自体骨骼肌卫星细胞移植治疗急性心肌梗死的实验研究
作者：朱洪生 钟宏 卫洪超 张臻 崔世涛
单位：上海第二医科大学附属仁济医院心胸外科200001
关键词：
中华医学杂志001123 临床各种心脏疾病引起的心肌损伤无法进行增殖修复，最终以纤维疤痕代替，导致具有收缩功能的心肌细胞明显减少，最终发展为充血性心力衰竭[1]。近年来，应用骨骼肌卫星细胞心肌内移植替代损伤心肌及疤痕组织的研究取得了很大进展，受到广泛关注。我们以成年杂种犬为研究对象，经左冠状动脉前降支将自体骨骼肌卫星细胞灌注移植入急性心肌梗死区域，观察卫星移植细胞对梗死心肌内的心肌再生、心肌细胞基本结构保护作用。
一、材料和方法
1.骨骼肌卫星细胞的提取、分离和纯化：依据Dorfman等[2]介绍的方法稍加改进。
, 百拇医药
2.骨骼肌卫星细胞的体外培养、标记：细胞培养液构成及细胞培养、传代依据Dorfman等[2]介绍。体外传代培养14～20 d、细胞扩增至总数1×107以上准备移植。移植前1 d以0.02%的二脒基苯基吲哚DAPI标记过夜。移植当天，收集细胞，漂洗6次去除未结合DAPI，悬浮于5 ml无胎牛血清M199培养液内用于移植。
3.犬急性心肌梗死模型建立、细胞移植：成年杂种犬36只，雌雄各半，体重15～18 kg，随机分为卫星细胞移植治疗组、对照组。术后分别观察2、4、8周。实验犬全身麻醉，气管插管联接呼吸机；静脉点滴利多卡因减慢心率并预防术中心律失常。左前外侧第四肋间切口进胸。解剖左冠状动脉前降支，距根部1.2～1.5 cm阻断5 min，再开放5 min，重复3次进行缺血预调后结扎，心肌梗死模型即告建立。在结扎点远端用7号头皮针将卫星细胞灌注入梗死心肌，双重结扎。逐层关胸。呼吸恢复后拔气管插管，送动物房继续饲养。对照组以同样方法建立梗死模型，予以相同量、含0.02% DAPI的M199培养液注射。
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4.标本检测:细胞移植2、4、8周，再次麻醉动物、气管插管，原切口进胸，于右心室流出道切开心脏放血处死动物。取心肌梗死区标本，石蜡包埋染色，普通光学显微镜观察及冰冻切片荧光显微镜观察。
二、结果
1.卫星细胞的体外培养、鉴定：细胞接种、培养2～3 d后贴壁、生长，初始阶段呈现梭形(图1)，此后呈现多形性。延迟分瓶或将培养液胎牛血清浓度降低至2%，细胞生长停滞，相互融合形成肌管(图2)。免疫组织化学检测肌源性标记物Desmin显示细胞阳性(图3)。
2.卫星细胞移植的心肌再生：移植2周治疗组梗死区及乳头肌心肌标本中发现带荧光的细胞核和肌纤维，排列方向大体一致，HE染色同样显示细胞方向一致性(图4)。4周、8周治疗组发现带荧光细胞核，未能发现具有荧光的肌纤维，细胞核排列仍呈方向一致性。PATH染色显示治疗组带有横纹的新生肌纤维并以闰盘相联接(图5)。对照组未发现带荧光的细胞核和肌纤维，亦未见带横纹的新生肌纤维。
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3.卫星细胞移植的心肌细胞基本结构保护作用:对照组的紊乱结构(图6)与治疗组形成鲜明对比(图4)。VG染色显示治疗组胶原纤维不发生融合，组织结构排列基本处于有序状态，而对照组胶原纤维融合，排列紊乱。
三、讨论
卫星细胞由Mauro于1961年首先发现并提出此类细胞对机体骨骼肌生长和再生有着重要作用的假设。以后的研究亦证实成熟骨骼肌细胞中核数目的增加约98%来源于卫星细胞，95%以上成熟肌纤维的增加与卫星细胞扩增、分化、融合有关。我们所培养的细胞在体外生长过程中形态多变，可能与卫星细胞的游走性有关；延迟分瓶培养、降低培养液中胎牛血清浓度后细胞融合形成肌管、肌源性特异标记物Desmin染色阳性则进一步证实所提取的细胞为骨骼肌卫星细胞。
, 百拇医药
图1 卫星细胞体外生长的梭形形态 ×100 图2 卫星细胞融合形成的肌管 ×100 图3 卫星细胞Desmin阳性 ×200 图4 移植2周与荧光照片对应的组织HE染色 ×400 图5 卫星细胞分化形成的带横纹新生肌纤维并以闰盘相联接(PATH染色 ×400 图6 对照组HE染色 ×400
由于骨骼肌和心肌同属横纹肌，在胚胎发育期先有一个共同的过程，即由间质细胞分化为肌细胞，后在不同的环境中分别分化成骨骼肌细胞和心肌细胞。因而有学者推测骨骼肌卫星细胞在心脏环境内可发生“环境依耐性分化”而生长分化为成熟心肌细胞，达到心肌再生目的。正是基于这一推测，目前已有骨骼肌卫星细胞心肌移植的报道且证实在心肌环境内具有“心肌化倾向”，这些研究为在细胞学水平治疗心肌疾病带来了曙光[1，2]。从而避免了应用基因调控方法如病毒基因转染成熟心肌细胞使细胞出现类似肿瘤无限制的生长方式；解决了免疫排异问题。
我们的研究结果显示，经此方法移植的卫星细胞分布于广泛的梗死区域，甚至在乳头肌区域亦发现带荧光的卫星细胞，细胞学形态证实卫星细胞参与形成的肌纤维呈现有序排列并与成熟心肌细胞相同排列方向一致，PATH染色可见新生带有横纹的肌纤维并以闰盘相联接，而闰盘是细胞功能整合的结构特征，对照组却未见此类现象。表明经冠状动脉灌注移植避免了以往报道的经局部注射移植造成细胞分布于局部、分化生长的肌管与正常心肌排列不一致现象，因而更为适合卫星细胞对梗死心肌的功能性修复及未来临床应用。有关卫星细胞经血管移植后移行于血管外的现象，Robinson等[3]经动脉灌注C2C12卫星细胞株发现，移植后3d，细胞主要位于血管床内，3 d～1周后逐渐经受损血管壁完整性差的部位移行于血管外并相互融合或与成熟骨骼肌细胞融合形成骨骼肌再生。本研究从形态学角度探讨卫星细胞移植对心肌基本结构的保护作用。结果显示，治疗组心肌梗死区内细胞均呈现有序排列，与对照组的结构紊乱形成鲜明对比。VG染色显示治疗组胶原纤维不发生融合，组织基本结构排列有序，而对照组胶原纤维融合，排列紊乱，心肌组织基本结构受到彻底破坏，造成这一现象的确切机制尚有待于进一步的研究。由于已有有关卫星细胞在体外培养过程中及骨骼肌内移植后可分泌与细胞生长相关的细胞因子诸如胰岛素样生长因子(IGF)、碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)等[4]，因此我们推测卫星细胞在移植进入梗死心肌后可分泌上述细胞因子，从而起到心肌基本结构的保护作用。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助(39770735)
参考文献
1，Schwarz ER,Patterson M,Kloner RA. Cardiomyocyte transplantation-a cell replacement for repair of myocardial infarction? Z Kardiol, 1998,87:1-7.
2，Dorfman J,Duong M,Zibaitis A,et al. Myocardial tissue engineering with autologous myoblast implantation. J Thorac Cardiovasc Surg ,1998,116:744-751.
3，Robinson SW, Cho PW,Levitsky HI, et al. Arterial delivery of genetically labelled skeletal myoblasts to the murine heart: long-term survival and phenotypic modification of implanted myoblasts. Cell Transplant ,1996,5:77-91.
4，Keller HL,Schneider SPB,Eppihimer LA,et al. Association of IGF-I and IGF-II with myofiber regeneration in vivo. Muscle Nerve， 1999，22:347-354.
(收稿日期：1999-12-18), 百拇医药
单位：上海第二医科大学附属仁济医院心胸外科200001
关键词：
中华医学杂志001123 临床各种心脏疾病引起的心肌损伤无法进行增殖修复，最终以纤维疤痕代替，导致具有收缩功能的心肌细胞明显减少，最终发展为充血性心力衰竭[1]。近年来，应用骨骼肌卫星细胞心肌内移植替代损伤心肌及疤痕组织的研究取得了很大进展，受到广泛关注。我们以成年杂种犬为研究对象，经左冠状动脉前降支将自体骨骼肌卫星细胞灌注移植入急性心肌梗死区域，观察卫星移植细胞对梗死心肌内的心肌再生、心肌细胞基本结构保护作用。
一、材料和方法
1.骨骼肌卫星细胞的提取、分离和纯化：依据Dorfman等[2]介绍的方法稍加改进。
, 百拇医药
2.骨骼肌卫星细胞的体外培养、标记：细胞培养液构成及细胞培养、传代依据Dorfman等[2]介绍。体外传代培养14～20 d、细胞扩增至总数1×107以上准备移植。移植前1 d以0.02%的二脒基苯基吲哚DAPI标记过夜。移植当天，收集细胞，漂洗6次去除未结合DAPI，悬浮于5 ml无胎牛血清M199培养液内用于移植。
3.犬急性心肌梗死模型建立、细胞移植：成年杂种犬36只，雌雄各半，体重15～18 kg，随机分为卫星细胞移植治疗组、对照组。术后分别观察2、4、8周。实验犬全身麻醉，气管插管联接呼吸机；静脉点滴利多卡因减慢心率并预防术中心律失常。左前外侧第四肋间切口进胸。解剖左冠状动脉前降支，距根部1.2～1.5 cm阻断5 min，再开放5 min，重复3次进行缺血预调后结扎，心肌梗死模型即告建立。在结扎点远端用7号头皮针将卫星细胞灌注入梗死心肌，双重结扎。逐层关胸。呼吸恢复后拔气管插管，送动物房继续饲养。对照组以同样方法建立梗死模型，予以相同量、含0.02% DAPI的M199培养液注射。
, 百拇医药
4.标本检测:细胞移植2、4、8周，再次麻醉动物、气管插管，原切口进胸，于右心室流出道切开心脏放血处死动物。取心肌梗死区标本，石蜡包埋染色，普通光学显微镜观察及冰冻切片荧光显微镜观察。
二、结果
1.卫星细胞的体外培养、鉴定：细胞接种、培养2～3 d后贴壁、生长，初始阶段呈现梭形(图1)，此后呈现多形性。延迟分瓶或将培养液胎牛血清浓度降低至2%，细胞生长停滞，相互融合形成肌管(图2)。免疫组织化学检测肌源性标记物Desmin显示细胞阳性(图3)。
2.卫星细胞移植的心肌再生：移植2周治疗组梗死区及乳头肌心肌标本中发现带荧光的细胞核和肌纤维，排列方向大体一致，HE染色同样显示细胞方向一致性(图4)。4周、8周治疗组发现带荧光细胞核，未能发现具有荧光的肌纤维，细胞核排列仍呈方向一致性。PATH染色显示治疗组带有横纹的新生肌纤维并以闰盘相联接(图5)。对照组未发现带荧光的细胞核和肌纤维，亦未见带横纹的新生肌纤维。
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3.卫星细胞移植的心肌细胞基本结构保护作用:对照组的紊乱结构(图6)与治疗组形成鲜明对比(图4)。VG染色显示治疗组胶原纤维不发生融合，组织结构排列基本处于有序状态，而对照组胶原纤维融合，排列紊乱。
三、讨论
卫星细胞由Mauro于1961年首先发现并提出此类细胞对机体骨骼肌生长和再生有着重要作用的假设。以后的研究亦证实成熟骨骼肌细胞中核数目的增加约98%来源于卫星细胞，95%以上成熟肌纤维的增加与卫星细胞扩增、分化、融合有关。我们所培养的细胞在体外生长过程中形态多变，可能与卫星细胞的游走性有关；延迟分瓶培养、降低培养液中胎牛血清浓度后细胞融合形成肌管、肌源性特异标记物Desmin染色阳性则进一步证实所提取的细胞为骨骼肌卫星细胞。
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图1 卫星细胞体外生长的梭形形态 ×100 图2 卫星细胞融合形成的肌管 ×100 图3 卫星细胞Desmin阳性 ×200 图4 移植2周与荧光照片对应的组织HE染色 ×400 图5 卫星细胞分化形成的带横纹新生肌纤维并以闰盘相联接(PATH染色 ×400 图6 对照组HE染色 ×400
由于骨骼肌和心肌同属横纹肌，在胚胎发育期先有一个共同的过程，即由间质细胞分化为肌细胞，后在不同的环境中分别分化成骨骼肌细胞和心肌细胞。因而有学者推测骨骼肌卫星细胞在心脏环境内可发生“环境依耐性分化”而生长分化为成熟心肌细胞，达到心肌再生目的。正是基于这一推测，目前已有骨骼肌卫星细胞心肌移植的报道且证实在心肌环境内具有“心肌化倾向”，这些研究为在细胞学水平治疗心肌疾病带来了曙光[1，2]。从而避免了应用基因调控方法如病毒基因转染成熟心肌细胞使细胞出现类似肿瘤无限制的生长方式；解决了免疫排异问题。
我们的研究结果显示，经此方法移植的卫星细胞分布于广泛的梗死区域，甚至在乳头肌区域亦发现带荧光的卫星细胞，细胞学形态证实卫星细胞参与形成的肌纤维呈现有序排列并与成熟心肌细胞相同排列方向一致，PATH染色可见新生带有横纹的肌纤维并以闰盘相联接，而闰盘是细胞功能整合的结构特征，对照组却未见此类现象。表明经冠状动脉灌注移植避免了以往报道的经局部注射移植造成细胞分布于局部、分化生长的肌管与正常心肌排列不一致现象，因而更为适合卫星细胞对梗死心肌的功能性修复及未来临床应用。有关卫星细胞经血管移植后移行于血管外的现象，Robinson等[3]经动脉灌注C2C12卫星细胞株发现，移植后3d，细胞主要位于血管床内，3 d～1周后逐渐经受损血管壁完整性差的部位移行于血管外并相互融合或与成熟骨骼肌细胞融合形成骨骼肌再生。本研究从形态学角度探讨卫星细胞移植对心肌基本结构的保护作用。结果显示，治疗组心肌梗死区内细胞均呈现有序排列，与对照组的结构紊乱形成鲜明对比。VG染色显示治疗组胶原纤维不发生融合，组织基本结构排列有序，而对照组胶原纤维融合，排列紊乱，心肌组织基本结构受到彻底破坏，造成这一现象的确切机制尚有待于进一步的研究。由于已有有关卫星细胞在体外培养过程中及骨骼肌内移植后可分泌与细胞生长相关的细胞因子诸如胰岛素样生长因子(IGF)、碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)等[4]，因此我们推测卫星细胞在移植进入梗死心肌后可分泌上述细胞因子，从而起到心肌基本结构的保护作用。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助(39770735)
参考文献
1，Schwarz ER,Patterson M,Kloner RA. Cardiomyocyte transplantation-a cell replacement for repair of myocardial infarction? Z Kardiol, 1998,87:1-7.
2，Dorfman J,Duong M,Zibaitis A,et al. Myocardial tissue engineering with autologous myoblast implantation. J Thorac Cardiovasc Surg ,1998,116:744-751.
3，Robinson SW, Cho PW,Levitsky HI, et al. Arterial delivery of genetically labelled skeletal myoblasts to the murine heart: long-term survival and phenotypic modification of implanted myoblasts. Cell Transplant ,1996,5:77-91.
4，Keller HL,Schneider SPB,Eppihimer LA,et al. Association of IGF-I and IGF-II with myofiber regeneration in vivo. Muscle Nerve， 1999，22:347-354.
(收稿日期：1999-12-18), 百拇医药