白血病细胞耐药性与Bcl-2和Bax-alpha表达水平的关系
作者：王随照 李伟 刘文生 李江棋
单位：王随照(广东省人民医院血液科)；李伟(广东省人民医院血液科)；刘文生(广东省人民医院检验科 510080)；李江棋(第一军医大学珠江医院血液科 510282)
关键词：白血病耐药；Bcl-2；Bax-alpha
广东医学001110 【摘要】 目的 研究白血病细胞耐药性与Bcl-2和Bax-alpha阳性率及表达水平关系。方法 选择难治或复发的化疗耐药白血病AML-2患者和初治化疗敏感白血病AML-2患者各10例，分离白血病细胞，应用流式细胞术比较分析化疗耐药白血病细胞与化疗敏感白血病细胞内Bcl-2和Bax-alpha阳性率和表达水平的关系。结果 耐药组和敏感组中Bcl-2细胞的阳性率和相对荧光强度均无统计学差异；而Bax-alpha阳性率在耐药组和敏感组分别为(11.27±13.25)%和(65.39±30.01)%，两组间差异有显著性(P＝0.001)，而相对荧光强度分别为4.59±4.60和7.89±3.52，无统计学差异(P＝0.078)；两组间Bcl-2∶Bax-alpha比率分别为12.14±10.70和2.79±1.43，差异具有显著性(P＝0.016)。结论 Bax-alpha的表达水平和Bcl-2和Bax-alpha的表达比例增高是决定白血病细胞对化疗药物反应性的重要因素。
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Chemoresponses and expression of Bcl-2 and Bax-alpha proteins in acute leukemia cells
Wang Suizhao, Li Wei, Liu Wensheng, et al.
(Dept. of Hematology, Guangdong Provincial People's Hospital, Guangzhou 510080)
【Abstract】 Objective To study the correlation between leukemia chemoresisance and the level of Bcl-2 or Bax-alpha expression.Methods Patients were divided into two groups: 10 cases of chemoresistant leukemia (refract or relapsed leukemia, AML-2) and 10 cases of chemosensitive leukemia (primary treated sensitive leukemia, AML-2). Multiparameter flow cytometry was used to measure the percentages and intensity of Bcl-2 and Bax-alpha expression by leukemia cells.Results The level and intensity of Bcl-2 expression did not have significant differences between both groups. The percentages of Bax-alpha positive leukemia cells in chemoresistance group and chemosensitive groups were with significant difference (P<0.01). And the levels of Bax-alpha expression were 4.59±4.60 and 7.89±3.52 respectively (P＝0.078). The Bcl-2/Bax-alpha ratio were significantly and chemosensitive group (P＝0.016), they were (12.14±10.70) vs (2.79±1.43). Conclusion Bax-alpha expression and Bcl-2/Bax-alpha ratio may be important in defermining on chemoresponse of leukemia cells.
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【Key words】 Chemoresistance Bcl-2 Bax-alpha
尽管70%～80%的白血病患者经过标准化疗能够达到缓解，但这些患者中却仅有25%的生存期能够超过5年[1]。白血病细胞对化疗的抗性一直是影响患者生存的主要制约因素，难治和复发白血病是当前白血病治疗的难题。目前对白血病细胞耐药的机制尚不很明了。近年的研究结果提出了细胞凋亡是化疗诱导白血病细胞死亡的模式，Bcl-2基因家族在调节白血病细胞对凋亡的敏感性方面起核心作用[2，3]。有关Bcl-2蛋白与白血病细胞耐药关系的报道结果不一致[4～6]。新近的研究提示，Bcl-2与Bax-alpha的比率可能是影响白血病细胞对化疗药物敏感性的关键因素[6]。我们拟通过比较化疗敏感白血病和耐药白血病细胞内Bcl-2和Bax-alpha的表达水平，探讨白血病细胞耐药的分子机制。
1 资料与方法
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1.1 病例的选择及样本采集 初治化疗敏感的白血病AML-2患者10例，男7例，女3例，平均年龄(26±12)岁；难治或复发化疗耐受的白血病AML-2患者10例，男8例，女2例，平均年龄(31±16)岁。所有病例均符合FAB诊断标准。采集骨髓1 ml，用淋巴细胞分离液分离白血病细胞，涂片形态学检测白血病细胞大于85%以上。
1.2 白血病细胞内Bcl-2抗体标记 取新鲜的骨髓细胞100 μl，加入10 μl的anti-human CD45抗体(PharMingen Co.)，室温避光孵育30 min，加入红细胞裂解液2 ml，避光孵育5 min，离心弃上清，PBS洗涤一次，加入固定液(终浓度0.5% Paraformaldehyde)4℃、避光孵育1 h，离心、弃上清，用含0.05% Tween-20的PBS悬浮，室温孵育15 min，离心弃上清，加入10 μl anti-human Bcl-2-FITC(PharMingen Co.)，对照管加入mouse IgG1-FITC(PharMingen Co.)，混匀后，4℃、避光孵育30 min，加入0.05% Tween-20(Sigma Co.)的PBS悬浮，4℃孵育5 min，离心、弃上清，重复洗涤一次。
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1.3 白血病细胞内Bax抗体标记 取新鲜的骨髓细胞100 μl，加入10 μl的anti-human CD45抗体，室温避光孵育30 min，加入红细胞裂解液2 ml，避光孵育5 min，离心、弃上清，PBS洗涤一次，加入固定液(终浓度0.5% Paraformaldehyde, Sigma Co.)4℃、避光孵育1 h，离心、弃上清，用含0.05% Tween-20的PBS悬浮，室温孵育15 min，离心、弃上清，加入10 μl mouse anti-human Bax (PharMingen Co.)，对照管加入mouse IgG1-FITC，混匀后，4℃、避光孵育30 min，加入0.05% Tween-20的PBS悬浮，4℃孵育5 min，离心、弃上清，加入10 μl anti-mouse IgG1-FITC抗体，混匀后，4℃、 避光孵育30 min，加入0.05% Tween-20的PBS悬浮，4℃孵育5 min，离心、弃上清，重复洗涤一次。
1.4 流式细胞术检测 标记后的细胞在流式细胞仪FACS Calibur(Becton Dickinson)上进行测定和分析，应用Cell Quest软件获取数据，Cell Quest软件分析细胞内Bcl-2和Bax因子的表达水平。
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1.5 统计学处理 应用SPSS统计软件进行数据分析。
2 结果
2.1 耐药组和敏感组白血病细胞内Bcl-2表达水平 耐药组和敏感组的白血病细胞中，Bcl-2的阳性细胞率和平均荧光强度在两组间差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。
表1 化疗耐药组和敏感组白血病细胞内
Bcl-2表达阳性率和相对荧光强度 分组
例数
Bcl-2阳性细胞率(%)
Bcl-2相对荧光强度
敏感组
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10
62.43±26.19
18.04±3.68
耐药组
10
65.43±26.19
19.14±7.78
2.2 耐药组和敏感组白血病细胞内Bax-alpha表达水平 耐药组和敏感组的白血病细胞中，Bax-alpha阳性细胞率在耐药组和敏感组存在显著差异(P<0.05)，耐药组远远低于敏感组。耐药组和敏感组阳性细胞的Bax-alpha相对荧光强度差异无显著性(P＝0.078)，见表2。表2 化疗耐药组和敏感组白血病细胞内Bcl-2和Bax-alpha
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表达阳性率和相对荧光强度 分组
Bax-alpha阳性细胞率(%)
Bax-alpha相对荧光强度
敏感组
65.39±30.01
7.89±3.52
耐药组
11.27±13.25
4.59±4.60
2.3 耐药组和敏感组白血病细胞内Bcl-2和Bax-alpha比率 Bcl-2与Bax-alpha的比率在耐药组和敏感组分别为12.14±10.70和2.79±1.43，差异有显著性(P<0.05)。
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3 讨论
有关白血病细胞耐药性的研究提示，改变细胞凋亡信号可能是肿瘤耐药的重要因素，作为细胞凋亡调节的核心因子Bcl-2蛋白家族，特别是Bcl-2和Bax-alpha的相互作用在凋亡调节过程中起关键作用[2，3，7]。它们在白血病细胞耐药中的作用尚不明了[4，6]。
我们的结果显示，Bcl-2蛋白表达水平和Bcl-2细胞阳性率在化疗敏感组和耐药组中差异无显著性。提示单独Bcl-2可能不是决定白血病细胞对化疗敏感性因素，与文献报道相一致[6]。白血病细胞中表达Bax-alpha的阳性细胞率和相对荧光强度在化疗敏感白血病细胞和耐药组间存在显著差异。表明Bax-alpha蛋白可能在决定细胞凋亡过程中较Bcl-2的作用更为重要，在对白血病细胞化疗敏感性、疗效和预后评估方面具有一定的意义。在难治和复发的耐药白血病细胞中Bax-alpha的表达水平和阳性率均较敏感组低。此结果与Bax-alpha作为细胞凋亡的促进因子的理论相一致[3，7]，即Bax-alpha与Bcl-2形成异型二聚体在适当的条件下促进细胞凋亡过程[3，7]。作为Bcl-2的成员之一，Bax-alpha则可以作为白血病预后良好的指标。
, 百拇医药
在Bcl-2家族中,Bcl-2∶Bax-alpha比率被认为是调节凋亡易感性的关键因素[7～11]。我们的结果显示，Bcl-2和Bax-alpha比率在敏感组和耐药组间存在显著差异，表明Bcl-2和Bax-alpha比率比Bcl-2可能在白血病细胞化疗易感性方面具有重要的意义。我们的结果显示，Bax-alpha和Bax-alpha∶Bcl-2在影响白血病细胞化疗易感性中起重要作用。
综上所述，诱导细胞凋亡是化疗药物治疗白血病细胞的重要机制之一，Bcl-2和Bax-alpha比率是调节白血病细胞对化疗药物诱导凋亡的核心因素。Bax-alpha和Bcl-2∶Bax-alpha比率可作为临床上对白血病患者进行化疗方案药物选择、预后评价的参考指标。通过改变Bcl-2和Bax-alpha表达水平的比例关系，可能会提高对白血病的治疗疗效，提高患者的生存期。
本课题为广东省自然科学基金资助项目(970697)和广东省医学科研基金资助项目(97052，97051)
, 百拇医药
参考文献
1，Burnett AK, Eden OB. Treatment of acute leukemia. Lancet, 1997, 349:270
2，Smith BD, Bambach BJ, Vala MS , et al. Inhibited apoptosis and drug resistance in acute myeloid leukemia. British Journal of Haematology, 1998, 102:1042
3，Reed JC. Bcl-2 and the regulation of programmed cell death. J Cell Biol, 1994, 124:1
4，Ahmed N, Laverick L, Sammons J, et al. Effect of all-trans retinoic acid on chemotherapy induced apoptosis and down-regulation of bcl-2 in human myeloid leukemia CD34 positive cells. Leukemia Research, 1999, 23:741
, 百拇医药
5，Uckun FM, Yang Z, Sather H, et al. Cellular expression of antiapoptotic BCL-2 oncoprotein in newly diagnosed childhood acute lymphoblastic leukemia: a children's cancer group study. Blood, 1997, 89(10):3769
6，Banker DE, Groudine M, Norwood T, et al. Measurement of spontaneous and therapeutic agent-induced apoptosis with BCL-2 protein expression in acute myeloid leukemia. Blood, 1997, 89(1):243
7，Yang E, Korsmeyer SJ. A discourse on the BCL-2 family and cell death. Blood, 1996, 88:386
, 百拇医药
8，Thomas PA, Hoy T, Bentley P, et al. Chlorambucil resistance in B-cell chronic lymphocytic leukemia is mediated through failed bax induction and selection of high bcl-2-expressing subclones. British Journal of Haematology, 1999, 104:581
9，Lisovsky M, Estrov X, Zhang X, et al, Flt3 ligand stimulates proliferation and inhibits apoptosis of acute myeloid leukemia cells:regulation of BCL-2 and BAX. Blood, 1996, 88(10):3987
10，Lyda LO, Angelina SD, Miguel AS, et al. CD6 ligation modulates the bcl-2/bax ratio and protects chronic lymphocytic leukemia B cells from apoptosis induced by anti-IgM. Blood, 1997, 89(8): 2833
11，Legdeur MCJC, Bontje PM, Ossenkoppele GJ, et al. The role of bcl-2 and bax protein in monocyte-mediated apoptosis in human leukemia cell lines. Experimental Hematology, 1996, 24:2531
(收稿日期：2000-06-26), http://www.100md.com
单位：王随照(广东省人民医院血液科)；李伟(广东省人民医院血液科)；刘文生(广东省人民医院检验科 510080)；李江棋(第一军医大学珠江医院血液科 510282)
关键词：白血病耐药；Bcl-2；Bax-alpha
广东医学001110 【摘要】 目的 研究白血病细胞耐药性与Bcl-2和Bax-alpha阳性率及表达水平关系。方法 选择难治或复发的化疗耐药白血病AML-2患者和初治化疗敏感白血病AML-2患者各10例，分离白血病细胞，应用流式细胞术比较分析化疗耐药白血病细胞与化疗敏感白血病细胞内Bcl-2和Bax-alpha阳性率和表达水平的关系。结果 耐药组和敏感组中Bcl-2细胞的阳性率和相对荧光强度均无统计学差异；而Bax-alpha阳性率在耐药组和敏感组分别为(11.27±13.25)%和(65.39±30.01)%，两组间差异有显著性(P＝0.001)，而相对荧光强度分别为4.59±4.60和7.89±3.52，无统计学差异(P＝0.078)；两组间Bcl-2∶Bax-alpha比率分别为12.14±10.70和2.79±1.43，差异具有显著性(P＝0.016)。结论 Bax-alpha的表达水平和Bcl-2和Bax-alpha的表达比例增高是决定白血病细胞对化疗药物反应性的重要因素。
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Chemoresponses and expression of Bcl-2 and Bax-alpha proteins in acute leukemia cells
Wang Suizhao, Li Wei, Liu Wensheng, et al.
(Dept. of Hematology, Guangdong Provincial People's Hospital, Guangzhou 510080)
【Abstract】 Objective To study the correlation between leukemia chemoresisance and the level of Bcl-2 or Bax-alpha expression.Methods Patients were divided into two groups: 10 cases of chemoresistant leukemia (refract or relapsed leukemia, AML-2) and 10 cases of chemosensitive leukemia (primary treated sensitive leukemia, AML-2). Multiparameter flow cytometry was used to measure the percentages and intensity of Bcl-2 and Bax-alpha expression by leukemia cells.Results The level and intensity of Bcl-2 expression did not have significant differences between both groups. The percentages of Bax-alpha positive leukemia cells in chemoresistance group and chemosensitive groups were with significant difference (P<0.01). And the levels of Bax-alpha expression were 4.59±4.60 and 7.89±3.52 respectively (P＝0.078). The Bcl-2/Bax-alpha ratio were significantly and chemosensitive group (P＝0.016), they were (12.14±10.70) vs (2.79±1.43). Conclusion Bax-alpha expression and Bcl-2/Bax-alpha ratio may be important in defermining on chemoresponse of leukemia cells.
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【Key words】 Chemoresistance Bcl-2 Bax-alpha
尽管70%～80%的白血病患者经过标准化疗能够达到缓解，但这些患者中却仅有25%的生存期能够超过5年[1]。白血病细胞对化疗的抗性一直是影响患者生存的主要制约因素，难治和复发白血病是当前白血病治疗的难题。目前对白血病细胞耐药的机制尚不很明了。近年的研究结果提出了细胞凋亡是化疗诱导白血病细胞死亡的模式，Bcl-2基因家族在调节白血病细胞对凋亡的敏感性方面起核心作用[2，3]。有关Bcl-2蛋白与白血病细胞耐药关系的报道结果不一致[4～6]。新近的研究提示，Bcl-2与Bax-alpha的比率可能是影响白血病细胞对化疗药物敏感性的关键因素[6]。我们拟通过比较化疗敏感白血病和耐药白血病细胞内Bcl-2和Bax-alpha的表达水平，探讨白血病细胞耐药的分子机制。
1 资料与方法
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1.1 病例的选择及样本采集 初治化疗敏感的白血病AML-2患者10例，男7例，女3例，平均年龄(26±12)岁；难治或复发化疗耐受的白血病AML-2患者10例，男8例，女2例，平均年龄(31±16)岁。所有病例均符合FAB诊断标准。采集骨髓1 ml，用淋巴细胞分离液分离白血病细胞，涂片形态学检测白血病细胞大于85%以上。
1.2 白血病细胞内Bcl-2抗体标记 取新鲜的骨髓细胞100 μl，加入10 μl的anti-human CD45抗体(PharMingen Co.)，室温避光孵育30 min，加入红细胞裂解液2 ml，避光孵育5 min，离心弃上清，PBS洗涤一次，加入固定液(终浓度0.5% Paraformaldehyde)4℃、避光孵育1 h，离心、弃上清，用含0.05% Tween-20的PBS悬浮，室温孵育15 min，离心弃上清，加入10 μl anti-human Bcl-2-FITC(PharMingen Co.)，对照管加入mouse IgG1-FITC(PharMingen Co.)，混匀后，4℃、避光孵育30 min，加入0.05% Tween-20(Sigma Co.)的PBS悬浮，4℃孵育5 min，离心、弃上清，重复洗涤一次。
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1.3 白血病细胞内Bax抗体标记 取新鲜的骨髓细胞100 μl，加入10 μl的anti-human CD45抗体，室温避光孵育30 min，加入红细胞裂解液2 ml，避光孵育5 min，离心、弃上清，PBS洗涤一次，加入固定液(终浓度0.5% Paraformaldehyde, Sigma Co.)4℃、避光孵育1 h，离心、弃上清，用含0.05% Tween-20的PBS悬浮，室温孵育15 min，离心、弃上清，加入10 μl mouse anti-human Bax (PharMingen Co.)，对照管加入mouse IgG1-FITC，混匀后，4℃、避光孵育30 min，加入0.05% Tween-20的PBS悬浮，4℃孵育5 min，离心、弃上清，加入10 μl anti-mouse IgG1-FITC抗体，混匀后，4℃、 避光孵育30 min，加入0.05% Tween-20的PBS悬浮，4℃孵育5 min，离心、弃上清，重复洗涤一次。
1.4 流式细胞术检测 标记后的细胞在流式细胞仪FACS Calibur(Becton Dickinson)上进行测定和分析，应用Cell Quest软件获取数据，Cell Quest软件分析细胞内Bcl-2和Bax因子的表达水平。
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1.5 统计学处理 应用SPSS统计软件进行数据分析。
2 结果
2.1 耐药组和敏感组白血病细胞内Bcl-2表达水平 耐药组和敏感组的白血病细胞中，Bcl-2的阳性细胞率和平均荧光强度在两组间差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。
表1 化疗耐药组和敏感组白血病细胞内
Bcl-2表达阳性率和相对荧光强度 分组
例数
Bcl-2阳性细胞率(%)
Bcl-2相对荧光强度
敏感组
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10
62.43±26.19
18.04±3.68
耐药组
10
65.43±26.19
19.14±7.78
2.2 耐药组和敏感组白血病细胞内Bax-alpha表达水平 耐药组和敏感组的白血病细胞中，Bax-alpha阳性细胞率在耐药组和敏感组存在显著差异(P<0.05)，耐药组远远低于敏感组。耐药组和敏感组阳性细胞的Bax-alpha相对荧光强度差异无显著性(P＝0.078)，见表2。表2 化疗耐药组和敏感组白血病细胞内Bcl-2和Bax-alpha
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表达阳性率和相对荧光强度 分组
Bax-alpha阳性细胞率(%)
Bax-alpha相对荧光强度
敏感组
65.39±30.01
7.89±3.52
耐药组
11.27±13.25
4.59±4.60
2.3 耐药组和敏感组白血病细胞内Bcl-2和Bax-alpha比率 Bcl-2与Bax-alpha的比率在耐药组和敏感组分别为12.14±10.70和2.79±1.43，差异有显著性(P<0.05)。
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3 讨论
有关白血病细胞耐药性的研究提示，改变细胞凋亡信号可能是肿瘤耐药的重要因素，作为细胞凋亡调节的核心因子Bcl-2蛋白家族，特别是Bcl-2和Bax-alpha的相互作用在凋亡调节过程中起关键作用[2，3，7]。它们在白血病细胞耐药中的作用尚不明了[4，6]。
我们的结果显示，Bcl-2蛋白表达水平和Bcl-2细胞阳性率在化疗敏感组和耐药组中差异无显著性。提示单独Bcl-2可能不是决定白血病细胞对化疗敏感性因素，与文献报道相一致[6]。白血病细胞中表达Bax-alpha的阳性细胞率和相对荧光强度在化疗敏感白血病细胞和耐药组间存在显著差异。表明Bax-alpha蛋白可能在决定细胞凋亡过程中较Bcl-2的作用更为重要，在对白血病细胞化疗敏感性、疗效和预后评估方面具有一定的意义。在难治和复发的耐药白血病细胞中Bax-alpha的表达水平和阳性率均较敏感组低。此结果与Bax-alpha作为细胞凋亡的促进因子的理论相一致[3，7]，即Bax-alpha与Bcl-2形成异型二聚体在适当的条件下促进细胞凋亡过程[3，7]。作为Bcl-2的成员之一，Bax-alpha则可以作为白血病预后良好的指标。
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在Bcl-2家族中,Bcl-2∶Bax-alpha比率被认为是调节凋亡易感性的关键因素[7～11]。我们的结果显示，Bcl-2和Bax-alpha比率在敏感组和耐药组间存在显著差异，表明Bcl-2和Bax-alpha比率比Bcl-2可能在白血病细胞化疗易感性方面具有重要的意义。我们的结果显示，Bax-alpha和Bax-alpha∶Bcl-2在影响白血病细胞化疗易感性中起重要作用。
综上所述，诱导细胞凋亡是化疗药物治疗白血病细胞的重要机制之一，Bcl-2和Bax-alpha比率是调节白血病细胞对化疗药物诱导凋亡的核心因素。Bax-alpha和Bcl-2∶Bax-alpha比率可作为临床上对白血病患者进行化疗方案药物选择、预后评价的参考指标。通过改变Bcl-2和Bax-alpha表达水平的比例关系，可能会提高对白血病的治疗疗效，提高患者的生存期。
本课题为广东省自然科学基金资助项目(970697)和广东省医学科研基金资助项目(97052，97051)
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参考文献
1，Burnett AK, Eden OB. Treatment of acute leukemia. Lancet, 1997, 349:270
2，Smith BD, Bambach BJ, Vala MS , et al. Inhibited apoptosis and drug resistance in acute myeloid leukemia. British Journal of Haematology, 1998, 102:1042
3，Reed JC. Bcl-2 and the regulation of programmed cell death. J Cell Biol, 1994, 124:1
4，Ahmed N, Laverick L, Sammons J, et al. Effect of all-trans retinoic acid on chemotherapy induced apoptosis and down-regulation of bcl-2 in human myeloid leukemia CD34 positive cells. Leukemia Research, 1999, 23:741
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5，Uckun FM, Yang Z, Sather H, et al. Cellular expression of antiapoptotic BCL-2 oncoprotein in newly diagnosed childhood acute lymphoblastic leukemia: a children's cancer group study. Blood, 1997, 89(10):3769
6，Banker DE, Groudine M, Norwood T, et al. Measurement of spontaneous and therapeutic agent-induced apoptosis with BCL-2 protein expression in acute myeloid leukemia. Blood, 1997, 89(1):243
7，Yang E, Korsmeyer SJ. A discourse on the BCL-2 family and cell death. Blood, 1996, 88:386
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8，Thomas PA, Hoy T, Bentley P, et al. Chlorambucil resistance in B-cell chronic lymphocytic leukemia is mediated through failed bax induction and selection of high bcl-2-expressing subclones. British Journal of Haematology, 1999, 104:581
9，Lisovsky M, Estrov X, Zhang X, et al, Flt3 ligand stimulates proliferation and inhibits apoptosis of acute myeloid leukemia cells:regulation of BCL-2 and BAX. Blood, 1996, 88(10):3987
10，Lyda LO, Angelina SD, Miguel AS, et al. CD6 ligation modulates the bcl-2/bax ratio and protects chronic lymphocytic leukemia B cells from apoptosis induced by anti-IgM. Blood, 1997, 89(8): 2833
11，Legdeur MCJC, Bontje PM, Ossenkoppele GJ, et al. The role of bcl-2 and bax protein in monocyte-mediated apoptosis in human leukemia cell lines. Experimental Hematology, 1996, 24:2531
(收稿日期：2000-06-26), http://www.100md.com