渐上升，其中3只血糖高水 平 情况下存活98d。两组相比有非常显著差异(P<0.01)。结果表明：减少微囊内胰岛数量 ，可提供足量营养，是提高疗效的有利措施。
, 百拇医药
分类号 R587.1
TBE EFFECT OF ISLETS NUMBER IN ONE MICROCAPSULE
ON RAT WITH DIABETTE MILLITUS
Jiang Fengqin, Wang Hengxiao, Ren Qinhua, Liu Jinsheng
(Academy of Shandong Medical Sciences Institute of Basic Medicine)
Abstract: Islets of newly born pig were microencapsulated wit h one-step method. Part I: every microcapsule cantains only one pancreat islet; Part II: three of f our. The diabetes mellitus rats were induced by strptozotocin and divided into e xperimental group and control group with part II. Every rat received 2000 islets . After transplantation, blood glucose level of experimental group rats decrease d to 6.64±1.10mmol/L; control group rats were 9.38±1.33mmol/L. There is obviou s difference between two groups. The result showed the capsule containing one is let have better effect for treat diabetes millitus.
, 百拇医药
Key words: Pancreat Islets; Diabetes Millitus; Microcapsule; G raft; Newly Born Pigs; Rats
采用胶原酶消化和体外培养方法能大量获得活性好、纯度高的胰岛细 胞[1]。为解决异种移植中排斥问题，我们以钡离子作交联剂，用一步法微囊新生 猪胰岛，移植治疗实验性糖尿病小鼠取得成功[2]。在此基础上，我 们又比较了微囊内胰岛的数量对疗效的影响，现将实验结果报告如下。
1 材料与方法1.1 材料
海藻酸钠(国产化学纯，本室自行精制)；微囊发生器：包括无油空气压缩机，空气滤菌器， 转子流量计和双腔喷头；新生猪：美国产杜洛克种，足月分娩，未哺乳。雄性Wistar大鼠， 体重180～200g(山东省实验动物中心提供)。
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1.2 方法
1.2.1 实验性糖尿病模型的制备与分组 取大白鼠20只，尾静脉注射STZ65 mg/kg，注射48h后，用微量血糖分析仪测空腹血糖，血糖持续>16.17mmol/L 3周以上 ，为 糖尿病模型形成。测血糖前36h停用胰岛素，测后立即皮下注射胰岛素5～8U以维持血糖正常 范围直至移植。移植前将大鼠随机分为2组，每组10只，实验组移植的微囊内包裹1个胰岛， 对照组移植的微囊内包裹3～4个胰岛。
1.2.2 微囊化新生猪胰岛的制备 新生猪胰岛细胞的分离培养见参考文献 [1]，一步微囊法技术参照同参考文献[1，2]。将纯化后 胰岛分成2份，与海藻酸钠溶液按以下不同的比例悬浮混匀，吸至双腔喷头(微囊发生器)内 腔 ，调整气流，外腔200L/h，内腔20L/h，经7号喷头喷入20mmol/BaCl2溶液中成囊，囊直 径500～700um，用自制手挑器分别挑出微囊含1个胰岛和3个以上胰岛，经无菌生理盐水洗3 次后备移植用。
, 百拇医药
1.2.3 移植 将实验性糖尿病大鼠轻度乙醚麻醉，常规消毒，行腹腔穿刺 注入移植物。实验组微囊内含1个胰岛，对照组微囊内含3～4个胰岛，观察体重、血糖变化 ，移植1周内逐渐减少胰岛素用量，直至完全停用。
1.2.4 血糖测定 用微量血糖测定仪测定，移植前每周测1次，移植后每 周每2天测1次，以后每周测1次。
1.2.5 组织学检查 从恢复正常血糖2周以上及血糖升高>16.7mmol/L时， 实验糖尿病大鼠体内取出移物植和胰腺，固定于Bouins液中，石蜡包埋，切片4～7um厚，HG 染色。
2 结果2.1 糖尿病鼠移植后停用胰岛素的存活率
在完全停用胰岛素后，对照组平均存活54.25d，实验组存活率明显高于对照组。到147d ，半数大鼠仍存活，见附表。
, 百拇医药
山东省自然科学基金重点资助项目(Z96C01002)
1 志友公司医院
附表 移植大鼠停用胰岛素后存活率 例(%) n=10
组别
[(〗
存活天数(周)
2
3
4
14
21[)〗
实验组
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10(100)
10(100)
7(70)
6(60)
5(50)
对照组
10(100)
8(80)
3(30)
3(30)
0
2.2 移植后血糖水平
移植后第10天测得各组血糖水平，实验组为6.64±1.1mmol/L，对照组为9.83±1.33mmol/L 。实验组半数以上血糖在正确范围持续达147d以上，与对照组相比差异非常显著(P<0. 01)。
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2.3 移植物和胰腺组织学检查
取恢复正常血糖147d时的实验组和对照组98d时(血糖>16.7mmol/L)的受体鼠腹腔移植物和 胰腺进行组织学检查。实验组微囊内胰岛完整、细胞结构清晰、胰岛生存良好，见图1。 对照组微囊内胰岛染色较浅，细胞结构消失、核溶解，显示胰岛已死亡，但微囊表面光滑， 周 围未见纤维细胞包绕现象，见图2。所有移植受体胰腺组织学检查，显示胰腺组织破坏，β 细胞消失，未见胰岛细胞自发性再生。
图1 微囊化新生猪胰岛移植，微囊内胰岛结构清晰，胰岛生存良好(HE×200)
图2 微囊化新生猪胰岛移植，微囊胰岛细胞结构消失、核溶解，显示胰 岛已死亡(HE×200)
3 讨论
许多实验证实微囊有免疫隔离作用和良好的生物相溶性[3，4]，是一种较理想和 有效的抗免疫排斥的手段。本实验室数次以钡离子作交联剂，一步法制备微囊，并详细作了 活性测定和异种移植实验。移植物可在受体内长期存活，使血糖恢复正常，表明钡交联海藻 酸钠微囊具有生物相溶性，可保护移植胰岛免受排斥。该实验将微囊内包裹不同数 量的胰岛与疗效的关系作了比较：移植后第10天实验组血糖下降，体重上升，至147d时仍有 半数大鼠存活，而且血糖一直保持在正常范围，对照组血糖较实验组高。
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STZ特异性破坏鼠胰岛β细胞：STZ诱导的糖尿病模型为不可逆性损害[5]，该实验 所有模型鼠胰腺病检无胰岛细胞自发性再生，模型鼠的血糖恢复正常，证明移植物有正常的 胰岛素分泌及调节功能。
从实验结果看，微囊内含有1个胰岛疗效最好，存活时间最长，可能与生活空间宽松 、膜的良好通透性、摄取营养充足有关，而微囊内胰岛数量增加，减少了生活空间，造成摄 取营养不足，而使胰岛存活时间短，结构消失，核溶解而死亡。该实验结果提示：控制微囊 内胰岛数量是提高疗效的良好手段。
参 考 文 献
1，姜枫勤，唐天华，刘风云，等.微囊化新生猪胰岛细胞体外培养的研究.中华器官 移植杂志，1995；16(1)：31
2，姜枫勤，陈珂忠，刘金生，等.微囊化新生猪胰岛异种移植治疗小鼠实验性糖尿 病的研究.山东医科大学学报，1994；32(4)：281～283
, http://www.100md.com
3，Lin，Sun AM.Microecncapsulated isets as bioartificiial endocrine pa ncreas.Science,1980;210(21):908
4，谭 欣，李 通，熊 霞，等.微囊化胰岛异种移植逆转大鼠实验性糖尿病的研 究.中华器官移植杂志，1990；11(2)：56
5，Chen D,Barneo L,Field MJ.Study of fresh microencapsulated islets with polylysine-alginate in xenografts.Transp Proc,1992;24:629
(1999-07-18收稿), 百拇医药
单位：山东省医科院基础医学研究所 济南 250000
关键词：胰岛；糖尿病；微囊；移植；新生猪；大鼠
中国现代医学杂志001103 用一步法微囊技术包裹新生猪胰岛，并控制微囊内胰岛数量，分别移植 于链脲霉素(STZ)制备的糖尿病模型大鼠，每组10只，对照组微囊内3～4个胰岛，实验组微 囊内含一个胰岛。植入胰岛数量均为2?000个/鼠，移植后的第10天各组大鼠均停用胰 岛素。 结果表明：实验组大鼠血糖值为(6.64±1.10)mmol/L。半数以上血糖在正常范围并存活 达147d以 上。对照组为(9.83±1.33)mmol/L。血糖维持该水平70余天后逐渐上升，其中3只血糖高水 平 情况下存活98d。两组相比有非常显著差异(P<0.01)。结果表明：减少微囊内胰岛数量 ，可提供足量营养，是提高疗效的有利措施。
, 百拇医药
分类号 R587.1
TBE EFFECT OF ISLETS NUMBER IN ONE MICROCAPSULE
ON RAT WITH DIABETTE MILLITUS
Jiang Fengqin, Wang Hengxiao, Ren Qinhua, Liu Jinsheng
(Academy of Shandong Medical Sciences Institute of Basic Medicine)
Abstract: Islets of newly born pig were microencapsulated wit h one-step method. Part I: every microcapsule cantains only one pancreat islet; Part II: three of f our. The diabetes mellitus rats were induced by strptozotocin and divided into e xperimental group and control group with part II. Every rat received 2000 islets . After transplantation, blood glucose level of experimental group rats decrease d to 6.64±1.10mmol/L; control group rats were 9.38±1.33mmol/L. There is obviou s difference between two groups. The result showed the capsule containing one is let have better effect for treat diabetes millitus.
, 百拇医药
Key words: Pancreat Islets; Diabetes Millitus; Microcapsule; G raft; Newly Born Pigs; Rats
采用胶原酶消化和体外培养方法能大量获得活性好、纯度高的胰岛细 胞[1]。为解决异种移植中排斥问题，我们以钡离子作交联剂，用一步法微囊新生 猪胰岛，移植治疗实验性糖尿病小鼠取得成功[2]。在此基础上，我 们又比较了微囊内胰岛的数量对疗效的影响，现将实验结果报告如下。
1 材料与方法1.1 材料
海藻酸钠(国产化学纯，本室自行精制)；微囊发生器：包括无油空气压缩机，空气滤菌器， 转子流量计和双腔喷头；新生猪：美国产杜洛克种，足月分娩，未哺乳。雄性Wistar大鼠， 体重180～200g(山东省实验动物中心提供)。
, http://www.100md.com
1.2 方法
1.2.1 实验性糖尿病模型的制备与分组 取大白鼠20只，尾静脉注射STZ65 mg/kg，注射48h后，用微量血糖分析仪测空腹血糖，血糖持续>16.17mmol/L 3周以上 ，为 糖尿病模型形成。测血糖前36h停用胰岛素，测后立即皮下注射胰岛素5～8U以维持血糖正常 范围直至移植。移植前将大鼠随机分为2组，每组10只，实验组移植的微囊内包裹1个胰岛， 对照组移植的微囊内包裹3～4个胰岛。
1.2.2 微囊化新生猪胰岛的制备 新生猪胰岛细胞的分离培养见参考文献 [1]，一步微囊法技术参照同参考文献[1，2]。将纯化后 胰岛分成2份，与海藻酸钠溶液按以下不同的比例悬浮混匀，吸至双腔喷头(微囊发生器)内 腔 ，调整气流，外腔200L/h，内腔20L/h，经7号喷头喷入20mmol/BaCl2溶液中成囊，囊直 径500～700um，用自制手挑器分别挑出微囊含1个胰岛和3个以上胰岛，经无菌生理盐水洗3 次后备移植用。
, 百拇医药
1.2.3 移植 将实验性糖尿病大鼠轻度乙醚麻醉，常规消毒，行腹腔穿刺 注入移植物。实验组微囊内含1个胰岛，对照组微囊内含3～4个胰岛，观察体重、血糖变化 ，移植1周内逐渐减少胰岛素用量，直至完全停用。
1.2.4 血糖测定 用微量血糖测定仪测定，移植前每周测1次，移植后每 周每2天测1次，以后每周测1次。
1.2.5 组织学检查 从恢复正常血糖2周以上及血糖升高>16.7mmol/L时， 实验糖尿病大鼠体内取出移物植和胰腺，固定于Bouins液中，石蜡包埋，切片4～7um厚，HG 染色。
2 结果2.1 糖尿病鼠移植后停用胰岛素的存活率
在完全停用胰岛素后，对照组平均存活54.25d，实验组存活率明显高于对照组。到147d ，半数大鼠仍存活，见附表。
, 百拇医药
山东省自然科学基金重点资助项目(Z96C01002)
1 志友公司医院
附表 移植大鼠停用胰岛素后存活率 例(%) n=10
组别
[(〗
存活天数(周)
2
3
4
14
21[)〗
实验组
, http://www.100md.com
10(100)
10(100)
7(70)
6(60)
5(50)
对照组
10(100)
8(80)
3(30)
3(30)
0
2.2 移植后血糖水平
移植后第10天测得各组血糖水平，实验组为6.64±1.1mmol/L，对照组为9.83±1.33mmol/L 。实验组半数以上血糖在正确范围持续达147d以上，与对照组相比差异非常显著(P<0. 01)。
, http://www.100md.com
2.3 移植物和胰腺组织学检查
取恢复正常血糖147d时的实验组和对照组98d时(血糖>16.7mmol/L)的受体鼠腹腔移植物和 胰腺进行组织学检查。实验组微囊内胰岛完整、细胞结构清晰、胰岛生存良好，见图1。 对照组微囊内胰岛染色较浅，细胞结构消失、核溶解，显示胰岛已死亡，但微囊表面光滑， 周 围未见纤维细胞包绕现象，见图2。所有移植受体胰腺组织学检查，显示胰腺组织破坏，β 细胞消失，未见胰岛细胞自发性再生。
图1 微囊化新生猪胰岛移植，微囊内胰岛结构清晰，胰岛生存良好(HE×200)
图2 微囊化新生猪胰岛移植，微囊胰岛细胞结构消失、核溶解，显示胰 岛已死亡(HE×200)
3 讨论
许多实验证实微囊有免疫隔离作用和良好的生物相溶性[3，4]，是一种较理想和 有效的抗免疫排斥的手段。本实验室数次以钡离子作交联剂，一步法制备微囊，并详细作了 活性测定和异种移植实验。移植物可在受体内长期存活，使血糖恢复正常，表明钡交联海藻 酸钠微囊具有生物相溶性，可保护移植胰岛免受排斥。该实验将微囊内包裹不同数 量的胰岛与疗效的关系作了比较：移植后第10天实验组血糖下降，体重上升，至147d时仍有 半数大鼠存活，而且血糖一直保持在正常范围，对照组血糖较实验组高。
, http://www.100md.com
STZ特异性破坏鼠胰岛β细胞：STZ诱导的糖尿病模型为不可逆性损害[5]，该实验 所有模型鼠胰腺病检无胰岛细胞自发性再生，模型鼠的血糖恢复正常，证明移植物有正常的 胰岛素分泌及调节功能。
从实验结果看，微囊内含有1个胰岛疗效最好，存活时间最长，可能与生活空间宽松 、膜的良好通透性、摄取营养充足有关，而微囊内胰岛数量增加，减少了生活空间，造成摄 取营养不足，而使胰岛存活时间短，结构消失，核溶解而死亡。该实验结果提示：控制微囊 内胰岛数量是提高疗效的良好手段。
参 考 文 献
1，姜枫勤，唐天华，刘风云，等.微囊化新生猪胰岛细胞体外培养的研究.中华器官 移植杂志，1995；16(1)：31
2，姜枫勤，陈珂忠，刘金生，等.微囊化新生猪胰岛异种移植治疗小鼠实验性糖尿 病的研究.山东医科大学学报，1994；32(4)：281～283
, http://www.100md.com
3，Lin，Sun AM.Microecncapsulated isets as bioartificiial endocrine pa ncreas.Science,1980;210(21):908
4，谭 欣，李 通，熊 霞，等.微囊化胰岛异种移植逆转大鼠实验性糖尿病的研 究.中华器官移植杂志，1990；11(2)：56
5，Chen D,Barneo L,Field MJ.Study of fresh microencapsulated islets with polylysine-alginate in xenografts.Transp Proc,1992;24:629
(1999-07-18收稿), 百拇医药