幽门螺杆菌基因重组尿素酶亚单位免疫预防作用的实验研究
作者：施理 王继德 陈烨 张振书 张亚历 张万岱 周殿元
单位：广州，第一军医大学南方医院全军消化病研究所510515
关键词：螺杆菌；幽门；尿素酶；免疫接种
中华医学杂志001104
【摘要】 目的 评价幽门螺杆菌(Hp)基因重组尿素酶A、B亚单位(rUreA、rUreB)的免疫预防作用。方法 将BALB/C小鼠分为如下7组：阴性对照组(10只)、霍乱毒素B亚单位(CTB)对照组(10只)、rUreA对照组(10只)、rUreB对照组(10只)、rUreA+CTB实验组(30只)、rUreB+CTB实验组(30只)、Hp超声粉碎物+CTB实验组(30只)，胃内分别接种如下物质：150 ml磷酸盐缓冲液、5 μg CTB、50 μg rUreA、50 μg rUreB、50 μg rUreA+CTB、5 μg rUreB+CTB、400 μg Hp超声粉碎物+5 μg CTB；2周后胃内接种Hp(107～108 CPU/次)；4周、8周、12周后处死小鼠，用胃组织切片Giemsa染色、显微镜下检查Hp的方法评价免疫预防作用；另外，rUreA+CTB毒副作用组(10只)、rUreB+CTB毒副作用组(10只)小鼠，只接种rUreA+CTB或rUreB+CTB, 而不感染Hp，12周后处死，用胃组织切片HE染色、显微镜下观察炎症细胞浸润的方法评价毒副作用。结果 给小鼠胃内单独接种CTB或rUreA或rUreB，可使免疫小鼠胃粘膜Hp感染数目明显减少。CTB能增强rUreA、rUreB免疫保护作用。接种rUreA+CTB较接种rUreB+CTB或Hp超声粉碎物+CTB，免疫保护作用产生的较晚。接种rUreA+CTB或rUreB+CTB或Hp超声粉碎物+CTB都不能使免疫小鼠完全免受Hp感染。免疫接种rUreA、rUreB、CTB不但能使免疫小鼠Hp感染数目减少，而且能减轻胃粘膜慢性炎症反应。结论 免疫接种rUreA+CTB或rUreB+CTB或Hp超声粉碎物+CTB，可获得不完全免疫保护，并能减轻胃粘膜炎症反应。
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Evaluation of immune prophylaxis of recombinant urease subunit of Helicobacter pylori
SHI Li WANG Jude CHEN Ye
(The Digestive Disease Institute of PLA, Nanfang Hospital, The Firest Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
【Abstract】 Objective To evaluate the immune prophylaxis of recombinant urease subunit A or B (rUreA or rUreB). Methods The BALB/C mice were divided into seven groups: negative control group, control group with CTB, control group with rUreA, control group with rUreB, experimental group with rUreA+CTB and experimental group with rUreB+CTB, experimental group with sonicate+CTB, which were gastrically inoculated with 150 ml PBS, 5 μg CTB, 50 μg rUreA, 50 μg rUreB, 50 μg rUreA+CTB, 5 μg rUreB+CTB and 400 μg sonicate+5 μg CTB, respectively. Two weeks later, the mice were gastrically infected with H.pylori (107～108 CPU per time). 4, 8 and 12 weeks later, the mice were killed and the immune protection of PBS, CTB, rUreA, rUreB, rUreA+CTB, rUreB+CTB and sonicate+CTB were evaluated by the presence of H.pylori in gastric tissue stained with Giemsa by microscopy. The mice in the side-effecting groups of rUreA+CTB and rUreB+CTB were not infected with H.pylori. 12 weeks later, the mice in the two groups were killed, and the side effects of rUreA+CTB and rUreB+CTB were evaluated by the infiltration of inflammation cells in gastric tissue stained with HE by microscopy. Results The mice gastrically inoculated with CTB, rUreA or rUreB had significantly less H.pylori. The immune protective effect of rUreA, rUreB or sonicate of H.pylori combined with CTB was stronger than that of rUreA, rUreB or sonicate of H.pylori alone. The immune protective effect of rUreA+CTB occurred later than that of rUreB+CTB or sonicate of H.pylori+CTB. The mice immunized with rUreA+CTB, rUreB+CTB or sonicate of H.pylori+CTB were not completely protected against H.pylori infection. The mice immunized with rUreA+CTB, rUreB+CTB or sonicate of H.pylori+CTB were less infected with H.pylori, and had mild inflammation of gastric tissue. Conclusion Mice immunized with rUreA+CTB, rUreB+CTB or sonicate of H.pylori+CTB could not be completely protected against H.pylori infection and have alleviated inflammation of gastric tissue.
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【Key words】 Helicobactor pylori； Urease； Immunization
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是慢性胃炎的病因, 消化性溃疡的重要致病因素，同时Hp感染还与胃癌有关。目前，治疗Hp感染主要是抗生素、有机铋及抑酸剂联合治疗, 但耐药菌株迅速增多, 使治疗越来越困难, 同时还存在副作用较多、患者依从性差、经济负担大等弊端[1，2]，作为感染性疾病的病因，最经济、最有效的防治方案是疫苗研制。我们用小鼠的Hp感染模型结合病理学方法，评价基因重组Hp尿素酶A及B亚单位(recombinant urease subunint A or B, rUreA or rUreB)的免疫预防作用，同时观察其毒副作用。
材料与方法
一、材料
, 百拇医药 1.试剂：rUreA、rUreB、霍乱毒素B亚单位 (cholera toxin subunit B，CTB)。
2.动物：BALB/C小鼠180只，8周龄，雌性，中途死亡37只，补充7只，以满足各组实验要求。
3.Hp菌株：Hp SS1，由Adren Lee赠送。
二、方法
1.免疫接种：接种前禁食、禁水，按分组不同经胶管将不同物质接种入小鼠胃内，在第0、7、14、21天各接种1次。其中正常对照组(10只)接种150 ml磷酸盐缓冲液(BPS)，CTB对照组(10只)接种5 μg CTB，rUreA对照组(10只)接种50 μg rUreA，rUreB对照组(10只)接种50 μg rUreB，rUreA+CTB实验组(30只)接种50 μg rUreA及5 μg CTB，rUreB+CTB实验组(30只)接种50 μg rUreB及5 μg CTB，Hp超声粉碎物+CTB实验组(30只)接种400 μg Hp超声粉碎物及5 μg CTB。
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2.Hp攻击：将在羊血-改良布氏琼脂培养基上、微需氧环境培养2 d的Hp用PBS洗下，马上接种入以上各组小鼠胃内；在第35、37、39天各接种1次(107～108 CPU/次)。
3.rUreA、rUreB毒副作用研究：rUreA+CTB毒副作用组(10只)小鼠接种rUreA+CTB而不感染Hp，12周后断颈处死。rUreB+CTB毒副作用组(10只)小鼠接种rUreB+CTB而不感染Hp，12周后断颈处死。
4.小鼠胃组织切片制备：各对照组在感染Hp后12周，实验组小鼠在感染Hp后4、8、12周用断颈法分别处死，取出食管、胃、十二指肠常规制备病理切片。
5.Hp感染评价：每例胃组织切片Giemsa染色，油镜下观察10个胃小凹，参照Ferrero等[4]的方法，对小鼠胃组织感染Hp情况进行如下评分：0分：部分胃小凹有1～2条Hp，1分：大多数胃小凹有3～10条Hp，2分：所有胃小凹有成堆Hp。
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6.Hp感染后胃组织病理改变评价：每例胃组织切片HE染色，高倍镜下观察10个视野，参照Ferrero等[4]的方法，对小鼠感染Hp后胃组织病理改变进行如下评分：0分：在胃粘膜深部固有层有少许、散在淋巴细胞浸润，1分：在胃粘膜深部至中部固有层有中等程度淋巴细胞浸润，2分：在胃粘膜固有层全层有大量淋巴细胞浸润，个别在胃粘膜下有淋巴滤泡形成。
结果
1.正常小鼠胃粘膜无Hp。
2.感染Hp 12周后，阴性对照组6/10只鼠胃粘膜的胃小凹可见成堆Hp(图1),其余4只鼠胃粘膜的胃小凹有10条左右Hp，记1.6分。CTB组10/10只鼠、rUreA组10/10只鼠、rUreB组8/10只鼠的胃小凹可见8～10条左右Hp，分别记1.0、1.0、0.8分，都明显少于阴性对照组小鼠Hp感染数目，表明单独接种CTB、rUreA或rUreB可使免疫小鼠获得一定的免疫保护作用(表1)。
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3.感染Hp 4周后，rUreB+CTB组6/10只鼠、Hp超声粉碎物+CTB组6/10只鼠的胃小凹可见5～10条Hp，其余小鼠的胃小凹可见1～2条Hp，均记0.6分；感染Hp 8周后，rUreB+CTB组4/10只鼠、Hp超声粉碎物+CTB组6/10只鼠胃小凹可见3～5条Hp，其余小鼠的胃小凹可见1～2条Hp，分别记0.4、0.6分；感染Hp 12周后，rUreB+CTB组6/10只鼠、Hp超声粉碎物+CTB组6/10只鼠胃小凹可见1～2条Hp，其余小鼠的胃小凹可见3～5条Hp，均记0.4分。表明CTB能增强rUreB及Hp超声粉碎物免疫保护作用，在感染Hp 4周时，就能发挥免疫保护作用，而且接种时间越长，作用越强(表1)。
4.感染Hp 4周后，rUreA+CTB实验组6/10只鼠的胃小凹可见5～10条Hp，小鼠的胃小凹可见8～10条Hp，其余小鼠的胃小凹可见成堆Hp，记1.4分；感染Hp 8周后，8/10鼠胃小凹可见5～10条Hp，其余小鼠的胃小凹可见成堆Hp，记1.2分；感染Hp 12周后，4/10只鼠的胃小凹可见1～3条Hp，其余小鼠的胃小凹可见3～8条Hp，记0.6分。免疫接种rUreA+CTB要到感染Hp 12周后才能达到免疫接种rUreB+CTB或Hp超声粉碎物+CTB 8周的免疫效果，随接种时间延长，免疫保护作用增强(表1)。
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图1 阴性对照组小鼠感染Hp后12周胃粘膜，所有胃小凹、胃隐窝均可见成堆Hp Giemsa×1 000 图2 未感染Hp的正常小鼠胃粘膜，很少有淋巴细胞浸润 HE×100 图3 阴性对照组小鼠感染Hp 12周，胃粘膜全层有淋巴细胞浸润，并伴有淋巴滤泡形成 HE×100
表1 各组小鼠感染Hp 12周后，Hp感染评分 组 别
鼠数
不同感染评分鼠数
0分
1分
2分
阴性对照组
10
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0
4
6
CTB对照组
10
0
10
0
rUreA对照组
10
0
10
0
rUreB对照组
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10
2
8
0
超声粉碎组
10
6
4
0
rUreA+CTB实验组
10
4
6
0
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rUreB+CTB实验组
10
6
4
0
5.正常小鼠胃粘膜全层未见明显炎症细胞浸润、壁细胞脱落、表皮细胞过度增生等病理改变(图2)。
6.感染Hp 12周后，阴性对照组8/10只鼠胃粘膜固有层深部至中部有中等程度淋巴细胞浸润，其余小鼠胃粘膜则全层均有广泛淋巴细胞浸润, 其中1只小鼠的胃粘膜则全层均有广泛淋巴细胞浸润(图3)，并伴有淋巴滤泡形成,记1.2分。CTB组8/10只鼠、rUreA组6/10只鼠、rUreB组6/10只鼠胃粘膜固有层深部至中部有中等程度淋巴细胞浸润，其余小鼠的胃粘膜固有层深部有少许淋巴细胞浸润，分别记0.8、0.6、0.6分(表2)。
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7.感染Hp 4周后，rUreB+CTB组4/10只鼠、Hp超声粉碎物+CTB组3/10只鼠、rUreA+CTB实验组6/10只鼠的胃粘膜固有层深部至中部有中等程度淋巴细胞浸润，其余小鼠的胃粘膜固有层只有深层有散在淋巴细胞浸润，分别记0.4、0.4、0.6分；感染Hp 8周后，rUreB+CTB组4/10只鼠、Hp超声粉碎物+CTB、rUreA+CTB实验组小鼠的胃粘膜固有层深部至中部有中等程度淋巴细胞浸润，其余小鼠的胃粘膜固有层只有深层有散在淋巴细胞浸润，均记0.4分；感染Hp 12周后，rUreB+CTB组4/10只鼠、rUreA+CTB、Hp超声粉碎物+CTB组小鼠的胃粘膜固有层深部至中部有中等程度淋巴细胞浸润，6/10只鼠的胃粘膜固有层只有深层有散在淋巴细胞浸润，均记0.4分(表2)。
表2 各组小鼠感染Hp 12周后胃组织病理改变评分 组 别
鼠数
不同病理评分鼠数
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0分
1分
2分
阴性对照组
10
8
2
CTB对照组
10
2
8
0
rUreA对照组
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4
6
0
rUreB对照组
10
4
6
0
超声粉碎组
10
6
4
0
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rUreA+CTB实验组
10
6
4
0
rUreB+CTB实验组
10
6
4
0
8.接种rUreA+CTB或rUreB+CTB后12周后，rUreA+CTB毒副作用组有1只鼠，rUreB+CTB毒副作用组有2只鼠胃粘膜深部固有层有散在淋巴细胞浸润，与正常小鼠胃粘膜相比较没有明显差异。
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讨论
目前，治疗Hp感染及Hp感染作为感染性疾病，最有效、最简便、最可行的防治方法是用疫苗进行免疫防治。目前，国外研究了多种疫苗，而不论采用哪几种抗原，一般均包含Hp尿素酶。Hp尿素酶是Hp免疫防治的主要侯选疫苗，构成Hp免疫防治的基础[3，4]。
我们的研究显示，小鼠胃内接种rUreA+CTB或rUreB+CTB或Hp超声粉碎物+CTB，4周就显示出免疫保护作用：免疫小鼠胃内Hp感染数目减少，随时间延长，免疫效果越来越强；由于我们的观察时间有限，只证实12周后仍有免疫保护作用。国外研究发现，40周(相当于小鼠寿命的一半)后仍有免疫保护作用。各组小鼠感染Hp后12周胃粘膜Hp感染数目比较，阴性对照组小鼠的最多；rUreA、rUreB、CTB对照组小鼠其次，rUreA+CTB、rUreB+CTB、Hp超声粉碎物+CTB组小鼠的最少，表明单独接种rUreA或rUreB或CTB，有一定免疫保护作用，而且其免疫保护作用要到免疫接种12周后才明显显示出来；同时我们也发现，CTB不但能增强rUreA、rUreB的免疫保护作用，而且可以在接种6周，即可以在较短的时间内发挥免疫保护作用。CTB与rUreA、rUreB、Hp超声粉碎物结合，可以增加其分子量，更好地被M细胞摄取, 另外，CTB通过与胃肠道抗原呈递细胞的GM1神经节苷酯结合，直接介导rUreA、rUreB、超声粉碎物被抗原呈递细胞摄取，更好地刺激机体免疫反应，起着免疫增强作用[5，6]。
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我们发现rUreA、rUreB结合CTB不能使免疫小鼠完全免受Hp感染，只能使免疫小鼠Hp感染数目明显减少，与国外报道既有相符的一面(使免疫小鼠Hp感染数目明显减少)，也有不相符的一面(不能使免疫小鼠完全免受Hp感染)，这可能与以下原因有关：(1)国外评价Hp疫苗免疫效果，绝大多数使用快速尿素酶试验，这种方法虽然简便、快速，但最近的研究显示，其假阴性率较高，Hp感染数目较少时常检测不出来，在个别胃小凹、胃隐窝只有1～2条Hp情况下RUT常呈阴性，用这种方法获得的免疫保护率常偏高。(2)国外评价Hp疫苗免疫效果，绝大多数使用小鼠H.felis感染模型；H.felis与Hp的生物学特性、致病性等方面虽然有许多相似之处，但毕竟是二种不同的细菌，二者既有交叉免疫抗原成份，又有各自独特的抗原成份；Lee A等[7]给小鼠胃内接种H.felis超声粉碎抗原，发现96%小鼠可免受H.felis感染，而用H.felis超声粉碎抗原代替Hp超声粉碎抗原免疫小鼠，可使80%以上的小鼠得到保护，用小鼠H.felis感染模型评价Hp疫苗的免疫保护作用不完全合适。(3)国外与我们用不同的方法制备的rUreA、rUreB、rUre，在分子量、分子结构、抗原及免疫原性等方面不同，免疫保护作用也不可能相同；研究证实，分子量在250 000～550 000、分子大小5 nm左右的疫苗最容易被M细胞摄取，免疫效果最好。这也可以部分解释接种分子量较大的rUreB+CTB或Hp超声粉碎物+CTB在8周时就能发挥免疫保护作用，而接种分子量较小的rUreA+CTB要到12周后才能发挥明显的免疫保护作用；另外，不同Hp菌株的尿素酶的免疫性存在差异，使用不同Hp菌株克隆表达的rUreA、rUreB、rUre其免疫保护作用也不同[8-10]。
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各组小鼠胃粘膜炎症反应强弱比较，阴性对照组最强，rUreA、rUreB对照组第二，rUreB+CTB、rUreA+CTB、Hp超声粉碎物+CTB组最轻。炎症反应强弱与Hp感染情况呈正相关，表明rUreB+CTB、rUreA+CTB、Hp超声粉碎物+CTB不但能预防Hp感染，使Hp感染数目减少，而且能改善小鼠胃粘膜炎症反应，使淋巴细胞浸润减少。免疫小鼠胃粘膜炎症细胞浸润可能与以下原因有关：(1)小鼠接受免疫接种，全身及局部胃肠道粘膜淋巴组织受疫苗刺激，抗原呈递细胞、免疫效应细胞激活、增殖，表现在免疫小鼠胃粘膜组织切片上淋巴细胞浸润。(2)免疫小鼠感染Hp引起的免疫病理反应，除以上的抗原呈递细胞、免疫效应细胞外，还有巨噬细胞、中性粒细胞、单核细胞等炎性细胞浸润、趋化、聚集，Hp分泌的尿素酶、各种蛋白水解酶、细胞外毒素，炎性细胞释放的水解酶、溶菌酶，补体系统激活产生的过敏毒素也起到趋化炎性细胞的作用，使炎性细胞浸润大大加强；Hp感染的持续刺激,使炎性细胞浸润继续加重。临床实践也发现，Hp感染菌数越多，浸润的炎性细胞越多，抗Hp治疗不但能使Hp感染数目减少，而且使胃粘膜炎症反应减弱[7]。我们的研究显示，免疫接种rUreB+CTB、rUreA+CTB、Hp超声粉碎物+CTB的小鼠胃粘膜，不但Hp感染数目比对照组明显减少，而且胃粘膜炎症反应也比对照组明显减轻，不但没有随感染时间延长而加重，反而减轻许多，表明免疫小鼠感染Hp后出现的胃粘膜炎症反应主要以Hp感染引起的免疫病理反应为主，而以免疫接种后引起的抗原呈递细胞、免疫效应细胞激活、增殖为辅，胃粘膜炎症细胞浸润随Hp感染数目减少而减少。
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我们通过给小鼠胃内接种rUreA+CTB或rUreB+CTB而不感染Hp 的方法，研究rUreA+CTB、rUreB+CTB的毒副作用，发现12周后，个别小鼠胃粘膜深部固有层有散在淋巴细胞浸润，与未经处理的对照组小鼠胃粘膜相比较没有明显差异，除了进一步证实小鼠胃粘膜炎症反应主要是由Hp感染引起外，还表明给小鼠胃内接种rUreA+CTB、rUreB+CTB未引起明显的免疫病理损伤。目前认为，粗制抗原与纯化抗原相比较引起的毒副作用较严重；有分解尿素功能的尿素酶较没有分解功能的尿素酶的毒副作用严重；胃肠外接种途径较胃肠接种引起的毒副作用严重：引起的免疫反应不但不能使豚鼠免受Hp感染，反而产生了针对壁细胞H+、K+-ATP酶的自身抗体，并与补体结合，引起补体介导的免疫病理反应[11]。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39570334)
参考文献
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(收稿日期：2000-06-08), http://www.100md.com
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SHI Li WANG Jude CHEN Ye
(The Digestive Disease Institute of PLA, Nanfang Hospital, The Firest Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
【Abstract】 Objective To evaluate the immune prophylaxis of recombinant urease subunit A or B (rUreA or rUreB). Methods The BALB/C mice were divided into seven groups: negative control group, control group with CTB, control group with rUreA, control group with rUreB, experimental group with rUreA+CTB and experimental group with rUreB+CTB, experimental group with sonicate+CTB, which were gastrically inoculated with 150 ml PBS, 5 μg CTB, 50 μg rUreA, 50 μg rUreB, 50 μg rUreA+CTB, 5 μg rUreB+CTB and 400 μg sonicate+5 μg CTB, respectively. Two weeks later, the mice were gastrically infected with H.pylori (107～108 CPU per time). 4, 8 and 12 weeks later, the mice were killed and the immune protection of PBS, CTB, rUreA, rUreB, rUreA+CTB, rUreB+CTB and sonicate+CTB were evaluated by the presence of H.pylori in gastric tissue stained with Giemsa by microscopy. The mice in the side-effecting groups of rUreA+CTB and rUreB+CTB were not infected with H.pylori. 12 weeks later, the mice in the two groups were killed, and the side effects of rUreA+CTB and rUreB+CTB were evaluated by the infiltration of inflammation cells in gastric tissue stained with HE by microscopy. Results The mice gastrically inoculated with CTB, rUreA or rUreB had significantly less H.pylori. The immune protective effect of rUreA, rUreB or sonicate of H.pylori combined with CTB was stronger than that of rUreA, rUreB or sonicate of H.pylori alone. The immune protective effect of rUreA+CTB occurred later than that of rUreB+CTB or sonicate of H.pylori+CTB. The mice immunized with rUreA+CTB, rUreB+CTB or sonicate of H.pylori+CTB were not completely protected against H.pylori infection. The mice immunized with rUreA+CTB, rUreB+CTB or sonicate of H.pylori+CTB were less infected with H.pylori, and had mild inflammation of gastric tissue. Conclusion Mice immunized with rUreA+CTB, rUreB+CTB or sonicate of H.pylori+CTB could not be completely protected against H.pylori infection and have alleviated inflammation of gastric tissue.
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【Key words】 Helicobactor pylori； Urease； Immunization
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是慢性胃炎的病因, 消化性溃疡的重要致病因素，同时Hp感染还与胃癌有关。目前，治疗Hp感染主要是抗生素、有机铋及抑酸剂联合治疗, 但耐药菌株迅速增多, 使治疗越来越困难, 同时还存在副作用较多、患者依从性差、经济负担大等弊端[1，2]，作为感染性疾病的病因，最经济、最有效的防治方案是疫苗研制。我们用小鼠的Hp感染模型结合病理学方法，评价基因重组Hp尿素酶A及B亚单位(recombinant urease subunint A or B, rUreA or rUreB)的免疫预防作用，同时观察其毒副作用。
材料与方法
一、材料
, 百拇医药 1.试剂：rUreA、rUreB、霍乱毒素B亚单位 (cholera toxin subunit B，CTB)。
2.动物：BALB/C小鼠180只，8周龄，雌性，中途死亡37只，补充7只，以满足各组实验要求。
3.Hp菌株：Hp SS1，由Adren Lee赠送。
二、方法
1.免疫接种：接种前禁食、禁水，按分组不同经胶管将不同物质接种入小鼠胃内，在第0、7、14、21天各接种1次。其中正常对照组(10只)接种150 ml磷酸盐缓冲液(BPS)，CTB对照组(10只)接种5 μg CTB，rUreA对照组(10只)接种50 μg rUreA，rUreB对照组(10只)接种50 μg rUreB，rUreA+CTB实验组(30只)接种50 μg rUreA及5 μg CTB，rUreB+CTB实验组(30只)接种50 μg rUreB及5 μg CTB，Hp超声粉碎物+CTB实验组(30只)接种400 μg Hp超声粉碎物及5 μg CTB。
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2.Hp攻击：将在羊血-改良布氏琼脂培养基上、微需氧环境培养2 d的Hp用PBS洗下，马上接种入以上各组小鼠胃内；在第35、37、39天各接种1次(107～108 CPU/次)。
3.rUreA、rUreB毒副作用研究：rUreA+CTB毒副作用组(10只)小鼠接种rUreA+CTB而不感染Hp，12周后断颈处死。rUreB+CTB毒副作用组(10只)小鼠接种rUreB+CTB而不感染Hp，12周后断颈处死。
4.小鼠胃组织切片制备：各对照组在感染Hp后12周，实验组小鼠在感染Hp后4、8、12周用断颈法分别处死，取出食管、胃、十二指肠常规制备病理切片。
5.Hp感染评价：每例胃组织切片Giemsa染色，油镜下观察10个胃小凹，参照Ferrero等[4]的方法，对小鼠胃组织感染Hp情况进行如下评分：0分：部分胃小凹有1～2条Hp，1分：大多数胃小凹有3～10条Hp，2分：所有胃小凹有成堆Hp。
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6.Hp感染后胃组织病理改变评价：每例胃组织切片HE染色，高倍镜下观察10个视野，参照Ferrero等[4]的方法，对小鼠感染Hp后胃组织病理改变进行如下评分：0分：在胃粘膜深部固有层有少许、散在淋巴细胞浸润，1分：在胃粘膜深部至中部固有层有中等程度淋巴细胞浸润，2分：在胃粘膜固有层全层有大量淋巴细胞浸润，个别在胃粘膜下有淋巴滤泡形成。
结果
1.正常小鼠胃粘膜无Hp。
2.感染Hp 12周后，阴性对照组6/10只鼠胃粘膜的胃小凹可见成堆Hp(图1),其余4只鼠胃粘膜的胃小凹有10条左右Hp，记1.6分。CTB组10/10只鼠、rUreA组10/10只鼠、rUreB组8/10只鼠的胃小凹可见8～10条左右Hp，分别记1.0、1.0、0.8分，都明显少于阴性对照组小鼠Hp感染数目，表明单独接种CTB、rUreA或rUreB可使免疫小鼠获得一定的免疫保护作用(表1)。
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3.感染Hp 4周后，rUreB+CTB组6/10只鼠、Hp超声粉碎物+CTB组6/10只鼠的胃小凹可见5～10条Hp，其余小鼠的胃小凹可见1～2条Hp，均记0.6分；感染Hp 8周后，rUreB+CTB组4/10只鼠、Hp超声粉碎物+CTB组6/10只鼠胃小凹可见3～5条Hp，其余小鼠的胃小凹可见1～2条Hp，分别记0.4、0.6分；感染Hp 12周后，rUreB+CTB组6/10只鼠、Hp超声粉碎物+CTB组6/10只鼠胃小凹可见1～2条Hp，其余小鼠的胃小凹可见3～5条Hp，均记0.4分。表明CTB能增强rUreB及Hp超声粉碎物免疫保护作用，在感染Hp 4周时，就能发挥免疫保护作用，而且接种时间越长，作用越强(表1)。
4.感染Hp 4周后，rUreA+CTB实验组6/10只鼠的胃小凹可见5～10条Hp，小鼠的胃小凹可见8～10条Hp，其余小鼠的胃小凹可见成堆Hp，记1.4分；感染Hp 8周后，8/10鼠胃小凹可见5～10条Hp，其余小鼠的胃小凹可见成堆Hp，记1.2分；感染Hp 12周后，4/10只鼠的胃小凹可见1～3条Hp，其余小鼠的胃小凹可见3～8条Hp，记0.6分。免疫接种rUreA+CTB要到感染Hp 12周后才能达到免疫接种rUreB+CTB或Hp超声粉碎物+CTB 8周的免疫效果，随接种时间延长，免疫保护作用增强(表1)。
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图1 阴性对照组小鼠感染Hp后12周胃粘膜，所有胃小凹、胃隐窝均可见成堆Hp Giemsa×1 000 图2 未感染Hp的正常小鼠胃粘膜，很少有淋巴细胞浸润 HE×100 图3 阴性对照组小鼠感染Hp 12周，胃粘膜全层有淋巴细胞浸润，并伴有淋巴滤泡形成 HE×100
表1 各组小鼠感染Hp 12周后，Hp感染评分 组 别
鼠数
不同感染评分鼠数
0分
1分
2分
阴性对照组
10
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0
4
6
CTB对照组
10
0
10
0
rUreA对照组
10
0
10
0
rUreB对照组
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10
2
8
0
超声粉碎组
10
6
4
0
rUreA+CTB实验组
10
4
6
0
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rUreB+CTB实验组
10
6
4
0
5.正常小鼠胃粘膜全层未见明显炎症细胞浸润、壁细胞脱落、表皮细胞过度增生等病理改变(图2)。
6.感染Hp 12周后，阴性对照组8/10只鼠胃粘膜固有层深部至中部有中等程度淋巴细胞浸润，其余小鼠胃粘膜则全层均有广泛淋巴细胞浸润, 其中1只小鼠的胃粘膜则全层均有广泛淋巴细胞浸润(图3)，并伴有淋巴滤泡形成,记1.2分。CTB组8/10只鼠、rUreA组6/10只鼠、rUreB组6/10只鼠胃粘膜固有层深部至中部有中等程度淋巴细胞浸润，其余小鼠的胃粘膜固有层深部有少许淋巴细胞浸润，分别记0.8、0.6、0.6分(表2)。
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7.感染Hp 4周后，rUreB+CTB组4/10只鼠、Hp超声粉碎物+CTB组3/10只鼠、rUreA+CTB实验组6/10只鼠的胃粘膜固有层深部至中部有中等程度淋巴细胞浸润，其余小鼠的胃粘膜固有层只有深层有散在淋巴细胞浸润，分别记0.4、0.4、0.6分；感染Hp 8周后，rUreB+CTB组4/10只鼠、Hp超声粉碎物+CTB、rUreA+CTB实验组小鼠的胃粘膜固有层深部至中部有中等程度淋巴细胞浸润，其余小鼠的胃粘膜固有层只有深层有散在淋巴细胞浸润，均记0.4分；感染Hp 12周后，rUreB+CTB组4/10只鼠、rUreA+CTB、Hp超声粉碎物+CTB组小鼠的胃粘膜固有层深部至中部有中等程度淋巴细胞浸润，6/10只鼠的胃粘膜固有层只有深层有散在淋巴细胞浸润，均记0.4分(表2)。
表2 各组小鼠感染Hp 12周后胃组织病理改变评分 组 别
鼠数
不同病理评分鼠数
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0分
1分
2分
阴性对照组
10
8
2
CTB对照组
10
2
8
0
rUreA对照组
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4
6
0
rUreB对照组
10
4
6
0
超声粉碎组
10
6
4
0
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rUreA+CTB实验组
10
6
4
0
rUreB+CTB实验组
10
6
4
0
8.接种rUreA+CTB或rUreB+CTB后12周后，rUreA+CTB毒副作用组有1只鼠，rUreB+CTB毒副作用组有2只鼠胃粘膜深部固有层有散在淋巴细胞浸润，与正常小鼠胃粘膜相比较没有明显差异。
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讨论
目前，治疗Hp感染及Hp感染作为感染性疾病，最有效、最简便、最可行的防治方法是用疫苗进行免疫防治。目前，国外研究了多种疫苗，而不论采用哪几种抗原，一般均包含Hp尿素酶。Hp尿素酶是Hp免疫防治的主要侯选疫苗，构成Hp免疫防治的基础[3，4]。
我们的研究显示，小鼠胃内接种rUreA+CTB或rUreB+CTB或Hp超声粉碎物+CTB，4周就显示出免疫保护作用：免疫小鼠胃内Hp感染数目减少，随时间延长，免疫效果越来越强；由于我们的观察时间有限，只证实12周后仍有免疫保护作用。国外研究发现，40周(相当于小鼠寿命的一半)后仍有免疫保护作用。各组小鼠感染Hp后12周胃粘膜Hp感染数目比较，阴性对照组小鼠的最多；rUreA、rUreB、CTB对照组小鼠其次，rUreA+CTB、rUreB+CTB、Hp超声粉碎物+CTB组小鼠的最少，表明单独接种rUreA或rUreB或CTB，有一定免疫保护作用，而且其免疫保护作用要到免疫接种12周后才明显显示出来；同时我们也发现，CTB不但能增强rUreA、rUreB的免疫保护作用，而且可以在接种6周，即可以在较短的时间内发挥免疫保护作用。CTB与rUreA、rUreB、Hp超声粉碎物结合，可以增加其分子量，更好地被M细胞摄取, 另外，CTB通过与胃肠道抗原呈递细胞的GM1神经节苷酯结合，直接介导rUreA、rUreB、超声粉碎物被抗原呈递细胞摄取，更好地刺激机体免疫反应，起着免疫增强作用[5，6]。
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我们发现rUreA、rUreB结合CTB不能使免疫小鼠完全免受Hp感染，只能使免疫小鼠Hp感染数目明显减少，与国外报道既有相符的一面(使免疫小鼠Hp感染数目明显减少)，也有不相符的一面(不能使免疫小鼠完全免受Hp感染)，这可能与以下原因有关：(1)国外评价Hp疫苗免疫效果，绝大多数使用快速尿素酶试验，这种方法虽然简便、快速，但最近的研究显示，其假阴性率较高，Hp感染数目较少时常检测不出来，在个别胃小凹、胃隐窝只有1～2条Hp情况下RUT常呈阴性，用这种方法获得的免疫保护率常偏高。(2)国外评价Hp疫苗免疫效果，绝大多数使用小鼠H.felis感染模型；H.felis与Hp的生物学特性、致病性等方面虽然有许多相似之处，但毕竟是二种不同的细菌，二者既有交叉免疫抗原成份，又有各自独特的抗原成份；Lee A等[7]给小鼠胃内接种H.felis超声粉碎抗原，发现96%小鼠可免受H.felis感染，而用H.felis超声粉碎抗原代替Hp超声粉碎抗原免疫小鼠，可使80%以上的小鼠得到保护，用小鼠H.felis感染模型评价Hp疫苗的免疫保护作用不完全合适。(3)国外与我们用不同的方法制备的rUreA、rUreB、rUre，在分子量、分子结构、抗原及免疫原性等方面不同，免疫保护作用也不可能相同；研究证实，分子量在250 000～550 000、分子大小5 nm左右的疫苗最容易被M细胞摄取，免疫效果最好。这也可以部分解释接种分子量较大的rUreB+CTB或Hp超声粉碎物+CTB在8周时就能发挥免疫保护作用，而接种分子量较小的rUreA+CTB要到12周后才能发挥明显的免疫保护作用；另外，不同Hp菌株的尿素酶的免疫性存在差异，使用不同Hp菌株克隆表达的rUreA、rUreB、rUre其免疫保护作用也不同[8-10]。
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各组小鼠胃粘膜炎症反应强弱比较，阴性对照组最强，rUreA、rUreB对照组第二，rUreB+CTB、rUreA+CTB、Hp超声粉碎物+CTB组最轻。炎症反应强弱与Hp感染情况呈正相关，表明rUreB+CTB、rUreA+CTB、Hp超声粉碎物+CTB不但能预防Hp感染，使Hp感染数目减少，而且能改善小鼠胃粘膜炎症反应，使淋巴细胞浸润减少。免疫小鼠胃粘膜炎症细胞浸润可能与以下原因有关：(1)小鼠接受免疫接种，全身及局部胃肠道粘膜淋巴组织受疫苗刺激，抗原呈递细胞、免疫效应细胞激活、增殖，表现在免疫小鼠胃粘膜组织切片上淋巴细胞浸润。(2)免疫小鼠感染Hp引起的免疫病理反应，除以上的抗原呈递细胞、免疫效应细胞外，还有巨噬细胞、中性粒细胞、单核细胞等炎性细胞浸润、趋化、聚集，Hp分泌的尿素酶、各种蛋白水解酶、细胞外毒素，炎性细胞释放的水解酶、溶菌酶，补体系统激活产生的过敏毒素也起到趋化炎性细胞的作用，使炎性细胞浸润大大加强；Hp感染的持续刺激,使炎性细胞浸润继续加重。临床实践也发现，Hp感染菌数越多，浸润的炎性细胞越多，抗Hp治疗不但能使Hp感染数目减少，而且使胃粘膜炎症反应减弱[7]。我们的研究显示，免疫接种rUreB+CTB、rUreA+CTB、Hp超声粉碎物+CTB的小鼠胃粘膜，不但Hp感染数目比对照组明显减少，而且胃粘膜炎症反应也比对照组明显减轻，不但没有随感染时间延长而加重，反而减轻许多，表明免疫小鼠感染Hp后出现的胃粘膜炎症反应主要以Hp感染引起的免疫病理反应为主，而以免疫接种后引起的抗原呈递细胞、免疫效应细胞激活、增殖为辅，胃粘膜炎症细胞浸润随Hp感染数目减少而减少。
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我们通过给小鼠胃内接种rUreA+CTB或rUreB+CTB而不感染Hp 的方法，研究rUreA+CTB、rUreB+CTB的毒副作用，发现12周后，个别小鼠胃粘膜深部固有层有散在淋巴细胞浸润，与未经处理的对照组小鼠胃粘膜相比较没有明显差异，除了进一步证实小鼠胃粘膜炎症反应主要是由Hp感染引起外，还表明给小鼠胃内接种rUreA+CTB、rUreB+CTB未引起明显的免疫病理损伤。目前认为，粗制抗原与纯化抗原相比较引起的毒副作用较严重；有分解尿素功能的尿素酶较没有分解功能的尿素酶的毒副作用严重；胃肠外接种途径较胃肠接种引起的毒副作用严重：引起的免疫反应不但不能使豚鼠免受Hp感染，反而产生了针对壁细胞H+、K+-ATP酶的自身抗体，并与补体结合，引起补体介导的免疫病理反应[11]。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39570334)
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(收稿日期：2000-06-08), http://www.100md.com