人p53/荧光蛋白融合基因在高转移人肝癌细胞中的表达与定位
人p53/荧光蛋白融合基因在高转移人肝癌细胞中的表达与定位
贺平 汤钊猷 叶胜龙 刘彬彬
摘 要 目的 观察p53基因在肝癌细胞中的正常表达及定位情况。方法 根据野生型p53基因的编码顺序，PCR方法扩增突变的wt-p53基因，使其3′端的终止密码TGA突变为TGG；用基因重组技术将其与绿色荧光蛋白(green fluorescence protein，GFP)融合，通过真核表达质粒-脂质体介导，导入人高转移肝癌细胞系MHCC97(PCR检测有p53基因突变)中。用荧光显微镜观察p53的表达情况。结果 MHCC97细胞中存在p53基因第249位的突变，而低转移人肝癌细胞LD20则无此突变。DNA顺序测定表明：wt-p53基因与GFP基因达到编码框架内融合。荧光显微镜显示：在空白载体pEGFP-N1转染的MHCC97细胞中荧光布满整个细胞，在转染阳性载体pEGFP-53的MHCC97细胞中荧光仅聚集在细胞核中。结论 p53基因第249位上的突变可能与肝癌细胞的转移特性有关；转染的人高转移肝癌细胞系MHCC97能高效表达p53蛋白，并定位于细胞核内，与野生型p53基因的表达方式相同。
, 百拇医药
关键词：癌，肝细胞；基因；蛋白；p53基因
我们利用新型分子探针—绿色荧光蛋白(green flu-orescence protein，GFP)的活细胞内示踪作用，将其基因与p53基因融合，导入高转移人肝癌细胞MHCC97中，直观地了解p53基因在细胞内的表达与定位情况。本项实验不仅为研究肝癌细胞转移途径提供新方法，而且为进一步研究恢复p53基因正常功能对肝癌细胞转移潜能的影响奠定基础。
材料与方法
1.野生型p53基因：质粒pC-53由美国M.D.Anderson癌症中心Mien-chie Hung教授赠送。其中含全长编码序列的人野生型p53 cDNA，长度为1179bp，编码393个氨基酸。
2.细胞及表达载体：人肝癌细胞系MHCC97由本所田健博士建立[1]，低转移人肝癌细胞模型由本所孙肪宪博士建立[2]。真核表达质粒pEGFP-N1购自美国Clontech公司，其中含巨细胞病毒启动子，PUC19载体购自Promega公司。JM109菌由本所保存。
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3.高转移人肝癌细胞系(MHCC97)中p53点突变的检测：根据p53基因第249位点突变的特点，合成p53基因第7外显子两侧引物：引物1：5′-ATG AAT TCG TTG GCT CGA CTG TAC CAC-3′，引物2：5′-CTG GAG TCT TCC AGT GTG AT-3′(北京Cybersyn公司)。MHCC97细胞培养(DMEM+10% AB血清)至107，按照Higuchi R 2:1方法抽提基因组DNA。PCR反应：基因组DNA 5μl，10×PCR缓冲液10μl，2mmol/L dNTPs 2μl，引物1+2混合液4μl，加水至49μl，95%变性5min，再加Taq polymerase 1μl(3U/μl)。PCR扩增产物用限制性内切酶酶解。
4.人野生型p53 cDNA终止密码突变：合成一对引物P1(5′-TC GAA TTC TGG AGG AGC CGC AGT C-3′)，P2(5′-AT GGA TCC CAG TCT GAG TCA GGC CCT TCT G-3′)，以pc-53为模板，用PCR方法扩增得到突变的p53 cDNA，其3′末端终止密码TAG被突变成TGG。用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ酶切，组装入质粒PUC19，命名为PUC19(mp53)。用DNA自动测序仪测定mp53 cDNA序列。
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5.重组真核表达载体pEGFP-53的构建：用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切PUC19(mp53)，电泳回收mp53 cDNA(11888bp)；用此双酶酶切pEGFP-N1，电泳回收4.7kb大小的大片段，两片段以20:1pmol分子混合连接，重组体命名为pEGFP-53。用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ，EcoRⅠ和HindⅢ，EcoRⅠ和PstⅠ三组酶分别酶切进行鉴定。
6.重组真核表达载体pEGFP-53转染高转移人肝癌细胞系MHCC97：用Qigen公司的DNA抽提试剂盒抽提重组体pEGFP-53，纯度达2.0。按照Gibco公司的转染试剂盒说明方法，将该重组体转染MHCC97细胞。
7.荧光显微镜观察p53在MHCC97中的表达情况：用Hank’s液轻轻洗涤细胞后，置于荧光显微镜下观察、拍照。
结 果
, 百拇医药 1.MHCC97中p53点突变：MHCC97细胞扩增的p53基因片段经限制性内切酶HaeⅢ酶切，只有110bp一条带，说明其p53基因第249位存在点突变；而从低转移人肝癌细胞LD20细胞中扩增的p53基因片段经限制性内切酶HaeⅢ酶切，有35bp和75bp两条带，说明其p53基因第249位没有发生点突变。
2.含人p53 cDNA突变体克隆mp53的鉴定：酶切鉴定，用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切为1188bp，2660bp；用EcoRⅠ和HindⅢ酶切为1223bp，2625bp；用EcoRⅠ和PstⅠ酶切为：1211bp，2637bp。说明该插入片段的大小与野生型p53基因相符。DNA顺序测定的结果如图1，编码基因长394bp，其终止密码TGA已突变为TGG，基因两侧含有EcoRⅠ和BamHⅠ位点。
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图1 野生型p53-荧光蛋白融合基因的部分顺序分析
3.pEGFP-53的鉴定：用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切为1188bp，5858bp；HindⅢ和BamHⅠ双酶切为1196bp，5850bp；BamHⅠ单酶切为线型化7046bp。表明mp53 cDNA片段正向插入真核表达载体pEGFP-N1中。
4.pEGFP-53转染MHCC97：用4μg重组DNA转染MHCC97细胞后24h，荧光显微镜下发现带有荧光的细胞数为：MHCC97(pEGFP-N1)4～6个/高倍镜下，MHCC97(pEGFP-53)5～8个/高倍镜下，说明用脂质体LipofectinAmine介导的质粒转染肝癌细胞的效率较高。
5.荧光显微镜观察p53在MHCC97中的表达情况：在对照细胞即MHCC97(pEGFP-N1)中荧光均匀地分布整个细胞图2A，说明仅仅表达了GFP荧光蛋白；而在阳性克隆细胞MHCC97(pEGFP-53)中，荧光聚集在细胞核内图2B，表明该细胞表达了p53-GFP融合蛋白。
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图2 p53-荧光蛋白融合基因在高转移人肝癌细胞中高效表达(×400)
讨 论
p53基因的突变或缺失能增强肿瘤细胞的侵润和转移。人们期望通过将p53基因导入有p53缺陷的肿瘤细胞中以恢复其功能。Xu等[3]通过逆转录病毒将野生型p53基因导入肝癌细胞中，细胞生长速度减慢，克隆数减少，对化疗药物的敏感性也增加。
GFP直接在紫外光激发下发出绿色荧光，可进行活细胞实时定位观察，蛋白表达在细胞中的分布和转运情况。由于GFP分子量小，尚未发现对所连目的基因的功能产生影响，且大量表达对细胞没有毒性。表达载体pEGFP-N1编码的GFPmut1经双突变(64位Phe→Leu和65位Ser→Thr)，吸收光谱发生红移，使其在哺乳细胞中的荧光强度及表达水平均比wtGFP有明显提高。最大激发峰为488nm，最大发射峰为507nm。EGFP基因作为一种新型的分子探针，正广泛地用于肿瘤有关基因的研究[4，5]。
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我们用PCR技术突变除去wtp53基因3′末端终止密码，并通过基因重组技术，将突变的mp53cDNA置于GFP基因的上游，并与GFP基因内实行框架内融合，两种基因之间通过一6肽(GAT CCA CCG GTC GCC ACC)相连。尽量减少两者之间的相互干扰，使它们保持各自蛋白质的天然构象，维持最大的生物学活性，融合基因在高转移人肝癌细胞中得到很高的表达。荧光显微镜下，可以清晰地看到转染了空白载体pEGFP-N1对照细胞，绿色荧光分布于整个细胞，而转染了mp53-GFP融合基因的pEGFP-53重组体的阳性克隆细胞，绿色荧光则聚集于细胞核内，这表明p53-GFP融合蛋白表达后定位转运到细胞核内，与野生型p53完全一致。
美国中华医学基金(CMB-95583)
贺平，女，34岁，博士，发表论文16篇
贺平(200032 上海，上海医科大学肝癌研究所)
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汤钊猷(200032 上海，上海医科大学肝癌研究所)
叶胜龙(200032 上海，上海医科大学肝癌研究所)
刘彬彬(200032 上海，上海医科大学肝癌研究所)
参考文献
[1]田健，汤钊猷，叶胜龙，等. 具有高转移潜能的人肝癌细胞系的建立及其生物学特性. 中华肿瘤杂志，1998，20: 405-408.
[2]Sun FX，Tang ZY，Liu KD，et al. Establishment of a metastatic model of human hepatocellular carcinoma in nude mice via orthotropic implantation of histologically intact tissue. Int J Cancer，1996，66: 239-243.
, http://www.100md.com
[3]Xu GW，Sun ZT，Forrester K，et al. Tissue-specific growth suppression and chemosensitivity promotion in human hepatocellular carcinoma cells by retroviral-mediated transfer of the wild-type p53 gene. Hepatology，1996，24: 1264-1268.
[4]Cormack BP，Valdivia RH，Falkow S. FACS-optimized mutatants of the green fluorescent protein(GFP). Gene，1996，173: 33-38.
[5]Zhao J，Zhou Q，Wiedmer T，et al. Palmitoylation of phospholipid scramblase is required for normal function in promoting Ca2+-activated transbilayer movement of membrane phospholipids. Biochemistry，1998，37: 6361-6366., http://www.100md.com
贺平 汤钊猷 叶胜龙 刘彬彬
摘 要 目的 观察p53基因在肝癌细胞中的正常表达及定位情况。方法 根据野生型p53基因的编码顺序，PCR方法扩增突变的wt-p53基因，使其3′端的终止密码TGA突变为TGG；用基因重组技术将其与绿色荧光蛋白(green fluorescence protein，GFP)融合，通过真核表达质粒-脂质体介导，导入人高转移肝癌细胞系MHCC97(PCR检测有p53基因突变)中。用荧光显微镜观察p53的表达情况。结果 MHCC97细胞中存在p53基因第249位的突变，而低转移人肝癌细胞LD20则无此突变。DNA顺序测定表明：wt-p53基因与GFP基因达到编码框架内融合。荧光显微镜显示：在空白载体pEGFP-N1转染的MHCC97细胞中荧光布满整个细胞，在转染阳性载体pEGFP-53的MHCC97细胞中荧光仅聚集在细胞核中。结论 p53基因第249位上的突变可能与肝癌细胞的转移特性有关；转染的人高转移肝癌细胞系MHCC97能高效表达p53蛋白，并定位于细胞核内，与野生型p53基因的表达方式相同。
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关键词：癌，肝细胞；基因；蛋白；p53基因
我们利用新型分子探针—绿色荧光蛋白(green flu-orescence protein，GFP)的活细胞内示踪作用，将其基因与p53基因融合，导入高转移人肝癌细胞MHCC97中，直观地了解p53基因在细胞内的表达与定位情况。本项实验不仅为研究肝癌细胞转移途径提供新方法，而且为进一步研究恢复p53基因正常功能对肝癌细胞转移潜能的影响奠定基础。
材料与方法
1.野生型p53基因：质粒pC-53由美国M.D.Anderson癌症中心Mien-chie Hung教授赠送。其中含全长编码序列的人野生型p53 cDNA，长度为1179bp，编码393个氨基酸。
2.细胞及表达载体：人肝癌细胞系MHCC97由本所田健博士建立[1]，低转移人肝癌细胞模型由本所孙肪宪博士建立[2]。真核表达质粒pEGFP-N1购自美国Clontech公司，其中含巨细胞病毒启动子，PUC19载体购自Promega公司。JM109菌由本所保存。
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3.高转移人肝癌细胞系(MHCC97)中p53点突变的检测：根据p53基因第249位点突变的特点，合成p53基因第7外显子两侧引物：引物1：5′-ATG AAT TCG TTG GCT CGA CTG TAC CAC-3′，引物2：5′-CTG GAG TCT TCC AGT GTG AT-3′(北京Cybersyn公司)。MHCC97细胞培养(DMEM+10% AB血清)至107，按照Higuchi R 2:1方法抽提基因组DNA。PCR反应：基因组DNA 5μl，10×PCR缓冲液10μl，2mmol/L dNTPs 2μl，引物1+2混合液4μl，加水至49μl，95%变性5min，再加Taq polymerase 1μl(3U/μl)。PCR扩增产物用限制性内切酶酶解。
4.人野生型p53 cDNA终止密码突变：合成一对引物P1(5′-TC GAA TTC TGG AGG AGC CGC AGT C-3′)，P2(5′-AT GGA TCC CAG TCT GAG TCA GGC CCT TCT G-3′)，以pc-53为模板，用PCR方法扩增得到突变的p53 cDNA，其3′末端终止密码TAG被突变成TGG。用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ酶切，组装入质粒PUC19，命名为PUC19(mp53)。用DNA自动测序仪测定mp53 cDNA序列。
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5.重组真核表达载体pEGFP-53的构建：用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切PUC19(mp53)，电泳回收mp53 cDNA(11888bp)；用此双酶酶切pEGFP-N1，电泳回收4.7kb大小的大片段，两片段以20:1pmol分子混合连接，重组体命名为pEGFP-53。用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ，EcoRⅠ和HindⅢ，EcoRⅠ和PstⅠ三组酶分别酶切进行鉴定。
6.重组真核表达载体pEGFP-53转染高转移人肝癌细胞系MHCC97：用Qigen公司的DNA抽提试剂盒抽提重组体pEGFP-53，纯度达2.0。按照Gibco公司的转染试剂盒说明方法，将该重组体转染MHCC97细胞。
7.荧光显微镜观察p53在MHCC97中的表达情况：用Hank’s液轻轻洗涤细胞后，置于荧光显微镜下观察、拍照。
结 果
, 百拇医药 1.MHCC97中p53点突变：MHCC97细胞扩增的p53基因片段经限制性内切酶HaeⅢ酶切，只有110bp一条带，说明其p53基因第249位存在点突变；而从低转移人肝癌细胞LD20细胞中扩增的p53基因片段经限制性内切酶HaeⅢ酶切，有35bp和75bp两条带，说明其p53基因第249位没有发生点突变。
2.含人p53 cDNA突变体克隆mp53的鉴定：酶切鉴定，用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切为1188bp，2660bp；用EcoRⅠ和HindⅢ酶切为1223bp，2625bp；用EcoRⅠ和PstⅠ酶切为：1211bp，2637bp。说明该插入片段的大小与野生型p53基因相符。DNA顺序测定的结果如图1，编码基因长394bp，其终止密码TGA已突变为TGG，基因两侧含有EcoRⅠ和BamHⅠ位点。
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图1 野生型p53-荧光蛋白融合基因的部分顺序分析
3.pEGFP-53的鉴定：用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切为1188bp，5858bp；HindⅢ和BamHⅠ双酶切为1196bp，5850bp；BamHⅠ单酶切为线型化7046bp。表明mp53 cDNA片段正向插入真核表达载体pEGFP-N1中。
4.pEGFP-53转染MHCC97：用4μg重组DNA转染MHCC97细胞后24h，荧光显微镜下发现带有荧光的细胞数为：MHCC97(pEGFP-N1)4～6个/高倍镜下，MHCC97(pEGFP-53)5～8个/高倍镜下，说明用脂质体LipofectinAmine介导的质粒转染肝癌细胞的效率较高。
5.荧光显微镜观察p53在MHCC97中的表达情况：在对照细胞即MHCC97(pEGFP-N1)中荧光均匀地分布整个细胞图2A，说明仅仅表达了GFP荧光蛋白；而在阳性克隆细胞MHCC97(pEGFP-53)中，荧光聚集在细胞核内图2B，表明该细胞表达了p53-GFP融合蛋白。
, http://www.100md.com
图2 p53-荧光蛋白融合基因在高转移人肝癌细胞中高效表达(×400)
讨 论
p53基因的突变或缺失能增强肿瘤细胞的侵润和转移。人们期望通过将p53基因导入有p53缺陷的肿瘤细胞中以恢复其功能。Xu等[3]通过逆转录病毒将野生型p53基因导入肝癌细胞中，细胞生长速度减慢，克隆数减少，对化疗药物的敏感性也增加。
GFP直接在紫外光激发下发出绿色荧光，可进行活细胞实时定位观察，蛋白表达在细胞中的分布和转运情况。由于GFP分子量小，尚未发现对所连目的基因的功能产生影响，且大量表达对细胞没有毒性。表达载体pEGFP-N1编码的GFPmut1经双突变(64位Phe→Leu和65位Ser→Thr)，吸收光谱发生红移，使其在哺乳细胞中的荧光强度及表达水平均比wtGFP有明显提高。最大激发峰为488nm，最大发射峰为507nm。EGFP基因作为一种新型的分子探针，正广泛地用于肿瘤有关基因的研究[4，5]。
, 百拇医药
我们用PCR技术突变除去wtp53基因3′末端终止密码，并通过基因重组技术，将突变的mp53cDNA置于GFP基因的上游，并与GFP基因内实行框架内融合，两种基因之间通过一6肽(GAT CCA CCG GTC GCC ACC)相连。尽量减少两者之间的相互干扰，使它们保持各自蛋白质的天然构象，维持最大的生物学活性，融合基因在高转移人肝癌细胞中得到很高的表达。荧光显微镜下，可以清晰地看到转染了空白载体pEGFP-N1对照细胞，绿色荧光分布于整个细胞，而转染了mp53-GFP融合基因的pEGFP-53重组体的阳性克隆细胞，绿色荧光则聚集于细胞核内，这表明p53-GFP融合蛋白表达后定位转运到细胞核内，与野生型p53完全一致。
美国中华医学基金(CMB-95583)
贺平，女，34岁，博士，发表论文16篇
贺平(200032 上海，上海医科大学肝癌研究所)
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汤钊猷(200032 上海，上海医科大学肝癌研究所)
叶胜龙(200032 上海，上海医科大学肝癌研究所)
刘彬彬(200032 上海，上海医科大学肝癌研究所)
参考文献
[1]田健，汤钊猷，叶胜龙，等. 具有高转移潜能的人肝癌细胞系的建立及其生物学特性. 中华肿瘤杂志，1998，20: 405-408.
[2]Sun FX，Tang ZY，Liu KD，et al. Establishment of a metastatic model of human hepatocellular carcinoma in nude mice via orthotropic implantation of histologically intact tissue. Int J Cancer，1996，66: 239-243.
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[3]Xu GW，Sun ZT，Forrester K，et al. Tissue-specific growth suppression and chemosensitivity promotion in human hepatocellular carcinoma cells by retroviral-mediated transfer of the wild-type p53 gene. Hepatology，1996，24: 1264-1268.
[4]Cormack BP，Valdivia RH，Falkow S. FACS-optimized mutatants of the green fluorescent protein(GFP). Gene，1996，173: 33-38.
[5]Zhao J，Zhou Q，Wiedmer T，et al. Palmitoylation of phospholipid scramblase is required for normal function in promoting Ca2+-activated transbilayer movement of membrane phospholipids. Biochemistry，1998，37: 6361-6366., http://www.100md.com