从蜂毒中分离纯化蜂毒肽的实验研究
作者：徐彭 欧阳永伟 黄敬耀 张桂英 肖诚 刘波
单位：江西中医学院基础部 南昌 330006
关键词：
中草药001206
摘 要 为了建立一条适合国内采用的提取纯化蜂毒肽的工艺路线，本 课题采用溶媒萃取、化学裂解和含与不含4 mol/L脲的醋酸盐缓冲液的两次凝胶过滤柱层析 的方法，可以从蜂毒中得到电泳纯的蜂毒肽，其静脉注射的LD50为4.0 mg/kg，在试 管内的HD50为8.0 mg/L，在0.25 mg/L时，即可使红细胞膜的流动性有明显增强。
蜜蜂毒(Bee Venom，简称蜂毒)是由蜜蜂毒腺产生后贮存于毒囊中，当蜜蜂受刺激时从其尾 部螫针排出的一种毒液，蜂毒能治病的偶然，开创了人类利用蜂毒治病的悠久历史。虽然蜂 毒 是经受了千百年长时期考验的对某些疾病确有疗效的天然药物，古今中外对蜂毒医疗应用积 有丰富的经验，而且蜂毒资源丰富，现代关于蜂毒的基础与应用研究也相当活跃，但到目 前为止，蜂毒的临床应用仍很有限，尚未有任何国家将蜂毒的制剂收入药典，究其原因，主 要是蜂毒的成分众多，作用复杂，制成单体制剂的工艺复杂，成本较高，因此，探索提纯蜂 毒单体成分的研究很有意义。在蜂毒的众多成分中，以蜂毒肽(melittin)的含量最高，生物 活性最强，具有最为广阔的临床应用前景[1]。国外虽有其分离提纯方法的报道 [2，3]，但其工艺复杂、条件苛刻，难以在工业生产中采用。本文报道一条适合国内 使用的提取纯化蜂毒肽的工艺路线。
, http://www.100md.com
1 试剂与仪器
1.1 蜜蜂毒：购自浙江省缙云县养蜂场，系由西方蜜蜂(Apis mellifera，亦称为意蜂)的工蜂螫针排出的一种毒液，用取毒器收集并干燥成粉末状。购进后，经 蒸馏水(4 ℃)溶解并过滤除去蜜蜂螫针等不溶物，冷冻干燥得淡黄色粉末(此为原料蜂毒)， 干燥器内保存备用。
1.2 试剂：葡聚糖凝胶Sephadex G-10、G-25、G-50均为中国长征制药厂产品，盐酸 胍、溴化氰均为华美生物工程公司进口分装产品、化学纯，Ampholin为瑞典LKB公司产品， 亚硫酸钠和对氯汞苯甲酸均为国产化学纯，氨水、正丁醇、甲酸等均为国产分析纯。
1.3 仪器：HD-85-5 AI核酸蛋白检测仪为浙江省永嘉电器厂产品，WLB-78-C型电子微 量泵为浙江新昌国康仪器厂产品，BS-100A自动部分收集器和TH-1000梯度混合器均为上海 沪西分析仪器厂产品，ZF-Q81旋转浓缩蒸发器为上海医械专机厂产品，Yamato冷冻干燥器 为日本大和株式会社产品，DYY-Ⅲ8B型稳压稳流定时电泳仪为北京六一仪器厂产品，721分 光光度计为上海第三分析仪器厂产品。
, 百拇医药
1.4 动物：昆明种小鼠、普通种家兔均由江西中医学院动物房提供。
2 方法与结果
2.1 蜂毒肽的分离纯化
2.1.1 蜂毒的溶媒萃取：参照文献[2]，取蜂毒500 mg，溶于30 mL 0.15 mol/ L NH4OH中，加入20 mL正丁醇，剧烈振摇，离心(3 000 r/min) 20 min，收集醇层并 继续用正丁醇萃取2 次，合并萃取液，25 ℃回收正丁醇，冷冻干燥，得产物A(简称A)437 m g。
2.1.2 产物A的凝胶过滤柱层析：取产物A 100 mg，溶解于10.0 mL含有4 mol/L脲的醋 酸 盐缓冲液(0.05 mol/L，pH 4.75，此为缓冲液甲)中，上葡聚糖凝胶G-50柱(2×80 cm)， 用 缓冲液甲洗脱(图1)，洗脱液以溶血试验进行蜂毒肽的生物活性跟踪，收集溶血活性作用最 强的吸收峰Ⅴ共55 mL，旋转蒸发器(25 ℃)浓缩，浓缩液通过葡聚糖凝胶G-10(2×50 cm) 柱脱盐，冷冻干燥，得产物B 77 mg。
, 百拇医药
图1 A的Sephadex G-50层析
2.1.3 产物B的化学裂解：参照文献[3]，取产物B 77 mg，溶解于20 mL的含有3 mol/L盐酸胍、55 mmol/L亚硫酸钠和2.3 mmol/L对氯汞苯甲酸的溶液中，整个溶液用NH 4 OH调到pH 7.0，在37 ℃孵化2 h，然后此溶液按上法脱盐并冻干，冻干物溶于装有70%甲酸 3 0 mL的带塞玻璃瓶中，加入50 mg的溴化氰结晶，混合，在室温下保持24 h，然后用水稀释5 倍并按上法浓缩、脱盐并冻干，得产物C(简称C)60 mg。
2.1.4 产物C的凝胶过滤柱层析：取产物C 60 mg溶解于2.0 mL醋酸盐缓冲液(0.05 mol /L ，pH 4.75，此为缓冲液乙)中，上葡聚糖凝胶G-25柱(1.0×100 cm)，用缓冲液乙洗脱(图2)，洗脱液以溶血试验进行蜂毒肽的活性跟踪，收集溶血活性作用最强的吸收峰Ⅱ共40 mL， 按上法浓缩、脱盐并冻干，得产物D 45 mg，此即为产物蜂毒肽。产物蜂毒肽的得率为39.3 3 mg/100 mg蜂毒(437/500=0.874，0.874×45/100=0.3933)。
, 百拇医药
图2 C的Sephadex G-25层析
2.2 产物蜂毒肽的生物活性测定
2.2.1 半数致死量(LD50)的测定：取体重18～20 g健康小鼠100 只，雌雄搭配， 随机均匀分成10 组。产物蜂毒肽及蜂毒各用5 个剂量组，剂量按等比级数排列，剂量间比 例为1∶0.75，静脉注射给药，给药后观察并记录小鼠的死亡情况，实验数据按Litchfiedl d & Wilcoxon方法用对数机率方格纸作图，测得蜂毒的LD50为4.3 mg/kg，产物蜂毒 肽的LD50为4.0 mg/kg。
2.2.2 半数溶血量(HD50)的测定：参照文献[3]，取产物蜂毒肽及蜂毒进 行溶血试验观察，测得产物蜂毒肽的HD50为8.0 mg/L，蜂毒的HD50为9.0 mg /L。
, 百拇医药
2.2.3 对家兔红细胞膜流动性的影响：参照文献[4，5]，取产物蜂毒肽及蜂毒 进行对家兔红细胞膜流动性影响的体外试验观察，结果见表1。
表1 蜂毒和蜂毒肽对兔红细胞流动性的影响( n=9)
药物浓度(mg/L)
荧光偏振度
红细胞膜微粘度
红细胞膜流动性能
对照组
-
0.357±0.006
6.970±0.536
, 百拇医药
1.123±0.087
蜂毒低剂量组
0.53
0.342±0.020*
5.986±1.270*
1 .380±0.338*
蜂毒高剂量组
1.07
0.328±0.020**
5.108±1.082**
, 百拇医药
1.633±0.355**
蜂毒肽低剂量组
0.25
0.339±0.014*
5.888±0.992*
1.40 4±0.335*
蜂毒肽高剂量组
0.50
0.333±0.016**
5.267±1.006**
, 百拇医药
1.594±0.342**
*P<0.05， **P<0.012.3 产物蜂毒肽的生化性质鉴定
2.3.1 纯度测定：按文献方法[6]，分别作产物蜂毒肽及蜂毒的十二烷基硫酸钠 (SDS)聚丙胺凝胶电泳，电泳的结果显示：产物蜂毒肽为一条带，蜂毒有5 条明显的条带。
2.3.2 等电点测定：按文献方法[6]，用两性载体Ampholine (pH4～11)作产物 蜂毒肽的凝胶等电聚焦电泳，测得其等电点为10.5。
3 讨论
蜂毒肽是一种含有26个氨基酸的小分子多肽，是蜂毒中的最主要毒性成分，生物活性强，尤 其是具有很强的溶血活性；含量高，约占蜂毒干重的50%；属强碱性疏水性多肽，具可逆性 的油水两亲性，对生物膜具有特定的作用，已广泛地用作为膜研究的工具药和临床用药的前 期实验研究。同时，蜂毒中还含有多个其它小分子的多肽，因此，蜂毒肽的分离提纯一直是 众多学者关注的问题[1～3]，本研究利用蜂毒肽的油水两亲性和其分子结构中不含 巯基及双巯键[1]，进行溶媒萃取和化学裂解处理，同时利用其在浓度高时常以四 聚体形式存在[1]，因而采用在含4 mol/L脲(使蜂毒肽的四聚体解散)与不含4 mol/ L脲的两种不同情况的缓冲液系统中进行凝胶过滤柱层析，虽然整个分离纯化的条件要求不 高，但达到了较为理想的分离提纯，所获产品的纯度和得率均较高，生物活性没受影响，因 此，本课题所设计的从蜂毒中获取蜂毒肽的分离纯化工艺路线，可以在国内中小企业中采用 。
, http://www.100md.com
Address： Xu Peng, Department of Basic, Jiangxi College of TCM, N anchang
本课题为国家中医药管理局青年基金资助课题
徐彭 男，1981年毕业于江西中医学院药学专业，理学士，副教授，江西中医学院基础部 副主任。主要从事生物毒素的分离提纯及其生物学作用和中药药理的实验研究，参与或主持 过多个国家及省部级科研课题，在国内学术刊物上发表论文 10 余篇。联系电话：0791-681 1713。
徐彭(江西中医学院基础部 南昌 330006)
欧阳永伟(江西中医学院基础部 南昌 330006)
参 考 文 献
1，陈远聪，袁士龙.毒素的研究与利用.北京：科学出版社，1988：128
, http://www.100md.com
2，Kreil G. FEBS LETTERS，1973：241
3，Yves M, Urs B, Bernard W F, et al. Analytical Biochem istry,1982：61
4，法祥光，甘午君，李会元，等.中华血液学杂志，1984(2)：132
5，徐 彭，欧阳永伟，黄敬耀，等.中草药，1996，27(9)：542
6，莽克强，徐乃正，方荣祥，等.聚丙烯酰胺凝胶电泳.北京：科学出版社，1975 ：26，81
(2000-06-15收稿), 百拇医药
单位：江西中医学院基础部 南昌 330006
关键词：
中草药001206
摘 要 为了建立一条适合国内采用的提取纯化蜂毒肽的工艺路线，本 课题采用溶媒萃取、化学裂解和含与不含4 mol/L脲的醋酸盐缓冲液的两次凝胶过滤柱层析 的方法，可以从蜂毒中得到电泳纯的蜂毒肽，其静脉注射的LD50为4.0 mg/kg，在试 管内的HD50为8.0 mg/L，在0.25 mg/L时，即可使红细胞膜的流动性有明显增强。
蜜蜂毒(Bee Venom，简称蜂毒)是由蜜蜂毒腺产生后贮存于毒囊中，当蜜蜂受刺激时从其尾 部螫针排出的一种毒液，蜂毒能治病的偶然，开创了人类利用蜂毒治病的悠久历史。虽然蜂 毒 是经受了千百年长时期考验的对某些疾病确有疗效的天然药物，古今中外对蜂毒医疗应用积 有丰富的经验，而且蜂毒资源丰富，现代关于蜂毒的基础与应用研究也相当活跃，但到目 前为止，蜂毒的临床应用仍很有限，尚未有任何国家将蜂毒的制剂收入药典，究其原因，主 要是蜂毒的成分众多，作用复杂，制成单体制剂的工艺复杂，成本较高，因此，探索提纯蜂 毒单体成分的研究很有意义。在蜂毒的众多成分中，以蜂毒肽(melittin)的含量最高，生物 活性最强，具有最为广阔的临床应用前景[1]。国外虽有其分离提纯方法的报道 [2，3]，但其工艺复杂、条件苛刻，难以在工业生产中采用。本文报道一条适合国内 使用的提取纯化蜂毒肽的工艺路线。
, http://www.100md.com
1 试剂与仪器
1.1 蜜蜂毒：购自浙江省缙云县养蜂场，系由西方蜜蜂(Apis mellifera，亦称为意蜂)的工蜂螫针排出的一种毒液，用取毒器收集并干燥成粉末状。购进后，经 蒸馏水(4 ℃)溶解并过滤除去蜜蜂螫针等不溶物，冷冻干燥得淡黄色粉末(此为原料蜂毒)， 干燥器内保存备用。
1.2 试剂：葡聚糖凝胶Sephadex G-10、G-25、G-50均为中国长征制药厂产品，盐酸 胍、溴化氰均为华美生物工程公司进口分装产品、化学纯，Ampholin为瑞典LKB公司产品， 亚硫酸钠和对氯汞苯甲酸均为国产化学纯，氨水、正丁醇、甲酸等均为国产分析纯。
1.3 仪器：HD-85-5 AI核酸蛋白检测仪为浙江省永嘉电器厂产品，WLB-78-C型电子微 量泵为浙江新昌国康仪器厂产品，BS-100A自动部分收集器和TH-1000梯度混合器均为上海 沪西分析仪器厂产品，ZF-Q81旋转浓缩蒸发器为上海医械专机厂产品，Yamato冷冻干燥器 为日本大和株式会社产品，DYY-Ⅲ8B型稳压稳流定时电泳仪为北京六一仪器厂产品，721分 光光度计为上海第三分析仪器厂产品。
, 百拇医药
1.4 动物：昆明种小鼠、普通种家兔均由江西中医学院动物房提供。
2 方法与结果
2.1 蜂毒肽的分离纯化
2.1.1 蜂毒的溶媒萃取：参照文献[2]，取蜂毒500 mg，溶于30 mL 0.15 mol/ L NH4OH中，加入20 mL正丁醇，剧烈振摇，离心(3 000 r/min) 20 min，收集醇层并 继续用正丁醇萃取2 次，合并萃取液，25 ℃回收正丁醇，冷冻干燥，得产物A(简称A)437 m g。
2.1.2 产物A的凝胶过滤柱层析：取产物A 100 mg，溶解于10.0 mL含有4 mol/L脲的醋 酸 盐缓冲液(0.05 mol/L，pH 4.75，此为缓冲液甲)中，上葡聚糖凝胶G-50柱(2×80 cm)， 用 缓冲液甲洗脱(图1)，洗脱液以溶血试验进行蜂毒肽的生物活性跟踪，收集溶血活性作用最 强的吸收峰Ⅴ共55 mL，旋转蒸发器(25 ℃)浓缩，浓缩液通过葡聚糖凝胶G-10(2×50 cm) 柱脱盐，冷冻干燥，得产物B 77 mg。
, 百拇医药
图1 A的Sephadex G-50层析
2.1.3 产物B的化学裂解：参照文献[3]，取产物B 77 mg，溶解于20 mL的含有3 mol/L盐酸胍、55 mmol/L亚硫酸钠和2.3 mmol/L对氯汞苯甲酸的溶液中，整个溶液用NH 4 OH调到pH 7.0，在37 ℃孵化2 h，然后此溶液按上法脱盐并冻干，冻干物溶于装有70%甲酸 3 0 mL的带塞玻璃瓶中，加入50 mg的溴化氰结晶，混合，在室温下保持24 h，然后用水稀释5 倍并按上法浓缩、脱盐并冻干，得产物C(简称C)60 mg。
2.1.4 产物C的凝胶过滤柱层析：取产物C 60 mg溶解于2.0 mL醋酸盐缓冲液(0.05 mol /L ，pH 4.75，此为缓冲液乙)中，上葡聚糖凝胶G-25柱(1.0×100 cm)，用缓冲液乙洗脱(图2)，洗脱液以溶血试验进行蜂毒肽的活性跟踪，收集溶血活性作用最强的吸收峰Ⅱ共40 mL， 按上法浓缩、脱盐并冻干，得产物D 45 mg，此即为产物蜂毒肽。产物蜂毒肽的得率为39.3 3 mg/100 mg蜂毒(437/500=0.874，0.874×45/100=0.3933)。
, 百拇医药
图2 C的Sephadex G-25层析
2.2 产物蜂毒肽的生物活性测定
2.2.1 半数致死量(LD50)的测定：取体重18～20 g健康小鼠100 只，雌雄搭配， 随机均匀分成10 组。产物蜂毒肽及蜂毒各用5 个剂量组，剂量按等比级数排列，剂量间比 例为1∶0.75，静脉注射给药，给药后观察并记录小鼠的死亡情况，实验数据按Litchfiedl d & Wilcoxon方法用对数机率方格纸作图，测得蜂毒的LD50为4.3 mg/kg，产物蜂毒 肽的LD50为4.0 mg/kg。
2.2.2 半数溶血量(HD50)的测定：参照文献[3]，取产物蜂毒肽及蜂毒进 行溶血试验观察，测得产物蜂毒肽的HD50为8.0 mg/L，蜂毒的HD50为9.0 mg /L。
, 百拇医药
2.2.3 对家兔红细胞膜流动性的影响：参照文献[4，5]，取产物蜂毒肽及蜂毒 进行对家兔红细胞膜流动性影响的体外试验观察，结果见表1。
表1 蜂毒和蜂毒肽对兔红细胞流动性的影响( n=9)
药物浓度(mg/L)
荧光偏振度
红细胞膜微粘度
红细胞膜流动性能
对照组
-
0.357±0.006
6.970±0.536
, 百拇医药
1.123±0.087
蜂毒低剂量组
0.53
0.342±0.020*
5.986±1.270*
1 .380±0.338*
蜂毒高剂量组
1.07
0.328±0.020**
5.108±1.082**
, 百拇医药
1.633±0.355**
蜂毒肽低剂量组
0.25
0.339±0.014*
5.888±0.992*
1.40 4±0.335*
蜂毒肽高剂量组
0.50
0.333±0.016**
5.267±1.006**
, 百拇医药
1.594±0.342**
*P<0.05， **P<0.012.3 产物蜂毒肽的生化性质鉴定
2.3.1 纯度测定：按文献方法[6]，分别作产物蜂毒肽及蜂毒的十二烷基硫酸钠 (SDS)聚丙胺凝胶电泳，电泳的结果显示：产物蜂毒肽为一条带，蜂毒有5 条明显的条带。
2.3.2 等电点测定：按文献方法[6]，用两性载体Ampholine (pH4～11)作产物 蜂毒肽的凝胶等电聚焦电泳，测得其等电点为10.5。
3 讨论
蜂毒肽是一种含有26个氨基酸的小分子多肽，是蜂毒中的最主要毒性成分，生物活性强，尤 其是具有很强的溶血活性；含量高，约占蜂毒干重的50%；属强碱性疏水性多肽，具可逆性 的油水两亲性，对生物膜具有特定的作用，已广泛地用作为膜研究的工具药和临床用药的前 期实验研究。同时，蜂毒中还含有多个其它小分子的多肽，因此，蜂毒肽的分离提纯一直是 众多学者关注的问题[1～3]，本研究利用蜂毒肽的油水两亲性和其分子结构中不含 巯基及双巯键[1]，进行溶媒萃取和化学裂解处理，同时利用其在浓度高时常以四 聚体形式存在[1]，因而采用在含4 mol/L脲(使蜂毒肽的四聚体解散)与不含4 mol/ L脲的两种不同情况的缓冲液系统中进行凝胶过滤柱层析，虽然整个分离纯化的条件要求不 高，但达到了较为理想的分离提纯，所获产品的纯度和得率均较高，生物活性没受影响，因 此，本课题所设计的从蜂毒中获取蜂毒肽的分离纯化工艺路线，可以在国内中小企业中采用 。
, http://www.100md.com
Address： Xu Peng, Department of Basic, Jiangxi College of TCM, N anchang
本课题为国家中医药管理局青年基金资助课题
徐彭 男，1981年毕业于江西中医学院药学专业，理学士，副教授，江西中医学院基础部 副主任。主要从事生物毒素的分离提纯及其生物学作用和中药药理的实验研究，参与或主持 过多个国家及省部级科研课题，在国内学术刊物上发表论文 10 余篇。联系电话：0791-681 1713。
徐彭(江西中医学院基础部 南昌 330006)
欧阳永伟(江西中医学院基础部 南昌 330006)
参 考 文 献
1，陈远聪，袁士龙.毒素的研究与利用.北京：科学出版社，1988：128
, http://www.100md.com
2，Kreil G. FEBS LETTERS，1973：241
3，Yves M, Urs B, Bernard W F, et al. Analytical Biochem istry,1982：61
4，法祥光，甘午君，李会元，等.中华血液学杂志，1984(2)：132
5，徐 彭，欧阳永伟，黄敬耀，等.中草药，1996，27(9)：542
6，莽克强，徐乃正，方荣祥，等.聚丙烯酰胺凝胶电泳.北京：科学出版社，1975 ：26，81
(2000-06-15收稿), 百拇医药