喉癌中人乳头状瘤病毒感染的检测及其临床分析
作者：吕春雷 李兆基 周水淼 廖建春 萧璧君 范静平
单位：吕春雷 李兆基 周水淼(长海医院耳鼻咽喉科)；廖建春 萧璧君 范静平(第二军医大学长征医院耳鼻咽喉科，上海 200003)
关键词：喉癌；人乳头状瘤病毒；感染
第二军医大学学报001212 [摘要] 目的：探讨喉鳞状细胞癌中人乳头状瘤病毒(HPV16,1 8亚型)感染情况及临床分析。方法：用免疫组化的方法对42例喉鳞 癌组织中HPV16，18亚型感染情况进行检测。结果：42例喉鳞癌 组织中HPV16，18亚型感染阳性率64.29%(27/42)，但HPV16,18感染与临床分期 、癌细胞的分化程度、肿瘤的淋巴结转移和临床分型无关。结论：HPV 16，18感染可能是人喉癌形成的触发因素，它对肿瘤生物学行为的影响似乎不大。
, http://www.100md.com
[中图分类号] R 739.6502 [文献标识码] A
[文章编号] 0258-879X(2000)12-1135-02
Detection of human papilloma virus in laryngeal squamous cell cancer and study o f its clinical correlation
LIAO Jian-Chun XIAO Bi-Jun FAN Jing-Ping
(Department of Otolaryn gology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003 , China)
, 百拇医药 Lü Chun-Lei LI Zhao-Ji ZHOU Shui-Miao
(Department of Otolaryngology, Changhai Hospital)
[ABSTRACT] Objective: To investigate the infection of human p apilloma virus 16 and 18 (HPV16,18 ) subtype in laryngeal squamous cell cancer, and study the relationship with clinical cases. Methods: Forty-two specimens from laryngeal squamous cell cancer were assayed by us ing immunohistochemical method. Results and Conclusion: The posi tive rate of HPV16,18 subtype infection in the 42 specimens is 64.29%(27/4 2). The infection of HPV16,18 subtype has no relationship with malignant d egree, clinical stage, clinical type and lymph metastasis.
, http://www.100md.com
[KEY WORDS] laryngeal cancer; human papilloma virus; infecti on
人乳头状瘤病毒(human papilloma virus， HPV)是人体诸多部位的表皮和粘膜的致瘤因 子，并参与这些部位的恶性肿瘤的发生。HPV是喉粘膜感染的常见病毒，与喉良、恶性肿瘤 有着密切的关系。HPV在喉癌中的致癌作用，是目前喉癌病毒病因学研究的重要内容之一,特 别是高危组HPV16,18两种亚型，被认为与喉癌的发生密切相关。本文采用免疫组化技 术，对喉鳞癌标本中HPV16,18亚型感染情况进行检测和分析。
1 材料和方法
1.1 标本和来源 我们收集了1995～1997年间长征医院耳鼻咽喉科42例喉癌的手 术标本,经病理证实为喉鳞状细胞癌，其中男性35例,女性7例,年龄38～76岁。声门上型10例 ,声 门型19例,声门下型13例。临床分期：Ⅰ期20例，Ⅱ～Ⅳ 期22例(临床分类、分期标准参照 国际抗癌协会UICC于1987年修订的喉癌TNM分类、分期标准)；按细胞分化程度：Ⅰ级16例 ，Ⅱ～Ⅲ级26例；有颈淋巴结转移15例，无颈淋巴结转移27例。以上所有标本均用1 0%甲醛固定、石蜡包埋，作4 μm的连续切片。
, 百拇医药
1.2 实验药品 LSAB试剂盒及B-SAR 生物素标记羊抗体(丹麦 Dako公司)；兔 抗HPV16,18混合抗体(上海复华公司)；1%胰蛋白酶(美国 Sigma公司)。
1.3 方法和步骤 按EnVrsron方法进行，石蜡切片脱蜡至水，PBS洗3 min；3% H 2O2浸泡20 min，PBS洗3 min×3；1%胰蛋白酶消化30 min(37℃)，PBS洗3 min×3； 兔抗HPV16,18混合抗体(1∶50)40℃孵育过夜，PBS洗3 min×3；生物素标记羊抗兔 IgG(1∶100 )37℃孵育40 min，PBS洗3 min×3。用链霉亲合素辣根过氧化酶复合物(1∶ 100 )37℃孵育30 min；PBS洗3 min×3，用0.05% DAB+0.03% H2O2显色8～15 min,流 水洗,苏木精衬染，常规封片。用已知宫颈癌阳性切片作阳性对照，以PBS代替一抗作空白对 照，以兔血清代替一抗作阴性对照[1]。
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1.4 判断标准 结果判断：阳性细胞<10%为“-”，阳性细胞10%～60%为“+”， 阳性细胞>60%为“++”，为便于统计，“+”,“++”记为“+”。
1.5 统计学处理 采用χ2检验。
2 结 果
免疫组化显示HPV16，18亚型阳性信号呈棕色颗粒，主要分布于细胞核及核周(图 1，见封三)。42例喉癌标本的HPV16，18亚型感染的阳性率为64.29%(27/4 2)。HPV16，18亚型感染与临床分型无关(各型之间两两相比P>0.05)。H PV16，18亚型感染与临床分期、癌细胞的分化程度以及颈淋巴结转移无关(P> 0.05)(表1)。
表 1 人喉癌组织中HPV16，18(亚型)感染阳性的检测
, http://www.100md.com
Tab 1 The detection of HPV16，18 subtype
infection in human laryngeal carcinoma Classification
n
HPV+
HPV-
Positive rate(%)
Position
Supraglottic
10
6
, 百拇医药
4
60.00
Glottic
19
12
7
63.16
Subglottic
13
9
4
69.23
Cell grade
, 百拇医药
Ⅰ
16
10
6
62.50
Ⅱ-Ⅲ
26
17
9
65.38
Clinical stage
Ⅰ
20
, 百拇医药
11
9
55.00
Ⅱ-Ⅳ
22
16
6
72.73
Metastasis
Positive
15
10
5
, 百拇医药
66.67
Negative
27
17
10
62.96
图1 人喉癌组织中HPV16,18阳性的检测(EnVision，×200)
Fig.1 Positive detection of HPV16,18 in human laryngeal carcinoma(EnVision，×200)
3 讨论
, http://www.100md.com
HPV属多空病毒群中的乳头状瘤亚群，其颗粒由DNA和蛋白质组成，直径为55 nm。HPV是 一种嗜上皮性病毒，寄生条件严格，具有高度宿主和组织、器官特异性，它只感染人的皮肤 和粘膜，导致组织的异常增生。HPV的DNA在宿主细胞核内复制，其全部基因均位于一条DNA 链中。病毒进入宿主细胞后不断刺激细胞增殖，病毒在宿主细胞内以3种形式存在：(1)完 整的病毒颗粒,(2)游离的DNA,(3)与宿主细胞DNA结合。目前发现HPV有60多种型别， 分型主要依靠核酸杂交的方法。按目前的划分：HPV可分为高危组(HPV16，18)及低 危组(HPV6，11)。高危组主要通过病毒的DNA整合入宿主细胞基因组而产生致癌作 用，低危组则无此作用。HPV DNA整合于宿主细胞的染色体上，改变了宿主细胞的遗传性状 ，构成了癌变的基础[2，3]。目前，支持HPV可能是喉癌病毒性病因的证据 有：(1)某些喉的癌前病变与HPV感染密切相关，如喉乳头状瘤和慢性增生性喉炎等；(2)在喉鳞 状细胞癌组织中，高危HPV阳性率较高，特别是喉疣状癌中，HPV感染高达100%；(3)用核 酸杂交结果表明，HPV感染阳性的喉鳞状细胞癌组织中有病毒基因组的整合；(4)HPV早期 基因组编码的肿瘤蛋白能使体外培养的细胞恶性转化，将此转化的细胞移植到实验动物体内 ，短期内即可引起恶性肿瘤[4，5]。本研究检测在喉癌组织中HPV的感染率为64.29 %。标本结合临床资料发现，HPV感染与喉癌的临床分型、分期、细胞分化程度、颈淋巴结转 移等无明显关系。据此，我们推断：喉癌的发生过程中，HPV感染可能系触发因素之一，它 可导致肿瘤的形成，但对肿瘤的生物学行为影响不大。
, 百拇医药
[基金项目] 国家自然科学基金资助项目(39770792).
[作者简介] 吕春雷(1967-)，男(汉族)，博士生，主治医师.
参考文献
[1] 倪灿荣 主编.免疫组织化学实验新技术及应用[M].北京：北京科学 技术出版社，1993.220-222.
[2] Perez-Ayala M, Ruiz-Cabello F, Esteban F, et al. Presence of HP V16 sequences in laryngeal carcinomas[J]. Int J Cancer, 1990,46(1):8-1 1.
[3] Morgan DW, Abdullah V, Quiney R, et al, Human papilloma virus and carcinoma of the larynopharynx[J]. J Laryngol Otol,1991,105(4):288-290.
, 百拇医药
[4] Kasperbauer JL，O′Halloran GL，Espy MJ，et al. Polymerase chain reaction (PCR) identification of human papilloma virus(HPV) DNA in verrucous ca rcinoma of the larynx[J]. Laryngoscope,1993,103(4 pt 1):416-420.
[5] Scheffner M, Werness BA, Huibregtse JM, et al. The E6 oncoprotein encoded by human papilloma virus types 16 and 18 promotes the degradation of P5 3[J]. Cell,1990,63(6):1129-1136.
[收稿日期] 2000-05-27
[修回日期] 2000-10-30, 百拇医药
单位：吕春雷 李兆基 周水淼(长海医院耳鼻咽喉科)；廖建春 萧璧君 范静平(第二军医大学长征医院耳鼻咽喉科，上海 200003)
关键词：喉癌；人乳头状瘤病毒；感染
第二军医大学学报001212 [摘要] 目的：探讨喉鳞状细胞癌中人乳头状瘤病毒(HPV16,1 8亚型)感染情况及临床分析。方法：用免疫组化的方法对42例喉鳞 癌组织中HPV16，18亚型感染情况进行检测。结果：42例喉鳞癌 组织中HPV16，18亚型感染阳性率64.29%(27/42)，但HPV16,18感染与临床分期 、癌细胞的分化程度、肿瘤的淋巴结转移和临床分型无关。结论：HPV 16，18感染可能是人喉癌形成的触发因素，它对肿瘤生物学行为的影响似乎不大。
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[中图分类号] R 739.6502 [文献标识码] A
[文章编号] 0258-879X(2000)12-1135-02
Detection of human papilloma virus in laryngeal squamous cell cancer and study o f its clinical correlation
LIAO Jian-Chun XIAO Bi-Jun FAN Jing-Ping
(Department of Otolaryn gology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003 , China)
, 百拇医药 Lü Chun-Lei LI Zhao-Ji ZHOU Shui-Miao
(Department of Otolaryngology, Changhai Hospital)
[ABSTRACT] Objective: To investigate the infection of human p apilloma virus 16 and 18 (HPV16,18 ) subtype in laryngeal squamous cell cancer, and study the relationship with clinical cases. Methods: Forty-two specimens from laryngeal squamous cell cancer were assayed by us ing immunohistochemical method. Results and Conclusion: The posi tive rate of HPV16,18 subtype infection in the 42 specimens is 64.29%(27/4 2). The infection of HPV16,18 subtype has no relationship with malignant d egree, clinical stage, clinical type and lymph metastasis.
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[KEY WORDS] laryngeal cancer; human papilloma virus; infecti on
人乳头状瘤病毒(human papilloma virus， HPV)是人体诸多部位的表皮和粘膜的致瘤因 子，并参与这些部位的恶性肿瘤的发生。HPV是喉粘膜感染的常见病毒，与喉良、恶性肿瘤 有着密切的关系。HPV在喉癌中的致癌作用，是目前喉癌病毒病因学研究的重要内容之一,特 别是高危组HPV16,18两种亚型，被认为与喉癌的发生密切相关。本文采用免疫组化技 术，对喉鳞癌标本中HPV16,18亚型感染情况进行检测和分析。
1 材料和方法
1.1 标本和来源 我们收集了1995～1997年间长征医院耳鼻咽喉科42例喉癌的手 术标本,经病理证实为喉鳞状细胞癌，其中男性35例,女性7例,年龄38～76岁。声门上型10例 ,声 门型19例,声门下型13例。临床分期：Ⅰ期20例，Ⅱ～Ⅳ 期22例(临床分类、分期标准参照 国际抗癌协会UICC于1987年修订的喉癌TNM分类、分期标准)；按细胞分化程度：Ⅰ级16例 ，Ⅱ～Ⅲ级26例；有颈淋巴结转移15例，无颈淋巴结转移27例。以上所有标本均用1 0%甲醛固定、石蜡包埋，作4 μm的连续切片。
, 百拇医药
1.2 实验药品 LSAB试剂盒及B-SAR 生物素标记羊抗体(丹麦 Dako公司)；兔 抗HPV16,18混合抗体(上海复华公司)；1%胰蛋白酶(美国 Sigma公司)。
1.3 方法和步骤 按EnVrsron方法进行，石蜡切片脱蜡至水，PBS洗3 min；3% H 2O2浸泡20 min，PBS洗3 min×3；1%胰蛋白酶消化30 min(37℃)，PBS洗3 min×3； 兔抗HPV16,18混合抗体(1∶50)40℃孵育过夜，PBS洗3 min×3；生物素标记羊抗兔 IgG(1∶100 )37℃孵育40 min，PBS洗3 min×3。用链霉亲合素辣根过氧化酶复合物(1∶ 100 )37℃孵育30 min；PBS洗3 min×3，用0.05% DAB+0.03% H2O2显色8～15 min,流 水洗,苏木精衬染，常规封片。用已知宫颈癌阳性切片作阳性对照，以PBS代替一抗作空白对 照，以兔血清代替一抗作阴性对照[1]。
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1.4 判断标准 结果判断：阳性细胞<10%为“-”，阳性细胞10%～60%为“+”， 阳性细胞>60%为“++”，为便于统计，“+”,“++”记为“+”。
1.5 统计学处理 采用χ2检验。
2 结 果
免疫组化显示HPV16，18亚型阳性信号呈棕色颗粒，主要分布于细胞核及核周(图 1，见封三)。42例喉癌标本的HPV16，18亚型感染的阳性率为64.29%(27/4 2)。HPV16，18亚型感染与临床分型无关(各型之间两两相比P>0.05)。H PV16，18亚型感染与临床分期、癌细胞的分化程度以及颈淋巴结转移无关(P> 0.05)(表1)。
表 1 人喉癌组织中HPV16，18(亚型)感染阳性的检测
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Tab 1 The detection of HPV16，18 subtype
infection in human laryngeal carcinoma Classification
n
HPV+
HPV-
Positive rate(%)
Position
Supraglottic
10
6
, 百拇医药
4
60.00
Glottic
19
12
7
63.16
Subglottic
13
9
4
69.23
Cell grade
, 百拇医药
Ⅰ
16
10
6
62.50
Ⅱ-Ⅲ
26
17
9
65.38
Clinical stage
Ⅰ
20
, 百拇医药
11
9
55.00
Ⅱ-Ⅳ
22
16
6
72.73
Metastasis
Positive
15
10
5
, 百拇医药
66.67
Negative
27
17
10
62.96
图1 人喉癌组织中HPV16,18阳性的检测(EnVision，×200)
Fig.1 Positive detection of HPV16,18 in human laryngeal carcinoma(EnVision，×200)
3 讨论
, http://www.100md.com
HPV属多空病毒群中的乳头状瘤亚群，其颗粒由DNA和蛋白质组成，直径为55 nm。HPV是 一种嗜上皮性病毒，寄生条件严格，具有高度宿主和组织、器官特异性，它只感染人的皮肤 和粘膜，导致组织的异常增生。HPV的DNA在宿主细胞核内复制，其全部基因均位于一条DNA 链中。病毒进入宿主细胞后不断刺激细胞增殖，病毒在宿主细胞内以3种形式存在：(1)完 整的病毒颗粒,(2)游离的DNA,(3)与宿主细胞DNA结合。目前发现HPV有60多种型别， 分型主要依靠核酸杂交的方法。按目前的划分：HPV可分为高危组(HPV16，18)及低 危组(HPV6，11)。高危组主要通过病毒的DNA整合入宿主细胞基因组而产生致癌作 用，低危组则无此作用。HPV DNA整合于宿主细胞的染色体上，改变了宿主细胞的遗传性状 ，构成了癌变的基础[2，3]。目前，支持HPV可能是喉癌病毒性病因的证据 有：(1)某些喉的癌前病变与HPV感染密切相关，如喉乳头状瘤和慢性增生性喉炎等；(2)在喉鳞 状细胞癌组织中，高危HPV阳性率较高，特别是喉疣状癌中，HPV感染高达100%；(3)用核 酸杂交结果表明，HPV感染阳性的喉鳞状细胞癌组织中有病毒基因组的整合；(4)HPV早期 基因组编码的肿瘤蛋白能使体外培养的细胞恶性转化，将此转化的细胞移植到实验动物体内 ，短期内即可引起恶性肿瘤[4，5]。本研究检测在喉癌组织中HPV的感染率为64.29 %。标本结合临床资料发现，HPV感染与喉癌的临床分型、分期、细胞分化程度、颈淋巴结转 移等无明显关系。据此，我们推断：喉癌的发生过程中，HPV感染可能系触发因素之一，它 可导致肿瘤的形成，但对肿瘤的生物学行为影响不大。
, 百拇医药
[基金项目] 国家自然科学基金资助项目(39770792).
[作者简介] 吕春雷(1967-)，男(汉族)，博士生，主治医师.
参考文献
[1] 倪灿荣 主编.免疫组织化学实验新技术及应用[M].北京：北京科学 技术出版社，1993.220-222.
[2] Perez-Ayala M, Ruiz-Cabello F, Esteban F, et al. Presence of HP V16 sequences in laryngeal carcinomas[J]. Int J Cancer, 1990,46(1):8-1 1.
[3] Morgan DW, Abdullah V, Quiney R, et al, Human papilloma virus and carcinoma of the larynopharynx[J]. J Laryngol Otol,1991,105(4):288-290.
, 百拇医药
[4] Kasperbauer JL，O′Halloran GL，Espy MJ，et al. Polymerase chain reaction (PCR) identification of human papilloma virus(HPV) DNA in verrucous ca rcinoma of the larynx[J]. Laryngoscope,1993,103(4 pt 1):416-420.
[5] Scheffner M, Werness BA, Huibregtse JM, et al. The E6 oncoprotein encoded by human papilloma virus types 16 and 18 promotes the degradation of P5 3[J]. Cell,1990,63(6):1129-1136.
[收稿日期] 2000-05-27
[修回日期] 2000-10-30, 百拇医药