基质金属蛋白酶-3在突出椎间盘中的表达及其意义
作者：杨圣 史可中 安荣泽 廖文波 郑晓美
单位：贵州省遵义医学院第一附属医院骨外科， 遵义市 563003
关键词：免疫组织化学；基质金属蛋白酶-3；椎间盘突出症
中国矫形外科杂志001121 摘 要 目的：检测椎间盘突出症的椎间盘中是否有基质金属蛋白酶-3(MMP3)的表达，以便进一步了解椎间盘突出症的发病机制。方法：运用免疫组织化学抗生物素蛋白—生物素—过氧化物酶复合体法，通过抗MMP3的单克隆抗体，对78例椎间盘突出症和14例非椎间盘突出症的椎间盘标本进行染色。结果：椎间盘突出症中的MMP3比非椎间盘突出的多，差异非常显著。椎间盘突出症的临床分型：脱出型及游离型的MMP3比凸出型的多，其差异有非常显著意义。脱出型与游离型的MMP3差异没有显著意义。结论：MMP3与椎间盘突出症可能有关，椎间盘组织退变程度的差异是临床不同突出类型的生化基础。
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中图分类号 R681.53 文献标识码 A 文章编号 1005-8478(2000)11-1102-03
In Expression of Matrix Metalloproteinase-3 in Intervertebral Disc Herniation
YANG Sheng SHI Ke-zhong AN Rong-ze
(Departement of Orthopaedics, The First Affiliated Hospital, Zunyi Medical College, Zunyi 563003)
Abstract Objective: To determine whether the presence of matrix metalloproteinase-3 among intervertebral dicsc tissue could provide insights into the pathogenesis of intervertebraldisc herniation. Methods: Seventy-eight specimens of disc herniation(classified as protrusions, , extrusions, and sequestrations) and fourteen nonherniated discs were immunostained with antihuman MMP-3 monoclonal antibody, using the avidin-biotin-peroxidase complex method. Results: The MMP-3-potive cell ratio observed in prolapsed intervertebral discs was significantly higher than that in nonprolapsed disc. The MMP-3-potive cell ratio in the extrusion and sequestration types were significantly higher than in the protrusion type. There was no significant difference in MMP-3-positive cell ration between the extrusion and sequestration type. Conclusion The MMP-3 may be involved in the pathogenesis of intervertebral disc herniation. The differences of the tissue degeneration in the herniated disc may be the biochemical base of the different types of intervertebral disc herniation in clinic.
, 百拇医药
Key words Immunohistochemistry Matrix metalloproteinase-3 Intervertebral disc herniation
基质金属蛋白酶(MMP)是一族具有降解细胞外基质(ECM)主要功能的酶。它至少有18种，可分为基质溶解素、胶原酶、明胶酶、膜金属蛋白酶等4类[1]。现已证实MMP与骨关节炎和类风湿关节炎有关[1～3]。基质溶解素与椎间盘突出症的关系很少有人研究。国内尚无报道。
MMP3(又名基质溶解素-1或蛋白多糖酶)是基质金属蛋白酶中的一个重要成员。它能降解蛋白多糖、层连蛋白、纤维连接蛋白以及Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅸ型胶原等成分，还能活化以酶原形式分泌的MMP[1～4]。由于椎间盘基质主要由胶原、蛋白多糖、水和弹性蛋白构成[1]，故推测MMP3与椎间盘退变有关。后者是椎间盘突出症的发生基础。检测突出椎间盘内的MMP3可能进一步了解椎间盘突出症的发病机制。
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1 材料与方法
1.1 主要试剂
抗MMP3单克隆抗体、L多聚赖氨酸购自迈新公司，全组分ABC试剂盒购自华美公司。
1.2 标本的收集与处理
78例椎间盘取自椎间盘突出症手术的患者。14例非突出的椎间盘标本取自无椎间盘突出症的脊柱手术的患者(见表1)。
表1 材料
例数
颈椎间盘凸出型
2
腰椎间盘凸出型
, 百拇医药 40
腰椎间盘脱出型
24
腰椎间盘游离型
12
脊 柱 骨 折
10
第5腰椎滑脱
4
合 计
92
标本取得后于室温下在10%福尔马林溶液中过夜，然后用石蜡包埋。
1.3 免疫组织化学染色
, 百拇医药
(1)石蜡切片56℃烘烤30min；(2)二甲苯脱蜡；(3)梯度酒精水化，PBS洗3次各5min(以下每2步之间若无特殊说明的就须PBS洗)；(4)3%过氧化氢室温下10min；(5)酶消化或抗原修复；(6)封闭剂处理；(7)勿洗，加一抗并在4℃下过夜；(8)二抗37℃下30min；(9)ABC复合物37℃下30min；(10)DAB显色；(11)苏木素复染，中性树胶封片。免疫组化阳性对照为迈新公司提供的阳性切片。阴性对照为实验时不加抗MMP3的单克隆抗体。
1.4 染色结果判断
本实验用DAB显色，而MMP3位于胞浆中，故阳性信号表现为胞浆棕褐色或棕黄色。苏木素复染后胞核为蓝色，胞浆颜色不变。
每张切片随机观察10个视野，并记录阳性软骨细胞率。阳性软骨细胞率=10个视野内阳性软骨细胞总数/10个视野内软骨细胞总数×100%。无阳性细胞记为(-)；偶见阳性细胞且在5%以下记为(±)；阳性细胞率<25%记为(+)；阳性细胞率为25%～50%时记为(++)；阳性细胞率>50%记为(+++)。
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1.5 统计方法 t检验。
2 结果
绝大多数椎间盘内MMP3染色阳性。突出椎间盘内MMP3阳性率为26%～82%，平均51.2%。非突出椎间盘内MMP3阳性率为2%～32%，平均17.1%。前者明显高于后者，其差异有非常显著性意义(t值为6.417，P<0.01)。在突出椎间盘组织中，脱出型及游离型的MMP3阳性率明显高于凸出型，其差异有非常显著性意义(t值为23.013，P<0.01)。脱出型与游离型的MMP3无显著差异(t值为0.178，P>0.05，表2)。
表2 免疫组织化学染色结果
+ + +
++
+
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±
-
合计
非椎间盘突出
凸出型
脱出型
游离型
0
6
21
11
1
34
3
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1
11
2
0
0
2
0
0
0
0
0
0
0
14
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42
24
12
3 讨论
椎间盘突出症的发生基础是椎间盘退变，其主要表现为基质内蛋白多糖、胶原、和弹性蛋白等生物大分子的结构、功能、含量及类型的变化。参与细胞外基质降解的酶系有4种：基质金属蛋白酶(MMP)、半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶以及天冬氨酸蛋白酶，MMP是降解细胞外基质的主要酶[1]。
人突出椎间盘中有过量MMP存在，削弱了纤维环的保护作用，使髓核易从后方和侧后方突出[1]。单纯增加髓核内的压力不会使椎间盘从侧后方突出，只有在纤维环相当薄弱时才出现[1]。Kang[5]等用生化方法对突出椎间盘和非突出椎间盘(脊柱侧凸或脊柱骨折手术时取得的椎间盘)内MMP进行检测，结果表明突出组的活性显著高于非突出组，其中以基质溶解素和明胶酶活性的增加尤为明显。Kanemoto[3]等研究显示在突出椎间盘中MMP3比非突出椎间盘的多。Kastui[2]等认为MMP3与椎间盘突出症有关。
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本实验用免疫组化抗生素蛋白—生物素—过氧化物酶复合体法检测了突出椎间盘和非突出椎间盘内MMP3的表达。结果与Kanemoto[3]的报道基本一致。突出组比非突出组多；脱出型及游离型比凸出型多。提示脱出型及游离型的退变程度比凸出型的更为严重，退变程度的差异是临床不同突出类型的生化基础。由于纤维环破裂后椎间盘可以脱出或游离，而此两型的MMP3无显著性差异，表明MMP3通过影响纤维环而在椎间盘突出症中起作用。
椎间盘的胶原80%是Ⅰ型和Ⅱ型[1]。纤维环内的胶原以Ⅰ型和Ⅱ型为主，此外还有Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅸ型[6，7]。髓核内的胶原以Ⅱ型为主，同时也有Ⅵ、Ⅸ及Ⅺ型[1]。MMP3虽不能直接降解Ⅰ型、Ⅵ型和Ⅺ型胶原，但可以通过活化其它的MMP对它们进行降解[1]。MMP3也能通过激活MMP2和MMP7对椎间盘内的弹性蛋白进行降解[1]。MMP3活化其它的MMP，及其与椎间盘突出症的关系有待进一步研究。
, 百拇医药
胶原和弹性蛋白在降解后发生变性，导致结构强度下降；可溶性增加。胶原变性使纤维环薄弱，在外力作用下易发生纤维环破裂。弹性蛋白变性使椎间盘的弹性功能降低，影响了对所受机械力量的缓冲，长期反复作用，易发生椎间盘突出。所以，减少椎间盘内MMP3的含量或抑制其活性，可预防或减缓椎间盘退变，减少椎间盘突出症的发生。目前国外已用MMP的特异性组织抑制剂(TIMP)对骨关节炎进行临床试验性治疗[1]。TIMP可以抑制所有MMP成员的活性[1]，它能否用于椎间盘突出症还有待研究。
MMP3除了能影响胶原纤维和弹性蛋白外，还可降解蛋白多糖[1，2]。
椎间盘内蛋白多糖、胶原和弹性蛋白的密切配合是维持椎间盘良好力学性能的基础。蛋白多糖能抵抗压应力，胶原可以抵抗张应力。弹性蛋白有缓冲椎间盘所受机械力量的作用。椎间盘退变后它们不能密切配合。这也是纤维环破裂、椎间盘突出的另一个重要原因。
, 百拇医药
一般认为，椎间盘突出症是在椎间盘退变的基础上发生的。外伤是其发病的重要诱因。MMP3不仅参与椎间盘退变，它和外伤也有关。椎间盘负重后其液静压升高，液静压超过3MPa时椎间盘内MMP3的分泌就会增多，加速了椎间盘的退变[8，9]。
综上所述，MMP3能改变椎间盘基质内蛋白多糖、胶原、和弹性蛋白等生物大分子的结构、功能及含量，从而在椎间盘退变和椎间盘突出中起作用。
椎间盘基质的降解有多种酶系参与。本实验仅从一个方面对MMP3与椎间盘突出症的关系作了探讨。对其它酶的作用及相互关系尚须进一步的研究。
作者简介：杨圣(1972-)，男，主治医师，硕士在读。研究方向：脊柱脊髓损伤。电话：(0852)8623430-8356
参考文献
, http://www.100md.com [1] Goupille H, Jayson M, Valat J, et al. Matrix metalloproteinases: the clue to intervertebral disc degeneration[J]. Spine,1998,23:1 612～1 626.
[2] Mastui Y, Maeda M, Nakagami W, et al. The involvement of matrix metalloproteinases and inflammation in lumbar disc herniation[J]. Spine, 1998,23:863～869.
[3] Kanemoto M, Hukuda S, Komiya Y, et al.Immunohistochemical study of matrix metalloproteinase-3 and tissue inhibitor of metalloproteinse-1 in human intervertebral discs[J]. Spine,1996,21:1～8.
, 百拇医药
[4] Wu JJ, Lark MW, Chun LE, et al. Site of stromelysin cleavage in collagen types Ⅱ,Ⅸ，Ⅹ and Ⅵ of cartilage[J]. J Biolchem.1991,266:5 625～5 628.
[5] Kang JD, Georgescu HI, Mclntyre-Larkin L, et al. Herniated lumba intervertebral discs spontaneously produce matrix metalloproteinases nitric oxide, interleukin-6, and prostaglandin E2[J]. Spine,1996,21:271～277.
[6] Kaapa E,Han X, Holm S, et al.Collagen synthesis and types Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ and Ⅵ collagens in an animal model of disc degeneration[J]. Spine,1995,20:59～67.
, 百拇医药
[7] Roberts S, Menage J, Duance V, et al. Collagen types around the cells of the intervertebral disc and cartilage end plate: An immunolocalization study[J]. Spine,1991,16:1 030～1 038.
[8] Hutton W, Elmer W, Boden S, et al. The effect of hydrostatic pressure on intervertebral disc metabolism[J]. Spine,1999,24:1 507～1 515.
[9] Handa T, Ishihara H, Ohshima H, et al. Effects of hydrostatic pressure on matrix synthesis and matrix metalloproteinase production in the human lumbar intervertebral disc[J]. Spine 1997,22:1 085～1 091.
收稿：2000-03-27
修回：2000-07-18, 百拇医药
单位：贵州省遵义医学院第一附属医院骨外科， 遵义市 563003
关键词：免疫组织化学；基质金属蛋白酶-3；椎间盘突出症
中国矫形外科杂志001121 摘 要 目的：检测椎间盘突出症的椎间盘中是否有基质金属蛋白酶-3(MMP3)的表达，以便进一步了解椎间盘突出症的发病机制。方法：运用免疫组织化学抗生物素蛋白—生物素—过氧化物酶复合体法，通过抗MMP3的单克隆抗体，对78例椎间盘突出症和14例非椎间盘突出症的椎间盘标本进行染色。结果：椎间盘突出症中的MMP3比非椎间盘突出的多，差异非常显著。椎间盘突出症的临床分型：脱出型及游离型的MMP3比凸出型的多，其差异有非常显著意义。脱出型与游离型的MMP3差异没有显著意义。结论：MMP3与椎间盘突出症可能有关，椎间盘组织退变程度的差异是临床不同突出类型的生化基础。
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中图分类号 R681.53 文献标识码 A 文章编号 1005-8478(2000)11-1102-03
In Expression of Matrix Metalloproteinase-3 in Intervertebral Disc Herniation
YANG Sheng SHI Ke-zhong AN Rong-ze
(Departement of Orthopaedics, The First Affiliated Hospital, Zunyi Medical College, Zunyi 563003)
Abstract Objective: To determine whether the presence of matrix metalloproteinase-3 among intervertebral dicsc tissue could provide insights into the pathogenesis of intervertebraldisc herniation. Methods: Seventy-eight specimens of disc herniation(classified as protrusions, , extrusions, and sequestrations) and fourteen nonherniated discs were immunostained with antihuman MMP-3 monoclonal antibody, using the avidin-biotin-peroxidase complex method. Results: The MMP-3-potive cell ratio observed in prolapsed intervertebral discs was significantly higher than that in nonprolapsed disc. The MMP-3-potive cell ratio in the extrusion and sequestration types were significantly higher than in the protrusion type. There was no significant difference in MMP-3-positive cell ration between the extrusion and sequestration type. Conclusion The MMP-3 may be involved in the pathogenesis of intervertebral disc herniation. The differences of the tissue degeneration in the herniated disc may be the biochemical base of the different types of intervertebral disc herniation in clinic.
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Key words Immunohistochemistry Matrix metalloproteinase-3 Intervertebral disc herniation
基质金属蛋白酶(MMP)是一族具有降解细胞外基质(ECM)主要功能的酶。它至少有18种，可分为基质溶解素、胶原酶、明胶酶、膜金属蛋白酶等4类[1]。现已证实MMP与骨关节炎和类风湿关节炎有关[1～3]。基质溶解素与椎间盘突出症的关系很少有人研究。国内尚无报道。
MMP3(又名基质溶解素-1或蛋白多糖酶)是基质金属蛋白酶中的一个重要成员。它能降解蛋白多糖、层连蛋白、纤维连接蛋白以及Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅸ型胶原等成分，还能活化以酶原形式分泌的MMP[1～4]。由于椎间盘基质主要由胶原、蛋白多糖、水和弹性蛋白构成[1]，故推测MMP3与椎间盘退变有关。后者是椎间盘突出症的发生基础。检测突出椎间盘内的MMP3可能进一步了解椎间盘突出症的发病机制。
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1 材料与方法
1.1 主要试剂
抗MMP3单克隆抗体、L多聚赖氨酸购自迈新公司，全组分ABC试剂盒购自华美公司。
1.2 标本的收集与处理
78例椎间盘取自椎间盘突出症手术的患者。14例非突出的椎间盘标本取自无椎间盘突出症的脊柱手术的患者(见表1)。
表1 材料
例数
颈椎间盘凸出型
2
腰椎间盘凸出型
, 百拇医药 40
腰椎间盘脱出型
24
腰椎间盘游离型
12
脊 柱 骨 折
10
第5腰椎滑脱
4
合 计
92
标本取得后于室温下在10%福尔马林溶液中过夜，然后用石蜡包埋。
1.3 免疫组织化学染色
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(1)石蜡切片56℃烘烤30min；(2)二甲苯脱蜡；(3)梯度酒精水化，PBS洗3次各5min(以下每2步之间若无特殊说明的就须PBS洗)；(4)3%过氧化氢室温下10min；(5)酶消化或抗原修复；(6)封闭剂处理；(7)勿洗，加一抗并在4℃下过夜；(8)二抗37℃下30min；(9)ABC复合物37℃下30min；(10)DAB显色；(11)苏木素复染，中性树胶封片。免疫组化阳性对照为迈新公司提供的阳性切片。阴性对照为实验时不加抗MMP3的单克隆抗体。
1.4 染色结果判断
本实验用DAB显色，而MMP3位于胞浆中，故阳性信号表现为胞浆棕褐色或棕黄色。苏木素复染后胞核为蓝色，胞浆颜色不变。
每张切片随机观察10个视野，并记录阳性软骨细胞率。阳性软骨细胞率=10个视野内阳性软骨细胞总数/10个视野内软骨细胞总数×100%。无阳性细胞记为(-)；偶见阳性细胞且在5%以下记为(±)；阳性细胞率<25%记为(+)；阳性细胞率为25%～50%时记为(++)；阳性细胞率>50%记为(+++)。
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1.5 统计方法 t检验。
2 结果
绝大多数椎间盘内MMP3染色阳性。突出椎间盘内MMP3阳性率为26%～82%，平均51.2%。非突出椎间盘内MMP3阳性率为2%～32%，平均17.1%。前者明显高于后者，其差异有非常显著性意义(t值为6.417，P<0.01)。在突出椎间盘组织中，脱出型及游离型的MMP3阳性率明显高于凸出型，其差异有非常显著性意义(t值为23.013，P<0.01)。脱出型与游离型的MMP3无显著差异(t值为0.178，P>0.05，表2)。
表2 免疫组织化学染色结果
+ + +
++
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±
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合计
非椎间盘突出
凸出型
脱出型
游离型
0
6
21
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3 讨论
椎间盘突出症的发生基础是椎间盘退变，其主要表现为基质内蛋白多糖、胶原、和弹性蛋白等生物大分子的结构、功能、含量及类型的变化。参与细胞外基质降解的酶系有4种：基质金属蛋白酶(MMP)、半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶以及天冬氨酸蛋白酶，MMP是降解细胞外基质的主要酶[1]。
人突出椎间盘中有过量MMP存在，削弱了纤维环的保护作用，使髓核易从后方和侧后方突出[1]。单纯增加髓核内的压力不会使椎间盘从侧后方突出，只有在纤维环相当薄弱时才出现[1]。Kang[5]等用生化方法对突出椎间盘和非突出椎间盘(脊柱侧凸或脊柱骨折手术时取得的椎间盘)内MMP进行检测，结果表明突出组的活性显著高于非突出组，其中以基质溶解素和明胶酶活性的增加尤为明显。Kanemoto[3]等研究显示在突出椎间盘中MMP3比非突出椎间盘的多。Kastui[2]等认为MMP3与椎间盘突出症有关。
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本实验用免疫组化抗生素蛋白—生物素—过氧化物酶复合体法检测了突出椎间盘和非突出椎间盘内MMP3的表达。结果与Kanemoto[3]的报道基本一致。突出组比非突出组多；脱出型及游离型比凸出型多。提示脱出型及游离型的退变程度比凸出型的更为严重，退变程度的差异是临床不同突出类型的生化基础。由于纤维环破裂后椎间盘可以脱出或游离，而此两型的MMP3无显著性差异，表明MMP3通过影响纤维环而在椎间盘突出症中起作用。
椎间盘的胶原80%是Ⅰ型和Ⅱ型[1]。纤维环内的胶原以Ⅰ型和Ⅱ型为主，此外还有Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅸ型[6，7]。髓核内的胶原以Ⅱ型为主，同时也有Ⅵ、Ⅸ及Ⅺ型[1]。MMP3虽不能直接降解Ⅰ型、Ⅵ型和Ⅺ型胶原，但可以通过活化其它的MMP对它们进行降解[1]。MMP3也能通过激活MMP2和MMP7对椎间盘内的弹性蛋白进行降解[1]。MMP3活化其它的MMP，及其与椎间盘突出症的关系有待进一步研究。
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胶原和弹性蛋白在降解后发生变性，导致结构强度下降；可溶性增加。胶原变性使纤维环薄弱，在外力作用下易发生纤维环破裂。弹性蛋白变性使椎间盘的弹性功能降低，影响了对所受机械力量的缓冲，长期反复作用，易发生椎间盘突出。所以，减少椎间盘内MMP3的含量或抑制其活性，可预防或减缓椎间盘退变，减少椎间盘突出症的发生。目前国外已用MMP的特异性组织抑制剂(TIMP)对骨关节炎进行临床试验性治疗[1]。TIMP可以抑制所有MMP成员的活性[1]，它能否用于椎间盘突出症还有待研究。
MMP3除了能影响胶原纤维和弹性蛋白外，还可降解蛋白多糖[1，2]。
椎间盘内蛋白多糖、胶原和弹性蛋白的密切配合是维持椎间盘良好力学性能的基础。蛋白多糖能抵抗压应力，胶原可以抵抗张应力。弹性蛋白有缓冲椎间盘所受机械力量的作用。椎间盘退变后它们不能密切配合。这也是纤维环破裂、椎间盘突出的另一个重要原因。
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一般认为，椎间盘突出症是在椎间盘退变的基础上发生的。外伤是其发病的重要诱因。MMP3不仅参与椎间盘退变，它和外伤也有关。椎间盘负重后其液静压升高，液静压超过3MPa时椎间盘内MMP3的分泌就会增多，加速了椎间盘的退变[8，9]。
综上所述，MMP3能改变椎间盘基质内蛋白多糖、胶原、和弹性蛋白等生物大分子的结构、功能及含量，从而在椎间盘退变和椎间盘突出中起作用。
椎间盘基质的降解有多种酶系参与。本实验仅从一个方面对MMP3与椎间盘突出症的关系作了探讨。对其它酶的作用及相互关系尚须进一步的研究。
作者简介：杨圣(1972-)，男，主治医师，硕士在读。研究方向：脊柱脊髓损伤。电话：(0852)8623430-8356
参考文献
, http://www.100md.com [1] Goupille H, Jayson M, Valat J, et al. Matrix metalloproteinases: the clue to intervertebral disc degeneration[J]. Spine,1998,23:1 612～1 626.
[2] Mastui Y, Maeda M, Nakagami W, et al. The involvement of matrix metalloproteinases and inflammation in lumbar disc herniation[J]. Spine, 1998,23:863～869.
[3] Kanemoto M, Hukuda S, Komiya Y, et al.Immunohistochemical study of matrix metalloproteinase-3 and tissue inhibitor of metalloproteinse-1 in human intervertebral discs[J]. Spine,1996,21:1～8.
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[4] Wu JJ, Lark MW, Chun LE, et al. Site of stromelysin cleavage in collagen types Ⅱ,Ⅸ，Ⅹ and Ⅵ of cartilage[J]. J Biolchem.1991,266:5 625～5 628.
[5] Kang JD, Georgescu HI, Mclntyre-Larkin L, et al. Herniated lumba intervertebral discs spontaneously produce matrix metalloproteinases nitric oxide, interleukin-6, and prostaglandin E2[J]. Spine,1996,21:271～277.
[6] Kaapa E,Han X, Holm S, et al.Collagen synthesis and types Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ and Ⅵ collagens in an animal model of disc degeneration[J]. Spine,1995,20:59～67.
, 百拇医药
[7] Roberts S, Menage J, Duance V, et al. Collagen types around the cells of the intervertebral disc and cartilage end plate: An immunolocalization study[J]. Spine,1991,16:1 030～1 038.
[8] Hutton W, Elmer W, Boden S, et al. The effect of hydrostatic pressure on intervertebral disc metabolism[J]. Spine,1999,24:1 507～1 515.
[9] Handa T, Ishihara H, Ohshima H, et al. Effects of hydrostatic pressure on matrix synthesis and matrix metalloproteinase production in the human lumbar intervertebral disc[J]. Spine 1997,22:1 085～1 091.
收稿：2000-03-27
修回：2000-07-18, 百拇医药