富集CD34+细胞作干细胞移植的临床初步探索
作者：董陆佳 陈虎 江岷 胡亮钉 张伟京 鲍云华 俞受程 宋三泰 秦茂权 俞志勇 陈喜林 吴世凯 曹履先 朱平
单位：董陆佳(北太平路医院骨髓移植病房100039)陈虎(北太平路医院骨髓移植病房100039)；江岷(北太平路医院骨髓移植病房100039)；胡亮钉(北太平路医院骨髓移植病房100039)；秦茂权(北太平路医院骨髓移植病房100039)；俞志勇(北太平路医院骨髓移植病房100039)；曹履先(北太平路医院骨髓移植病房100039)；张伟京(肿瘤病房)；鲍云华(肿瘤病房)；俞受程(肿瘤病房)；宋三泰(肿瘤病房)；陈喜林(肿瘤病房)；吴世凯(肿瘤病房)；朱平(北京大学第一医院)
关键词：移植；自体；HLA抗原；肿瘤
中华医学杂志001112
【摘要】 目的 观察富集CD34+的造血干/祖细胞做肿瘤患者同种异基因造血干细胞移植(Allo-HSCT)和自体移植的临床疗效。观察输注纯化CD34+细胞患者的预后情况。方法 采用磁分选临床型细胞富集仪将表面包被有CD34单抗的磁性微球体系与细胞共同培养，特异性结合CD34+细胞。在磁场作用下分别收集CD34+和CD34-组分。完成20例患者CD34+细胞体外纯化富集。其中HLA半相合移植5例，自体移植15例。结果 纯化后CD34+细胞纯度达97%以上，移植CD34+细胞中位数5.72(0.15～12.0)×106，CD34+细胞中位数3.73(2.6～6.8)×104; CD34-细胞(CD3、CD4、CD8、CD19)对数去除率(Log,下同)为1.99～5.0。19例患者移植后随访11个月(中位数，1～20)，总体生存13/19(例)。本院11例中，总体生存为8/11(例)，其中HLA半相合1/3(例)，自体移植7/8(例)。移植后造血重建迅速，随访18个月以上无病生存者3例中1例为同种异基因HLA半相合亲属移植，2例为肿瘤自体移植。1例父子间HLA半相合移植, 白细胞恢复>1×109/L, 血小板>20×109/L(均为移植后第13天)。仅有短暂的I度移植物抗宿主疾病。2例自体移植病例白细胞恢复>1×109/L(8～26 d)，血小板恢复>20×109/L(22～35 d)。结论 无论是异体或自体移植，CD34+细胞移植后造血重建迅速，其白细胞, 血小板恢复天数同外周血移植。
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Selected CD34+ cells transplantation: a primary clinical report
DONG Lujia CHEN Hu JIANG Min
(Bone Marrow Transplantation Center, North Taiping Hospital, Beijing 100039, China)
【Abstract】 Objective CD34+ is an immunophenotype of hematopoietic stem cells/progenitors. CD34+ cells selection in vitro may deplete T-cells 4-5 logs and tumor cells 3-4 logs. It will benefit to mismatched related donor allo-transplantation and autologous transplantation of tumor diseases. Methods 19 patients aged 29 (5～52) years were treated by allo- (n=5) or auto-PB CD34+ cells transplantation (n=14). Grafts from fifteen patients with various disorders (3 lymphomas, 6 multiple myelomas, 2 SLE, 1 Sjogren's syndrome, 2 breast cancer and 1 medulloblastoma) and five haploidentical donors for leukemia patients (1 ALL-CR2, 2 AML-rel, 1 CML-CP and 1 MDS-RAEB) were isolated using magnetic-activated cell sorting (CliniMACS, Milteny Biotech, Germany). Results After separation, purity of CD34+ cells was >97 %. Depletion of CD34 negative cells was extensive: CD3+ 2.6～4.6 logs, CD4+ >5 logs, CD8+ 4.6- > 5 logs, and CD19+ 1.2～3.1 logs. 19 patients who received selected CD34+ cells transplantation (CD34+CT) were followed up for 11(1～20) months. Overall survival(OS) was 13/19 (68.4%) cases. 1/5 patients with haploidentical transplant had disease free survival for 19 months. 12/14(85.7%) auto-CD34+CT achieved overall survival(OS). Conclusion Selected CD34+ cells transplantation significantly decreases the incidence of >Ⅱ GVHD and depletes tumor cell contamination. This approach may be useful to haploidentical or unrelated donor transplantation. It also benefits autologous transplant in various tumor disorders.
, 百拇医药
【Key words】 Transplantation, autologous； HLA antigens； Neoplasms
造血干细胞移植是恶性血液病和某些实体瘤的主要治疗手段之一。造血干/祖细胞主要存在于CD34+细胞，移植物经阳性选择CD34+细胞的方法去除CD34-肿瘤细胞，有可能使那些肿瘤伴骨髓浸润的患者重获康复。耐药病例早期施行大剂量强烈化疗加用CD34+移植，可望延长生存期。1997年国外77个研究单位相继报道了623例异体CD34+细胞移植。我院自1998年引进临床型CD34+细胞体外纯化富集仪之后，至今已应用于人类白细胞抗原(HLA)半相合异体移植和自体移植。现将初步临床移植结果报道如下。
对象和方法
一、病例选择
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自1998年12月以来完成20例患者CD34+细胞体外纯化富集，其中同种异基因HLA半相合亲属移植5例(急性粒细胞白血病复发难治型2例，急性淋巴细胞白血病，慢性粒细胞白 血病，骨髓增生异常综合征各1例)；自体移植15例(淋巴瘤3例，多发性骨髓瘤6例、乳癌ⅡA 2例、髓母细胞瘤Ⅳ 1例、红斑狼疮2例、Sjogren's综合征1例)。患者年龄29(5～52)岁；男女比例1.5∶1；已完成CD34+细胞临床移植19例(1例淋巴瘤完成CD34+细胞体外纯化富集后因故未行移植)。其中在本院住院11例(HLA半相合移植3例，肿瘤自体造血干细胞移植8例)，其中3例随访18个月以上。
二、CD34+细胞纯化富集
收集经CS 3000白细胞分离机采集的外周血白细胞，根据单个核细胞计数(MNC)，CD34+ 细胞检测结果，算出CD34+ 细胞数；然后用含人血清白蛋白的PBS /EDTA缓冲液进行稀释。调整细胞悬液中MNC数量4×1010，其中CD34+ 细胞约4×108；加入CD34单抗，室温条件下共培养30 min，洗涤2次；经磁分选临床型细胞富集仪分选：选择细胞分离程序；样品上柱；启动自动分选程序；完成分选之后，取下CD34+ 细胞富集袋，分别检测CD34+ 组，CD34- 组以及洗脱液中各组细胞亚群的百分比，绝对数量，细胞活率。计算出MNC总量和CD34+ 细胞总量，回收率，纯度等指标。
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三、临床移植观察
1.异体移植：患者经预处理后输入纯化的CD34+ 细胞，无移植物抗宿主疾病(GVHD)预防用药，第6天应用造血生长因子粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；观察造血重建天数，植入率以及GVHD发生率及严重度。移植物抗白血病(GVL)效应。后期监测指标包括：慢性GVHD,恶性疾病复发率，无病生存期以及总体生存率等。
2.肿瘤自体移植: 患者经大剂量放疗+化疗或全身化疗方案预处理后，回输自体纯化的CD34+ 细胞，观察造血恢复天数，随访指标：肿瘤微小残留疾病监测，肿瘤复发率无病生存率以及总体生存率。
3.移植后供/受者嵌合状态检测：供/受者性别不同时，采用细胞遗传学检测，分析性染色体比例；供/受者性别相同时通过微卫星基因分析(DNA指纹图)作为移植证据。供/受者血型不相合时，也采用红细胞血型检测。
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结果
一、CD34+ 细胞磁分选效果
20例患者移植物经处理后，CD34+ 细胞纯度>97%、CD34-细胞对数去除率(CD3、CD4、CD8、CD19)Log1.99～5 Log，移植CD34+ 细胞中位数5.72(0.15～12.0)×106，CD3+细胞中位数3.73(2.6～6.8)×104; 移植后造血重建迅速。
二、随访结果
19例患者移植后随访11(中位数，1-20)个月，总体生存率13/19(例)。其中，HLA半相合移植1/5(例)，肿瘤自体移植12/14(例)，在住院的病例中，总体生存为8/11(例)，其中HLA半相合为1/3(例)，自体移植7/8(例)。
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三、典型病例分析
HLA半相合移植病例1 男，11岁，急性淋巴细胞白血病(急淋)二次缓解(ALL-CR2), 1993年12月始无诱因发热，颈侧淋巴结肿。1994年3月经骨髓穿刺诊为急淋(ALL-L1)，经环磷酰胺、长春新碱、柔红霉素、强的松(CODP)1个疗程获完全缓解，白细胞最高为13×109/L，无纵膈增宽，肝脾均不肿大，经序贯联合化疗3年，腰穿鞘内注射及颅脑脊髓照射维持持续缓解。至1998年4月出现睾丸及中枢神经系统白血病(CNSL)，随后血液系统白血病复发，再次经CODP+左旋门冬酰胺酶 1疗程获二次缓解，为寻求根治性治疗要求父给子的HLA半相合移植。移植前诊断：(1)ALL-L1 二次缓解；(2)CNSL颅脑脊髓放疗后早期复发；(3)睾丸白血病放疗后；父子HLA配型如表1所示。
表1 例1 HLA半相合异体移植患者供受者HLA配型
年龄
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关系
HLA-B
B
DRB1
DQB1
DPB1
受者
11
患者
11，；
38，75(15)；
16，15；
05，06；
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5，；
供者
37
父亲
11，；
38，62(15)；
16，04；
05，03；
5，4；
供者经G-CSF 300 μg 1次/d、皮下注射、6天动员，采集两次外周血细胞(PBPC)，供者细胞70 ml用于CD34+ 细胞体外纯化富集，处理前后细胞表型分析, 细胞分选效果如表2所示。表2 例1HLA半相合异体移植细胞细胞富集仪分选纯化处理前后比较 分型
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处理前
处理后
纯化效果
采集细胞(108)
平均数(106/kg)
获得细胞(106)
平均数(104/kg)
纯化率(%)
回收率(%)
去除率(log)
CD34
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3.696
9.7
183
483
97.1
49.59
-
CD4
114.35
300.9
0
0
-
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0
>5
CD8
72.38
190.5
0.189
0.497
-
0.000 026
4.58
CD3
207.1
545
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0.566
1.49
-
0.000 02
4.56
CD19
55.83
146.9
4.9
12.9
-
0.000 878
3.1
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MNC
385
9.73
188.6
496
-
0.005 4
2.3
注：平均细胞数/kg按照可回输患者的体重计算；MNC:单个核细胞 分选之后CD34+ 细胞纯度由0.9%～1.2 % 提高到97.1 %；而CD34- 细胞获3.1～>5个对数的去除。预处理采用环磷酰胺(CY) 60 mg /kg(2 d)，全身照射(TBI )5 Gy(2 d)，卡氮芥(BCNU )500 mg/m2。输入供者MNC 4.96×106/kg, CD34+ 细胞总量4.82×106/kg，CD3+细胞总量1.49×104/kg。GVHD预防采用环孢霉素A和氨甲喋呤(MTX)。移植后13 d造血重建。14～15 d，出现双手背及两侧骼前皮肤局限性皮疹，病理活检证实为Ⅰ度GVHD，皮疹面积<1%。由于移植21 d后出现继发性移植排斥，血象减低，故于移植后51 d给予行二次移植，移植前给CY 40 mg /kg×2次，0 d(一次移植后51 d)给予冷冻的动员后外周血干细胞30 ml; 及移植后1 d(52 d)给予供者骨髓400 ml; 回输MNC 3.63×108/kg, CD34+细胞总量9.9×106/kg，CD3+细胞>13.2×106/kg; 移植物未经体外处理。2次移植后15 d造血重建，随访2个月无急性GVHD，经指纹图谱分析供受者血样证实植入成功。2次移植后51 d出院，出院时血红蛋白67 g/L，血小板59×109/L，白细胞4.9×109/L，骨髓增生活跃。19个月仍无病生存(DFS)。血红蛋白101～118 g/L，白细胞5.7～7.3×109/L，血小板109～120×109/L。
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自体移植：病例1 男，49岁，多发性骨髓瘤 病史40个月。患者于1995年8月发病。CT扫描示胸5椎体肿瘤，脊柱压迫症，1995年11月17日行胸5椎体病灶清除术。经M2，长春新碱、博来霉素、阿霉素(VDD)等联合化疗18个疗程，胸椎放疗DT 4 000 cGy,DA 6 400 cGy后IgG 仍58 g/L，骨髓瘤细胞3%～13%。多发性骨髓瘤未缓解。行外周血干细胞动员采集，G-CSF 500 μg皮下注射1次/d(8 d)，MNC 5.9×108/kg, CD34+ 细胞0.46×106/kg。CD34+ 细胞体外纯化富集, 获CD34+ 细胞0.295×106/kg，回收率64%。CD34+、CD34-细胞组分及第3次采集之细胞分别冷冻保存。移植经马法兰200 mg/m2(总量350 mg)单药口服预处理，次日回输CD34+ 细胞0.295×106/kg。移植后5 d始用G-CSF 300 μg皮下注射1次/d;移植后10 d出现发热寒战，抗感染后症状控制，移植后45 d血象白细胞>2.0×109/L, 血小板>40×109/L。骨髓增生减低。移植后20个月一般情况稳定，骨髓象正常。
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自体移植：病例2 男，23岁，淋巴瘤 患者于1997年7月始出现右颈部无痛性包块，经病理活检诊断为霍奇金病结节硬化型ⅡA，联合化疗6个疗程达完全缓解，停药2个月后右颈包块复发，再用CHOP，COAP+鬼臼乙甙两周达完全缓解，1998年10月始先后出现右腋下、右颈部、右胸壁包块，伴右壁疼痛。经化疗和G-CSF动员方案, 行外周血干细胞动员采集两次。 CD34+ 细胞体外纯化富集后检测CD34+，CD34-以及洗脱液中各组细胞亚群，MNC总量和CD34+ 细胞总量，回收率，纯度等指标。细胞冷冻保存。二次入院后给CBV预处理方案后回输自体CD34+ 细胞，MNC总量为3.04×106/kg及CD34+ 细胞2.99×106/kg。移植后8 d造血恢复，术后行右肩、右胸壁肿物局部电子线治疗。移植后17个月病情稳定，骨髓象正常。
讨论
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CD34+ 细胞移植自1994年首次应用于临床移植以来，已在同种异基因移植以及自体移植方面有了显著发展[1-6]。新近，CD34+ 细胞移植应用于HLA不全相合，半相合亲属供者移植以及HLA相合无关供者移植例数逐渐增加。在拓宽亲属供者来源(HLA位点不相合或半相合移植)以及提高无关供者移植安全性方面做出了许多成功的尝试[7，8]。我们用临床型CD34+ 细胞体外纯化富集仪为20例患者做干细胞移植，移植物经处理后，CD34+ 细胞纯度>97%、CD34-细胞去除率Log1.99～5，符合临床移植需要；在HLA半相合移植中，由于体外CD34+ 细胞纯化富集的应用，CD3+细胞控制在104/kg水平，故临床仅表现为0～I度GVHD，移植安全性好。无论是异体或自体移植，CD34+ 细胞移植后造血重建迅速，其白细胞、血小板恢复天数同外周血移植。我国每年需要同种异基因造血干细胞移植的病例中，找到HLA完全相合的供者比例很低。今后寻找供者的工作更为困难。在我国一对夫妇只要一个子女的国情条件下，着力研究HLA不完全相合，半相合以及无关供者同种异基因移植势在必行。纯化的CD34+ 细胞移植，可降低此类高危移植的危险性，降低GVHD的发生率和严重度，从而拓宽移植供者的选择范围。采用体外阳性选择CD34+ 造血干/祖细胞进行临床移植，由于肿瘤细胞和成熟的免疫活性细胞(T细胞)无此种表面抗原表达，故而经此种体外纯化富集处理可去除移植物中肿瘤细胞污染，降低自体移植后肿瘤复发率。CD34+ 自体移植适用于轻-中度骨髓或外周血肿瘤污染的恶性疾病(CD34-)；拓宽自体造血干细胞移植的适应范围；移植后造血重建迅速且基本不影响免疫重建。
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参考文献
1，Link H, Aseniev L, Bahre O, et al. Transplantation of allogeneic CD34+ blood cells. Blood , 1996 , 87:4903-4909.
2，Bensinger WI, Buckner CD, Shannon-Dorcy K, et al. Transplantation of allogeneic CD34+ peripheral blood stem cells in patients with advanced hematologic malignancy. Blood , 1996,88:4132-4138.
3，Finke J, Brugger W, Beitz H, et al. Allogeneic transplantation of positively selected peripheral blood CD34+ progenitor cells from matched related donors. Bone marrow Transpl, 1996,18:1081-1086.
, 百拇医药
4，Urbano-Ispizua A, Roxman C, Martinez C, et al. Rapid engraftment without significant graft-versus-host disease after allogeneice transplantation of CD34+ selected cells from peripheral blood. Blood , 1997,89;3967-3973.
5，Gazitt Y, Reading CC, Hoffman R, et al. Purified CD34+ Lin- Thy+ stem cells do not contain clonal myeloma cells. Blood , 1995,86:381-389.
6，董陆佳.肿瘤大剂量化疗加自体移植研究进展——第38届美国血液学年会介绍. 中华肿瘤杂志, 1997,19:398-400.
7，董陆佳.异基因骨髓移植的研究概况——第39届美国血液学年会介绍. 中华血液学杂志，1998,19:667-669.
8，Handgretinger R, Schumm M, Lang P, et al. Transplantation with megadoses of haploidentical mobilized stem cells highly purified by magnetic-activited cell sorting. Blood ,1998,92 suppl1:688a.
(收稿日期：1999-09-16), 百拇医药
单位：董陆佳(北太平路医院骨髓移植病房100039)陈虎(北太平路医院骨髓移植病房100039)；江岷(北太平路医院骨髓移植病房100039)；胡亮钉(北太平路医院骨髓移植病房100039)；秦茂权(北太平路医院骨髓移植病房100039)；俞志勇(北太平路医院骨髓移植病房100039)；曹履先(北太平路医院骨髓移植病房100039)；张伟京(肿瘤病房)；鲍云华(肿瘤病房)；俞受程(肿瘤病房)；宋三泰(肿瘤病房)；陈喜林(肿瘤病房)；吴世凯(肿瘤病房)；朱平(北京大学第一医院)
关键词：移植；自体；HLA抗原；肿瘤
中华医学杂志001112
【摘要】 目的 观察富集CD34+的造血干/祖细胞做肿瘤患者同种异基因造血干细胞移植(Allo-HSCT)和自体移植的临床疗效。观察输注纯化CD34+细胞患者的预后情况。方法 采用磁分选临床型细胞富集仪将表面包被有CD34单抗的磁性微球体系与细胞共同培养，特异性结合CD34+细胞。在磁场作用下分别收集CD34+和CD34-组分。完成20例患者CD34+细胞体外纯化富集。其中HLA半相合移植5例，自体移植15例。结果 纯化后CD34+细胞纯度达97%以上，移植CD34+细胞中位数5.72(0.15～12.0)×106，CD34+细胞中位数3.73(2.6～6.8)×104; CD34-细胞(CD3、CD4、CD8、CD19)对数去除率(Log,下同)为1.99～5.0。19例患者移植后随访11个月(中位数，1～20)，总体生存13/19(例)。本院11例中，总体生存为8/11(例)，其中HLA半相合1/3(例)，自体移植7/8(例)。移植后造血重建迅速，随访18个月以上无病生存者3例中1例为同种异基因HLA半相合亲属移植，2例为肿瘤自体移植。1例父子间HLA半相合移植, 白细胞恢复>1×109/L, 血小板>20×109/L(均为移植后第13天)。仅有短暂的I度移植物抗宿主疾病。2例自体移植病例白细胞恢复>1×109/L(8～26 d)，血小板恢复>20×109/L(22～35 d)。结论 无论是异体或自体移植，CD34+细胞移植后造血重建迅速，其白细胞, 血小板恢复天数同外周血移植。
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Selected CD34+ cells transplantation: a primary clinical report
DONG Lujia CHEN Hu JIANG Min
(Bone Marrow Transplantation Center, North Taiping Hospital, Beijing 100039, China)
【Abstract】 Objective CD34+ is an immunophenotype of hematopoietic stem cells/progenitors. CD34+ cells selection in vitro may deplete T-cells 4-5 logs and tumor cells 3-4 logs. It will benefit to mismatched related donor allo-transplantation and autologous transplantation of tumor diseases. Methods 19 patients aged 29 (5～52) years were treated by allo- (n=5) or auto-PB CD34+ cells transplantation (n=14). Grafts from fifteen patients with various disorders (3 lymphomas, 6 multiple myelomas, 2 SLE, 1 Sjogren's syndrome, 2 breast cancer and 1 medulloblastoma) and five haploidentical donors for leukemia patients (1 ALL-CR2, 2 AML-rel, 1 CML-CP and 1 MDS-RAEB) were isolated using magnetic-activated cell sorting (CliniMACS, Milteny Biotech, Germany). Results After separation, purity of CD34+ cells was >97 %. Depletion of CD34 negative cells was extensive: CD3+ 2.6～4.6 logs, CD4+ >5 logs, CD8+ 4.6- > 5 logs, and CD19+ 1.2～3.1 logs. 19 patients who received selected CD34+ cells transplantation (CD34+CT) were followed up for 11(1～20) months. Overall survival(OS) was 13/19 (68.4%) cases. 1/5 patients with haploidentical transplant had disease free survival for 19 months. 12/14(85.7%) auto-CD34+CT achieved overall survival(OS). Conclusion Selected CD34+ cells transplantation significantly decreases the incidence of >Ⅱ GVHD and depletes tumor cell contamination. This approach may be useful to haploidentical or unrelated donor transplantation. It also benefits autologous transplant in various tumor disorders.
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【Key words】 Transplantation, autologous； HLA antigens； Neoplasms
造血干细胞移植是恶性血液病和某些实体瘤的主要治疗手段之一。造血干/祖细胞主要存在于CD34+细胞，移植物经阳性选择CD34+细胞的方法去除CD34-肿瘤细胞，有可能使那些肿瘤伴骨髓浸润的患者重获康复。耐药病例早期施行大剂量强烈化疗加用CD34+移植，可望延长生存期。1997年国外77个研究单位相继报道了623例异体CD34+细胞移植。我院自1998年引进临床型CD34+细胞体外纯化富集仪之后，至今已应用于人类白细胞抗原(HLA)半相合异体移植和自体移植。现将初步临床移植结果报道如下。
对象和方法
一、病例选择
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自1998年12月以来完成20例患者CD34+细胞体外纯化富集，其中同种异基因HLA半相合亲属移植5例(急性粒细胞白血病复发难治型2例，急性淋巴细胞白血病，慢性粒细胞白 血病，骨髓增生异常综合征各1例)；自体移植15例(淋巴瘤3例，多发性骨髓瘤6例、乳癌ⅡA 2例、髓母细胞瘤Ⅳ 1例、红斑狼疮2例、Sjogren's综合征1例)。患者年龄29(5～52)岁；男女比例1.5∶1；已完成CD34+细胞临床移植19例(1例淋巴瘤完成CD34+细胞体外纯化富集后因故未行移植)。其中在本院住院11例(HLA半相合移植3例，肿瘤自体造血干细胞移植8例)，其中3例随访18个月以上。
二、CD34+细胞纯化富集
收集经CS 3000白细胞分离机采集的外周血白细胞，根据单个核细胞计数(MNC)，CD34+ 细胞检测结果，算出CD34+ 细胞数；然后用含人血清白蛋白的PBS /EDTA缓冲液进行稀释。调整细胞悬液中MNC数量4×1010，其中CD34+ 细胞约4×108；加入CD34单抗，室温条件下共培养30 min，洗涤2次；经磁分选临床型细胞富集仪分选：选择细胞分离程序；样品上柱；启动自动分选程序；完成分选之后，取下CD34+ 细胞富集袋，分别检测CD34+ 组，CD34- 组以及洗脱液中各组细胞亚群的百分比，绝对数量，细胞活率。计算出MNC总量和CD34+ 细胞总量，回收率，纯度等指标。
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三、临床移植观察
1.异体移植：患者经预处理后输入纯化的CD34+ 细胞，无移植物抗宿主疾病(GVHD)预防用药，第6天应用造血生长因子粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；观察造血重建天数，植入率以及GVHD发生率及严重度。移植物抗白血病(GVL)效应。后期监测指标包括：慢性GVHD,恶性疾病复发率，无病生存期以及总体生存率等。
2.肿瘤自体移植: 患者经大剂量放疗+化疗或全身化疗方案预处理后，回输自体纯化的CD34+ 细胞，观察造血恢复天数，随访指标：肿瘤微小残留疾病监测，肿瘤复发率无病生存率以及总体生存率。
3.移植后供/受者嵌合状态检测：供/受者性别不同时，采用细胞遗传学检测，分析性染色体比例；供/受者性别相同时通过微卫星基因分析(DNA指纹图)作为移植证据。供/受者血型不相合时，也采用红细胞血型检测。
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结果
一、CD34+ 细胞磁分选效果
20例患者移植物经处理后，CD34+ 细胞纯度>97%、CD34-细胞对数去除率(CD3、CD4、CD8、CD19)Log1.99～5 Log，移植CD34+ 细胞中位数5.72(0.15～12.0)×106，CD3+细胞中位数3.73(2.6～6.8)×104; 移植后造血重建迅速。
二、随访结果
19例患者移植后随访11(中位数，1-20)个月，总体生存率13/19(例)。其中，HLA半相合移植1/5(例)，肿瘤自体移植12/14(例)，在住院的病例中，总体生存为8/11(例)，其中HLA半相合为1/3(例)，自体移植7/8(例)。
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三、典型病例分析
HLA半相合移植病例1 男，11岁，急性淋巴细胞白血病(急淋)二次缓解(ALL-CR2), 1993年12月始无诱因发热，颈侧淋巴结肿。1994年3月经骨髓穿刺诊为急淋(ALL-L1)，经环磷酰胺、长春新碱、柔红霉素、强的松(CODP)1个疗程获完全缓解，白细胞最高为13×109/L，无纵膈增宽，肝脾均不肿大，经序贯联合化疗3年，腰穿鞘内注射及颅脑脊髓照射维持持续缓解。至1998年4月出现睾丸及中枢神经系统白血病(CNSL)，随后血液系统白血病复发，再次经CODP+左旋门冬酰胺酶 1疗程获二次缓解，为寻求根治性治疗要求父给子的HLA半相合移植。移植前诊断：(1)ALL-L1 二次缓解；(2)CNSL颅脑脊髓放疗后早期复发；(3)睾丸白血病放疗后；父子HLA配型如表1所示。
表1 例1 HLA半相合异体移植患者供受者HLA配型
年龄
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关系
HLA-B
B
DRB1
DQB1
DPB1
受者
11
患者
11，；
38，75(15)；
16，15；
05，06；
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5，；
供者
37
父亲
11，；
38，62(15)；
16，04；
05，03；
5，4；
供者经G-CSF 300 μg 1次/d、皮下注射、6天动员，采集两次外周血细胞(PBPC)，供者细胞70 ml用于CD34+ 细胞体外纯化富集，处理前后细胞表型分析, 细胞分选效果如表2所示。表2 例1HLA半相合异体移植细胞细胞富集仪分选纯化处理前后比较 分型
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处理前
处理后
纯化效果
采集细胞(108)
平均数(106/kg)
获得细胞(106)
平均数(104/kg)
纯化率(%)
回收率(%)
去除率(log)
CD34
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3.696
9.7
183
483
97.1
49.59
-
CD4
114.35
300.9
0
0
-
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0
>5
CD8
72.38
190.5
0.189
0.497
-
0.000 026
4.58
CD3
207.1
545
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0.566
1.49
-
0.000 02
4.56
CD19
55.83
146.9
4.9
12.9
-
0.000 878
3.1
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MNC
385
9.73
188.6
496
-
0.005 4
2.3
注：平均细胞数/kg按照可回输患者的体重计算；MNC:单个核细胞 分选之后CD34+ 细胞纯度由0.9%～1.2 % 提高到97.1 %；而CD34- 细胞获3.1～>5个对数的去除。预处理采用环磷酰胺(CY) 60 mg /kg(2 d)，全身照射(TBI )5 Gy(2 d)，卡氮芥(BCNU )500 mg/m2。输入供者MNC 4.96×106/kg, CD34+ 细胞总量4.82×106/kg，CD3+细胞总量1.49×104/kg。GVHD预防采用环孢霉素A和氨甲喋呤(MTX)。移植后13 d造血重建。14～15 d，出现双手背及两侧骼前皮肤局限性皮疹，病理活检证实为Ⅰ度GVHD，皮疹面积<1%。由于移植21 d后出现继发性移植排斥，血象减低，故于移植后51 d给予行二次移植，移植前给CY 40 mg /kg×2次，0 d(一次移植后51 d)给予冷冻的动员后外周血干细胞30 ml; 及移植后1 d(52 d)给予供者骨髓400 ml; 回输MNC 3.63×108/kg, CD34+细胞总量9.9×106/kg，CD3+细胞>13.2×106/kg; 移植物未经体外处理。2次移植后15 d造血重建，随访2个月无急性GVHD，经指纹图谱分析供受者血样证实植入成功。2次移植后51 d出院，出院时血红蛋白67 g/L，血小板59×109/L，白细胞4.9×109/L，骨髓增生活跃。19个月仍无病生存(DFS)。血红蛋白101～118 g/L，白细胞5.7～7.3×109/L，血小板109～120×109/L。
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自体移植：病例1 男，49岁，多发性骨髓瘤 病史40个月。患者于1995年8月发病。CT扫描示胸5椎体肿瘤，脊柱压迫症，1995年11月17日行胸5椎体病灶清除术。经M2，长春新碱、博来霉素、阿霉素(VDD)等联合化疗18个疗程，胸椎放疗DT 4 000 cGy,DA 6 400 cGy后IgG 仍58 g/L，骨髓瘤细胞3%～13%。多发性骨髓瘤未缓解。行外周血干细胞动员采集，G-CSF 500 μg皮下注射1次/d(8 d)，MNC 5.9×108/kg, CD34+ 细胞0.46×106/kg。CD34+ 细胞体外纯化富集, 获CD34+ 细胞0.295×106/kg，回收率64%。CD34+、CD34-细胞组分及第3次采集之细胞分别冷冻保存。移植经马法兰200 mg/m2(总量350 mg)单药口服预处理，次日回输CD34+ 细胞0.295×106/kg。移植后5 d始用G-CSF 300 μg皮下注射1次/d;移植后10 d出现发热寒战，抗感染后症状控制，移植后45 d血象白细胞>2.0×109/L, 血小板>40×109/L。骨髓增生减低。移植后20个月一般情况稳定，骨髓象正常。
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自体移植：病例2 男，23岁，淋巴瘤 患者于1997年7月始出现右颈部无痛性包块，经病理活检诊断为霍奇金病结节硬化型ⅡA，联合化疗6个疗程达完全缓解，停药2个月后右颈包块复发，再用CHOP，COAP+鬼臼乙甙两周达完全缓解，1998年10月始先后出现右腋下、右颈部、右胸壁包块，伴右壁疼痛。经化疗和G-CSF动员方案, 行外周血干细胞动员采集两次。 CD34+ 细胞体外纯化富集后检测CD34+，CD34-以及洗脱液中各组细胞亚群，MNC总量和CD34+ 细胞总量，回收率，纯度等指标。细胞冷冻保存。二次入院后给CBV预处理方案后回输自体CD34+ 细胞，MNC总量为3.04×106/kg及CD34+ 细胞2.99×106/kg。移植后8 d造血恢复，术后行右肩、右胸壁肿物局部电子线治疗。移植后17个月病情稳定，骨髓象正常。
讨论
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CD34+ 细胞移植自1994年首次应用于临床移植以来，已在同种异基因移植以及自体移植方面有了显著发展[1-6]。新近，CD34+ 细胞移植应用于HLA不全相合，半相合亲属供者移植以及HLA相合无关供者移植例数逐渐增加。在拓宽亲属供者来源(HLA位点不相合或半相合移植)以及提高无关供者移植安全性方面做出了许多成功的尝试[7，8]。我们用临床型CD34+ 细胞体外纯化富集仪为20例患者做干细胞移植，移植物经处理后，CD34+ 细胞纯度>97%、CD34-细胞去除率Log1.99～5，符合临床移植需要；在HLA半相合移植中，由于体外CD34+ 细胞纯化富集的应用，CD3+细胞控制在104/kg水平，故临床仅表现为0～I度GVHD，移植安全性好。无论是异体或自体移植，CD34+ 细胞移植后造血重建迅速，其白细胞、血小板恢复天数同外周血移植。我国每年需要同种异基因造血干细胞移植的病例中，找到HLA完全相合的供者比例很低。今后寻找供者的工作更为困难。在我国一对夫妇只要一个子女的国情条件下，着力研究HLA不完全相合，半相合以及无关供者同种异基因移植势在必行。纯化的CD34+ 细胞移植，可降低此类高危移植的危险性，降低GVHD的发生率和严重度，从而拓宽移植供者的选择范围。采用体外阳性选择CD34+ 造血干/祖细胞进行临床移植，由于肿瘤细胞和成熟的免疫活性细胞(T细胞)无此种表面抗原表达，故而经此种体外纯化富集处理可去除移植物中肿瘤细胞污染，降低自体移植后肿瘤复发率。CD34+ 自体移植适用于轻-中度骨髓或外周血肿瘤污染的恶性疾病(CD34-)；拓宽自体造血干细胞移植的适应范围；移植后造血重建迅速且基本不影响免疫重建。
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参考文献
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7，董陆佳.异基因骨髓移植的研究概况——第39届美国血液学年会介绍. 中华血液学杂志，1998,19:667-669.
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(收稿日期：1999-09-16), 百拇医药