鲤鱼精巢DNA对自由基的清除作用
作者：周永红 唐孝礼 颜光美 许实波
单位：周永红 唐孝礼 颜光美(广东药学院预防医学系 广州 510224)；许实波(中山大学生命科学学院药学系)
关键词：鲤鱼；精巢；脱氧核糖核酸；自由基
中草药001225摘 要 目的：研究鲤鱼精巢DNA对自由基的清除作用。方法：采用 化学发光法测定鲤鱼精巢DNA对Cu2+-Vit C-H2O2发光体系产生的*OH自由 基的清 除作用，采用分光光度法检测鲤鱼精巢DNA对大鼠腹腔多形核白细胞(PMNs)呼吸爆发产生O ÷2自由基的清除作用，采用电子自旋共振(ESR)法测定鲤鱼精巢DNA对DPPH有机自由基的 清 除作用。结果：鲤鱼精巢DNA使Cu2+-Vit C-H2O2发光体系的发光计数率降低， 使 PMNs呼吸爆发产生O÷2自由基的数量减少，使DPPH的特征波峰逐渐降低直至消失。结论 ：鲤鱼精巢DNA对*OH自由基、O÷2自由基和有机自由基均有显著的消除作用。
, 百拇医药
Scavenging Action of DNA from Carp Spermary on Free Radicals
Zhou Yonghong
(Department of Preventive Medicine, Guangdong College of Pharmacy Gua ngzhou 510224)
Tang Xi aoli and Yan Guangmei
(Department of Pharmacology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences)
Xu Shi bo
(Department of Pharmacy, School of Life Sciences, Sun Yat-sen University)
, 百拇医药
Abstract To investigate whether DNA from carp spermary scave nges free radicals. Chemical luminometry, spectrometry and electronic spin resonanc e (ESR) methods were used to measure the scavenging action of deoxyribonucleic ac id (DNA) from carp spermary on OH radical produced by Cu2+-Vit C-H2O 2 chemoluminescent system, O÷2 radical produced by the breathing burst of polymorphonuclear leukocytes (PMNs) and DPPH radical respectively. DNA from car p spermary scavenged OH radical produced by Cu2+-Vit C-H2O2 chemolu mi nescent system, O÷2 radical produced by the breathing burst of PMNs and D P PH radicals. It could be concluded that DNA from carp spermary scavenges free r adicals.
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Key words carp spermary deoxyribonucleic acid free radic als
鲤鱼既是一种常见食用鱼，又是一种常用滋补中药，性平，味甘。归脾、肾经。 具 有利水、消肿、下气、通乳之功效。常用于水肿胀满、脚气、黄疸、咳嗽、气逆、乳汁不通 。雄性鲤鱼在发情期，它的精巢约占体重的十分之一，精巢的主要成分是核蛋白，由鱼精蛋 白和脱氧核糖核酸(DNA)组成。鲤鱼精巢的药用价值未见文献报道，为了科学合理地利用鲤 鱼精巢，我们进行了鲤鱼精巢DNA的分离提取及其药理作用研究，发现鲤鱼精巢DNA的毒性极 低，为实际无毒级物质；小鼠服用鲤鱼精巢DNA后，对动物体内自身DNA的损伤具有明显的保 护作用[1]；鲤鱼精巢DNA对果蝇和小鼠的生存寿命有显著的延长作用[2] 。本实验研究鲤鱼精巢DNA对自由基的清除作用。
1 实验材料
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1.1 动物和样品：SD大鼠由广东省医学实验动物中心提供。鲤鱼精巢DNA由作者从鲤科鲤 Cyprinus carpio Linnaeus的精巢中提取得到，纯度为96.52%，实验时 用蒸馏水配成所需浓度的受试液。
1.2 主要试剂和仪器：Vit E购自广州星群药业股份有限公司；糖原，Serva公司；台盼蓝 ，Sigma公司；二苯代苦味酰基自由基(1，1-diphenyl-2-picrylhydazyl, DHHP)，日本 关东 化学株式会社；酵母多糖，Sigma公司；其余均为市售分析纯试剂。7550分光光度计，惠普 上海分析仪器有限公司；TGL-5型离心机，上海安亭科学仪器厂；GL20C高速冷冻离心机， 中 国科学院武汉科学仪器厂；生物超弱发光仪，中国科学院生物物理研究所；JES-FEIXG电子 自旋共振波谱仪，日本岛津制作所。
1.3 对*OH自由基的清除作用：采用化学发光法测定鲤鱼精巢DNA对Cu2+-Vit C- H2O2发光体系产生的*OH自由基的清除作用[3]。反应在50 mmol/L磷酸盐缓冲 液(pH 7.4)中进行，以酵母扩增化学发光强度，反应体系总体积2 mL，其中含Vit C 90 μ mmol/L、CuSO4 360 mmol/L、酵母50 mg/mL，H2O2 15 mmol/L及一定浓度受试药或等 体积溶媒。H2O2最后加入，立即于生物超弱发光仪上测定30 min内反应体系发光强度的 变化。测定时室温23.6 ℃，管温-11.9 ℃。结果统计：记录各管第30 分钟时的发光计数 率，作组间t检验。
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1.4 对O÷2自由基的清除作用：采用分光光度法检测鲤鱼精巢DNA对大鼠腹腔多形核 白细胞(PMNs)呼吸爆发产生O÷2自由基的清除作用[4]。取体重250～300 g的健 康SD大鼠，雄性，ip 1%糖原生理盐水20 mL,4 h后吸取大鼠腹腔液，以10 mmol/L PBS(pH7 .4,含肝素20 U/mL)洗涤2次，每次以800×g离心5 min，用PBS将沉淀配成107 CFU/mL的 PMNs悬浮液。以台盼蓝染色检查PMNs成活率>95%,采用10 mmol/L PBS, pH 7.4，反应体系 总体积1 mL，内含PMNs 5×106 CFU,羟胺2 mmol/L及一定浓度的受试药，37 ℃水浴5 min 。加调理化酵母多糖0.1 mL，37 ℃水浴30 min，冰水浴终止反应，800×g离心 5 min。取上清液0.5 mL，加10 mmol/L PBS、17.26 mmol/L对氨基苯磺酸、7 mmol/L荼胺 各0.5 mL ，摇匀，室温静置20 min,以试剂空白管调零，测波长530 nm 处的吸光度值(A530nm) ,O÷2自由基的量由亚硝酸钠标准曲线计算求得。
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1.5 对有机自由基的清除作用：DPPH是一种稳定的有机自由基，常用于天然抗氧化剂的筛 选。DPPH用无水酒精溶解，反应体系总体积为1 mL，其中含30 μmmol/L DPPH及一定浓度受 试药或等体积溶媒，25 ℃反应30 min后，用测定管吸取10 μL反应液于JES-FEIXG电子自 旋共振波谱仪测DPPH的ESR波谱[6]。
2 结果
2.1 对*OH自由基的清除作用：结果(图1)表明，鲤鱼精巢DNA对Cu2+-Vit C-H 2O2发光体系产生的*OH自由基有显著的清除作用。DNA 1.2 ，0.3 mg/mL对*OH自由基 的清除率分别为81.8%(P<0.001),72.7%( P<0 .001);0 .25 mg/mL Vit E对Cu2+-Vit C-H2O2发光体系产生的*OH自由基的清除 率为26.4% (P<0.05)。
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2.2 对O÷2自由基的清除作用：结果(表1)表明，鲤
A-空白对照； B-鲤鱼精巢DNA 1.2 mg/mL； C-鲤鱼精巢DNA 0.3 m g/mL; D- Vit E 0.25 mg/mL
图1 鲤鱼精巢DNA对Cu2+-Vit C-H2O2发 光体系产生的*OH自由基的清除作用(n=3)
鱼精巢DNA对大鼠(PMNs)呼吸爆发产生O÷2自由基有显著的清除作用。250，25，2.5 μg/m L DNA的清除率分别为53.45% (P<0.001)，35.56% (P<0.01)，22.63%(P <0.05)。50 μg/mL Vit E的清除率为43.75% (P<0.01)。
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2.3 对有机自由基的精除作用：结果(图2)表明，表1 对PMNs呼吸爆发产生O÷2自由基的清除作用( x±s,n=6) 组别
浓度
(μg/mL
A530 nm
O÷2
(nmol)
清除率
(%)
空白对照
—
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0.064±0.012
46.4±7.3
—
鲤鱼精巢DNA
250
0.031±0.009***
21.6±5.5***
53.45
25
0.042±0.011**
29.9±6.6**
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35.56
2.5
0.050±0.013
35.9±8.1*
22.63
Vit E
50
0.037±0.014**
26.1±8.8**
43.75
与空白对照组比较：*P<0.05 **P <0.01 ***P<0.001
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鲤鱼精巢DNA对DPPH自由基有 显著的清除作用，随着DNA浓度的增大，DPPH的ESR特征波峰逐渐变低，当DNA的浓度已达到2 50 μg/mL时，DPPH的ESR特征波峰全部消失，表明此时DPPH自由基已被全部清除；20 μg/m L Vit E也可将DPPH自由基全部清除。
A-空白对照； B-鲤鱼精巢DNA 2.5 μg/mL (P<0.001)；
C-鲤鱼精巢DNA 25 μg/mL(P<0.001)； D-鲤鱼精巢DNA 250 μg/mL (P<0.001); E-Vit E 20 μg/mL (P<0.001)
图2 鲤鱼精巢DNA 清除DPPH自由基
的ESR图谱 (n=3)
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3 讨论
自由基是带有不配对电子的原子或分子，自由基在体内的过量积累，可以破坏细胞正常代谢 功能，引起类脂质的过氧化反应，促使DNA、RNA突变，导致蛋白质交联，从而引起许多与年 龄相关的疾病，如白内障、动脉硬化、肿瘤、糖尿病、胃肠道慢性炎症、皮肤老化、软骨病 变、神经功能失调等的产生和加速衰老进程[6～9]。
自由基的测定方法有分光光度法、高效液相色谱(HPLC)法、化学发光法、电子自旋共振(ESR )波谱法等。我们采用化学发光法检测鲤鱼精巢DNA对Cu2+-Vit C-H2O2发光体 系产生的*OH自由基的清除作用，分光光度法检测鲤鱼精巢DNA大鼠(PMNs)呼吸爆发产生的O ÷2自由基的清除作用，采用ESR波谱法检测鲤鱼精巢DNA对DPPH有机自由基的清除作用，结 果表明鲤鱼精巢DNA对这3种自由基均有显著的清除作用。因此，鲤鱼精巢DNA对机体内自由 基的清除作用是其抗衰老作用的重要机制之一。
, 百拇医药
Address： Zhou Yonghong, Department of Preventive Medicine, Guangdong Co llege of Pharmacy, Guangzhou
周永红 女，广东药学院预防医学系实验师，参加国家自然科学基金、广东省自然科学基金 等多项科研课题，已发表论文10余篇。
中山医科大学药理学教研室
参 考 文 献
1，唐孝礼，许实波，周永红.中山大学学报(自然科学版)，1998，37(增刊)：74 ；37 (4)：125
2，唐孝礼，周永红，颜光美，等.中国老年学杂志，1999，19(2)：101
3，陈 勤主编.抗衰老研究实验方法.北京：中国医药科技出版社，1996：501
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4，辛洪波，张宝恒.药学学报，1993，28(3)：161
5，许士凯主编.抗衰老药物学.北京：中国医药科技出版社，1994：201
6，Dean R T, Fu S, Stocker R, et al. Biochem J, 1997,324 (Pt1):1
7，Kim K B, Lee B M. Cancer Lett, 1997, 113(1-2):205
8，Stohs S J.J Basic Clin Physiol Pharmacol, 1995,6(3-4):205
9，Knight J A. Ann Clin Lab Sci，1997,27(1):11
(2000-02-20收稿), 百拇医药
单位：周永红 唐孝礼 颜光美(广东药学院预防医学系 广州 510224)；许实波(中山大学生命科学学院药学系)
关键词：鲤鱼；精巢；脱氧核糖核酸；自由基
中草药001225摘 要 目的：研究鲤鱼精巢DNA对自由基的清除作用。方法：采用 化学发光法测定鲤鱼精巢DNA对Cu2+-Vit C-H2O2发光体系产生的*OH自由 基的清 除作用，采用分光光度法检测鲤鱼精巢DNA对大鼠腹腔多形核白细胞(PMNs)呼吸爆发产生O ÷2自由基的清除作用，采用电子自旋共振(ESR)法测定鲤鱼精巢DNA对DPPH有机自由基的 清 除作用。结果：鲤鱼精巢DNA使Cu2+-Vit C-H2O2发光体系的发光计数率降低， 使 PMNs呼吸爆发产生O÷2自由基的数量减少，使DPPH的特征波峰逐渐降低直至消失。结论 ：鲤鱼精巢DNA对*OH自由基、O÷2自由基和有机自由基均有显著的消除作用。
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Scavenging Action of DNA from Carp Spermary on Free Radicals
Zhou Yonghong
(Department of Preventive Medicine, Guangdong College of Pharmacy Gua ngzhou 510224)
Tang Xi aoli and Yan Guangmei
(Department of Pharmacology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences)
Xu Shi bo
(Department of Pharmacy, School of Life Sciences, Sun Yat-sen University)
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Abstract To investigate whether DNA from carp spermary scave nges free radicals. Chemical luminometry, spectrometry and electronic spin resonanc e (ESR) methods were used to measure the scavenging action of deoxyribonucleic ac id (DNA) from carp spermary on OH radical produced by Cu2+-Vit C-H2O 2 chemoluminescent system, O÷2 radical produced by the breathing burst of polymorphonuclear leukocytes (PMNs) and DPPH radical respectively. DNA from car p spermary scavenged OH radical produced by Cu2+-Vit C-H2O2 chemolu mi nescent system, O÷2 radical produced by the breathing burst of PMNs and D P PH radicals. It could be concluded that DNA from carp spermary scavenges free r adicals.
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Key words carp spermary deoxyribonucleic acid free radic als
鲤鱼既是一种常见食用鱼，又是一种常用滋补中药，性平，味甘。归脾、肾经。 具 有利水、消肿、下气、通乳之功效。常用于水肿胀满、脚气、黄疸、咳嗽、气逆、乳汁不通 。雄性鲤鱼在发情期，它的精巢约占体重的十分之一，精巢的主要成分是核蛋白，由鱼精蛋 白和脱氧核糖核酸(DNA)组成。鲤鱼精巢的药用价值未见文献报道，为了科学合理地利用鲤 鱼精巢，我们进行了鲤鱼精巢DNA的分离提取及其药理作用研究，发现鲤鱼精巢DNA的毒性极 低，为实际无毒级物质；小鼠服用鲤鱼精巢DNA后，对动物体内自身DNA的损伤具有明显的保 护作用[1]；鲤鱼精巢DNA对果蝇和小鼠的生存寿命有显著的延长作用[2] 。本实验研究鲤鱼精巢DNA对自由基的清除作用。
1 实验材料
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1.1 动物和样品：SD大鼠由广东省医学实验动物中心提供。鲤鱼精巢DNA由作者从鲤科鲤 Cyprinus carpio Linnaeus的精巢中提取得到，纯度为96.52%，实验时 用蒸馏水配成所需浓度的受试液。
1.2 主要试剂和仪器：Vit E购自广州星群药业股份有限公司；糖原，Serva公司；台盼蓝 ，Sigma公司；二苯代苦味酰基自由基(1，1-diphenyl-2-picrylhydazyl, DHHP)，日本 关东 化学株式会社；酵母多糖，Sigma公司；其余均为市售分析纯试剂。7550分光光度计，惠普 上海分析仪器有限公司；TGL-5型离心机，上海安亭科学仪器厂；GL20C高速冷冻离心机， 中 国科学院武汉科学仪器厂；生物超弱发光仪，中国科学院生物物理研究所；JES-FEIXG电子 自旋共振波谱仪，日本岛津制作所。
1.3 对*OH自由基的清除作用：采用化学发光法测定鲤鱼精巢DNA对Cu2+-Vit C- H2O2发光体系产生的*OH自由基的清除作用[3]。反应在50 mmol/L磷酸盐缓冲 液(pH 7.4)中进行，以酵母扩增化学发光强度，反应体系总体积2 mL，其中含Vit C 90 μ mmol/L、CuSO4 360 mmol/L、酵母50 mg/mL，H2O2 15 mmol/L及一定浓度受试药或等 体积溶媒。H2O2最后加入，立即于生物超弱发光仪上测定30 min内反应体系发光强度的 变化。测定时室温23.6 ℃，管温-11.9 ℃。结果统计：记录各管第30 分钟时的发光计数 率，作组间t检验。
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1.4 对O÷2自由基的清除作用：采用分光光度法检测鲤鱼精巢DNA对大鼠腹腔多形核 白细胞(PMNs)呼吸爆发产生O÷2自由基的清除作用[4]。取体重250～300 g的健 康SD大鼠，雄性，ip 1%糖原生理盐水20 mL,4 h后吸取大鼠腹腔液，以10 mmol/L PBS(pH7 .4,含肝素20 U/mL)洗涤2次，每次以800×g离心5 min，用PBS将沉淀配成107 CFU/mL的 PMNs悬浮液。以台盼蓝染色检查PMNs成活率>95%,采用10 mmol/L PBS, pH 7.4，反应体系 总体积1 mL，内含PMNs 5×106 CFU,羟胺2 mmol/L及一定浓度的受试药，37 ℃水浴5 min 。加调理化酵母多糖0.1 mL，37 ℃水浴30 min，冰水浴终止反应，800×g离心 5 min。取上清液0.5 mL，加10 mmol/L PBS、17.26 mmol/L对氨基苯磺酸、7 mmol/L荼胺 各0.5 mL ，摇匀，室温静置20 min,以试剂空白管调零，测波长530 nm 处的吸光度值(A530nm) ,O÷2自由基的量由亚硝酸钠标准曲线计算求得。
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1.5 对有机自由基的清除作用：DPPH是一种稳定的有机自由基，常用于天然抗氧化剂的筛 选。DPPH用无水酒精溶解，反应体系总体积为1 mL，其中含30 μmmol/L DPPH及一定浓度受 试药或等体积溶媒，25 ℃反应30 min后，用测定管吸取10 μL反应液于JES-FEIXG电子自 旋共振波谱仪测DPPH的ESR波谱[6]。
2 结果
2.1 对*OH自由基的清除作用：结果(图1)表明，鲤鱼精巢DNA对Cu2+-Vit C-H 2O2发光体系产生的*OH自由基有显著的清除作用。DNA 1.2 ，0.3 mg/mL对*OH自由基 的清除率分别为81.8%(P<0.001),72.7%( P<0 .001);0 .25 mg/mL Vit E对Cu2+-Vit C-H2O2发光体系产生的*OH自由基的清除 率为26.4% (P<0.05)。
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2.2 对O÷2自由基的清除作用：结果(表1)表明，鲤
A-空白对照； B-鲤鱼精巢DNA 1.2 mg/mL； C-鲤鱼精巢DNA 0.3 m g/mL; D- Vit E 0.25 mg/mL
图1 鲤鱼精巢DNA对Cu2+-Vit C-H2O2发 光体系产生的*OH自由基的清除作用(n=3)
鱼精巢DNA对大鼠(PMNs)呼吸爆发产生O÷2自由基有显著的清除作用。250，25，2.5 μg/m L DNA的清除率分别为53.45% (P<0.001)，35.56% (P<0.01)，22.63%(P <0.05)。50 μg/mL Vit E的清除率为43.75% (P<0.01)。
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2.3 对有机自由基的精除作用：结果(图2)表明，表1 对PMNs呼吸爆发产生O÷2自由基的清除作用( x±s,n=6) 组别
浓度
(μg/mL
A530 nm
O÷2
(nmol)
清除率
(%)
空白对照
—
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0.064±0.012
46.4±7.3
—
鲤鱼精巢DNA
250
0.031±0.009***
21.6±5.5***
53.45
25
0.042±0.011**
29.9±6.6**
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35.56
2.5
0.050±0.013
35.9±8.1*
22.63
Vit E
50
0.037±0.014**
26.1±8.8**
43.75
与空白对照组比较：*P<0.05 **P <0.01 ***P<0.001
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鲤鱼精巢DNA对DPPH自由基有 显著的清除作用，随着DNA浓度的增大，DPPH的ESR特征波峰逐渐变低，当DNA的浓度已达到2 50 μg/mL时，DPPH的ESR特征波峰全部消失，表明此时DPPH自由基已被全部清除；20 μg/m L Vit E也可将DPPH自由基全部清除。
A-空白对照； B-鲤鱼精巢DNA 2.5 μg/mL (P<0.001)；
C-鲤鱼精巢DNA 25 μg/mL(P<0.001)； D-鲤鱼精巢DNA 250 μg/mL (P<0.001); E-Vit E 20 μg/mL (P<0.001)
图2 鲤鱼精巢DNA 清除DPPH自由基
的ESR图谱 (n=3)
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自由基是带有不配对电子的原子或分子，自由基在体内的过量积累，可以破坏细胞正常代谢 功能，引起类脂质的过氧化反应，促使DNA、RNA突变，导致蛋白质交联，从而引起许多与年 龄相关的疾病，如白内障、动脉硬化、肿瘤、糖尿病、胃肠道慢性炎症、皮肤老化、软骨病 变、神经功能失调等的产生和加速衰老进程[6～9]。
自由基的测定方法有分光光度法、高效液相色谱(HPLC)法、化学发光法、电子自旋共振(ESR )波谱法等。我们采用化学发光法检测鲤鱼精巢DNA对Cu2+-Vit C-H2O2发光体 系产生的*OH自由基的清除作用，分光光度法检测鲤鱼精巢DNA大鼠(PMNs)呼吸爆发产生的O ÷2自由基的清除作用，采用ESR波谱法检测鲤鱼精巢DNA对DPPH有机自由基的清除作用，结 果表明鲤鱼精巢DNA对这3种自由基均有显著的清除作用。因此，鲤鱼精巢DNA对机体内自由 基的清除作用是其抗衰老作用的重要机制之一。
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Address： Zhou Yonghong, Department of Preventive Medicine, Guangdong Co llege of Pharmacy, Guangzhou
周永红 女，广东药学院预防医学系实验师，参加国家自然科学基金、广东省自然科学基金 等多项科研课题，已发表论文10余篇。
中山医科大学药理学教研室
参 考 文 献
1，唐孝礼，许实波，周永红.中山大学学报(自然科学版)，1998，37(增刊)：74 ；37 (4)：125
2，唐孝礼，周永红，颜光美，等.中国老年学杂志，1999，19(2)：101
3，陈 勤主编.抗衰老研究实验方法.北京：中国医药科技出版社，1996：501
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4，辛洪波，张宝恒.药学学报，1993，28(3)：161
5，许士凯主编.抗衰老药物学.北京：中国医药科技出版社，1994：201
6，Dean R T, Fu S, Stocker R, et al. Biochem J, 1997,324 (Pt1):1
7，Kim K B, Lee B M. Cancer Lett, 1997, 113(1-2):205
8，Stohs S J.J Basic Clin Physiol Pharmacol, 1995,6(3-4):205
9，Knight J A. Ann Clin Lab Sci，1997,27(1):11
(2000-02-20收稿), 百拇医药