bFGF对大鼠脊髓损伤后c-fos mRNA表达的影响
作者：刘文革 宋建榕 林佳俊
单位：福建医科大学附属协和医院骨科，福州市 350001
关键词：脊髓损伤；c-fos mRNA；bFGF
中国矫形外科杂志001211 摘 要 目的：探讨碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)对大鼠脊髓损伤后c-fos mRNA表达的影响。方法：采用 Allen's法造成大鼠T8脊髓损伤模型，用原位杂交方法检测神经元 c-fos mRNA的表达。结果：脊髓损伤后神经元c-fos mRNA 表达较正常末损伤神经元显著增加，表达高峰出现在损伤后1h。 bFGF能显著抑制损伤后神经元c-fos mRNA 的异常表达。结论：应用外源性bFGF抑制了脊髓损伤后的c-fos基因表达，保护了神经元并抑制了继发性损害的发生，是bFGF保护脊髓损伤可能的作用机理。
, 百拇医药
中图分类号 R68 文献标识码 A 文章编号 1005-8478(2000)12-1178-03
Effect of bFGF on c-fos mRNA Expression in Rats after Spinal Cord Injury
LIU Wen-ge,SONG Jian-rong,LIN Jia-jun
(Department of Orthopdedics,the Affiliated Union Hospital of Fujian Medical University,Fuzhou,350001)
Abstract Objective: To study the effects of bFGF on c-fos gene expression in spinal neuron after SCI.The 54 experimental rats were subjected to 25gcfc ontusion to thoracolumbar spinal cord,and a thin plastic tube was placed in subarachnoid space below the injury level for perfusion.The bFGF treated group received 100u bFGF(20ul liquid)at once、15min、30min、1、2、3、4hours after contusion,and an equal volume of normal saline was given to the control group at the same time.c-fos mRNA levels were detected by in situ hybridization,the results showed that there is no evident c-fos expression in normal control group.c-fos expression increased markedly in damaged neurons,and the peak value of c-fos mRNA expression happened at 2 hour after injury;the levels of c-fos expression in bFGF-treated group reduced evidently.The results demonstrated that bFGF could inhibit c-fos expression after injury,it may be one of mechanisms which bFGF protects spinal cord against injury.
, 百拇医药
Key words Spinal cord injury c-fos mRNA Basic fibroblast growth factor
碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是一种对神经细胞的生长、发育、分化及再生起重大调节作用的蛋白质，是近年来研究较多的一种新的神经营养因子。在体外试验中发现，bFGF对多种神经元可以促进再生和延长存活时间，且在体内能促进外周神经损伤的修复与再生。近期研究表明脊髓损伤后可明显增加损伤神经元bFGF mRNA的表达，提示bFGF可能对损伤神经元有保护作用，作者曾报道[1，2]bFGF对脊髓损伤后有保护作用，其机理仍不十分清楚。本文用c-fos基因分子杂交法，研究bFGF对脊髓损伤后神经元保护作用的机理。
1 材料与方法
1.1动物与分组
, 百拇医药
健康SD大白鼠54只，雌雄不限，体重250～300g，随机分成3组。即(1)正常组：6只动物，不损伤脊髓，为测量脊髓 c-fos基因作正常对照；(2)治疗组：24只动物，脊髓损伤后，经蛛网膜下腔插入细导管注入bFGF；(3)对照组：24只动物，脊髓损伤后，经蛛网膜下腔导管注入等量生理盐水。
1.2 动物模型的建立
1.2.1 手术方法 0.3%戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔麻醉，以T8棘突为中心取背部后正中切口长约5cm，显露T7～T11棘突及椎板。咬除T8棘突及全椎板，以脊髓为中心显露直径约3mm圆形区，用Allen's方法选用10g×2.5cm致伤力损伤T8脊髓造成截瘫模型，将细硅胶管自T10蛛网膜下腔向脊髓损伤方向插入3mm，妥善固定。
1.2.2 术后处理 治疗组分别于术后即刻、15、30min,1、2、3、4h经导管各注入bFGF溶液20ul(含bFGF100u)，于术后15min、1、2、4h分别取6只大鼠断头处死取材。切取损伤区脊髓5mm，中性福尔马林固定、脱水，石腊包埋，切片(6um)。对照组除以等量生理盐水代替bFGF外，其他一切同治疗组。正常组在对应时间测量脊髓c-fos基因。
, 百拇医药
1.3 c-fos基因原位杂交
切片常规脱腊脱水后，PBS液洗10min，体积分数为0.2%甘氨酸洗10min，蛋白激酶k、37℃消化30min，梯度乙醇洗15min后进行预杂交和杂交，试剂均经RNA酶抑制剂DEPC处理。
c-fos探针购于华美生物技术有限公司，以地高辛作为标记物，随机引物法标记c-fos癌基因探针，检测试剂盒为武汉博士德生物工程公司产品。按说明书程序进行探针标记及杂交，结果用TJTY-300图像分析仪进行图像分析。
2 结 果
正常对照组：脊髓灰质内可见散在的c-fos基因表达弱阳性细胞，图像分析积分光密度(OD)值为：1.12±0.89；生理盐水组：术后15min灰质可见c-fos mRNA表达明显增加，以脊髓前角为主，阳性细胞的c-fos mRNA表达颗粒位于胞浆内，染成深蓝色，测量OD值为4.13±0.23，与正常对照组比较P<0.01。术后1h，c-fos mRNA表达达高峰，OD值为10.78±1.86(P<0.01)，以后逐渐下降，但仍较正常对照组表达增多，2、4h的测量OD值与正常对照组比较，进行统计学分析，差异仍有极显著性意义(P<0.01)。
, 百拇医药
bFGF治疗组检测结果显示，bFGF能明显抑制脊髓神经元损伤后c-fos mRNA的表达，在术后15min、2h时的OD值，bFGF 治疗组与生理盐水组相比较，差异有极显著性意义(P<0.01)；在1、4h时测量的OD值相比较，差异有显著性意义(P<0.05)。(结果见表1)。
表1 c-fos mRNA在脊髓组织中的表达(
±s) 术后时间
动物数(n)
生理盐水组
bFGF组
15min
6
4.13±0.23
, 百拇医药
3.12±0.43**
1h
6
10.78±1.86
8.37±0.34*
2h
6
7.35±0.21
6.46±0.41**
4h
6
5.53±0.37
, 百拇医药
4.36±0.89*
bFGF治疗组与生理盐水组比较， P<0.01，P<0.05。
3 讨 论
对神经元功能活动进行细胞水平定位所建立的新型形态学方法—c-fos癌基因表达方法[3]，是利用神经元受到兴奋性刺激时，c-fos癌基因的表达急剧增加和fos蛋白迅速堆积于胞核的特点。用c-fos癌基因CDNA探针原位杂交组化法或fos蛋白抗体免疫组化法在切片上染出受兴奋的神经元[4]。正常情况下，c-fos的基础水平很低，经多种胞外刺激可迅速引起c-fos一过性表达，因而可较完整准确地反映某刺激条件下神经元的活动情况。
c-fos参与神经细胞的生长、分化、神经功能可塑性变化及学习记忆等生理过程。很多因素(控制刺激和自然刺激)可导致中枢神经系统内c-fos的表达。Bullitt[5]应用伤害性机械刺激及电刺激诱导出脊髓及丘脑Fos阳性反应神经元的增加。脊髓损伤后，也可观察到c-fos表达增加[6，7]。Presley[8](1990)采用5%福尔马林刺激大鼠下肢，1h后，发现相应脊髓阶段灰质出现Fos样免疫反应阳性神经元，2h达峰值，4h后逐渐减少，16h恢复至正常水平。徐如祥报道，脑损伤后30min在损伤区神经细胞核中出现c-fos基因表达产物增多，并随伤后时间延长而增多，同时电镜观察神经元结构有不同程度改变[9]，提示脑损伤早期神经细胞的病理损害可能与c-fos基因表达变化有关。对损伤的c-fos基因表达与调控变化机理还不十分清楚，多数学者认为，c-fos基因表达与钙离子、谷氨酸受体及胆碱能神经元受体有关。
, 百拇医药
bFGF是有促进细胞生长作用的多肽因子。bFGF广泛存在于全身组织，但神经系统中的含量比其它任何组织都高，说明bFGF对神经系统的生长发育起十分重要的作用。近年来的研究结果表明，bFGF对体外培养的多种神经元有营养作用，它除能增强正常神经元的存活和突起生长外，还能保护神经元免受损伤。本实验结果显示，脊髓损伤后，脊髓神经元c-fos mRNA表达明显增多，从15min～4h呈持续性，1h达高峰，这说明c-fos可能参与脊髓神经元的继发性损害。bFGF治疗组c-fos表达较对照组明显减少(P<0.01)，说明bFGF抑制了脊髓损伤后c-fos基因的表达。其机制可能是bFGF降低了脊髓损伤后钙离子含量，抑制了损伤造成的钙离子内流，使损伤后神经元c-fos基因异常表达受到抑制，保护了神经细胞，这可能是bFGF保护受伤后神经元作用机制之一。
作者简介：刘文革(1966-)，男，山东省人，主治医生，博士学位。主研方向：脊髓损伤。电话：(0591)3357896-8406
, 百拇医药
参考文献：
〔1〕 刘文革，罗永湘.碱性成纤维细胞生长因子对脊髓损伤早期保护作用的实验研究[J].中国修复重建外科杂志，1999，13(5)：291.
〔2〕 刘文革，罗永湘，王敬博.尾静脉注射bFGF对大鼠脊髓损伤的影响[J].中国矫形外科杂志，1999，6(10)：762.
〔3〕 Dragunow M,Faull R.The use of c-fos as a metabolic marker in neuronal pathway tracing[J].J Neurosci Meth,1989，29:26.
〔4〕 Ju G,Zhang X.Activation of corticotropin-releasing factor-containing neurons in the paraventricular nucles of the hypothalamus by interleukin-1 in the rat[J].Neurosci Lett,1991，132(2):151.
, http://www.100md.com
〔5〕 Bullitt E.Expression of c-fos-like protein as a marker for neuronal activity following noxious stimulation in the rat[J].J Comp Neurol,1990，296:517.
〔6〕 Ruggiero DA,Anwar M,Kim J,et al.Induction of c-fos gene expression by spinal cord transection in the rat[J].Brain Res,1997，763:21.
〔7〕 Yakovlev AG,Faden AI.Sequential expression of c-fos protooncogene,TNF-alpha,and dynorphin genes in spinal cord following experimental traumatic injury[J].Mol Chem Neuropathal,1994，23(2):179.
〔8〕 Presley RW,Menetrey D,Levine JD,et al.Systemic morphion suppresses noxious stimulus-evolked FOS protein-like immunoreactivity in the rat spinal cord[J].J Neurosci,1990，10:323.
〔9〕 徐如祥，袁冠前，陈长才，等.脑损伤早期神经细胞c-fos基因表达与钙通道变化的关系[J].中华实验外科杂志，1995，12(4):245.
(收稿：2000-05-11 修回：2000-07-19), 百拇医药
单位：福建医科大学附属协和医院骨科，福州市 350001
关键词：脊髓损伤；c-fos mRNA；bFGF
中国矫形外科杂志001211 摘 要 目的：探讨碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)对大鼠脊髓损伤后c-fos mRNA表达的影响。方法：采用 Allen's法造成大鼠T8脊髓损伤模型，用原位杂交方法检测神经元 c-fos mRNA的表达。结果：脊髓损伤后神经元c-fos mRNA 表达较正常末损伤神经元显著增加，表达高峰出现在损伤后1h。 bFGF能显著抑制损伤后神经元c-fos mRNA 的异常表达。结论：应用外源性bFGF抑制了脊髓损伤后的c-fos基因表达，保护了神经元并抑制了继发性损害的发生，是bFGF保护脊髓损伤可能的作用机理。
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中图分类号 R68 文献标识码 A 文章编号 1005-8478(2000)12-1178-03
Effect of bFGF on c-fos mRNA Expression in Rats after Spinal Cord Injury
LIU Wen-ge,SONG Jian-rong,LIN Jia-jun
(Department of Orthopdedics,the Affiliated Union Hospital of Fujian Medical University,Fuzhou,350001)
Abstract Objective: To study the effects of bFGF on c-fos gene expression in spinal neuron after SCI.The 54 experimental rats were subjected to 25gcfc ontusion to thoracolumbar spinal cord,and a thin plastic tube was placed in subarachnoid space below the injury level for perfusion.The bFGF treated group received 100u bFGF(20ul liquid)at once、15min、30min、1、2、3、4hours after contusion,and an equal volume of normal saline was given to the control group at the same time.c-fos mRNA levels were detected by in situ hybridization,the results showed that there is no evident c-fos expression in normal control group.c-fos expression increased markedly in damaged neurons,and the peak value of c-fos mRNA expression happened at 2 hour after injury;the levels of c-fos expression in bFGF-treated group reduced evidently.The results demonstrated that bFGF could inhibit c-fos expression after injury,it may be one of mechanisms which bFGF protects spinal cord against injury.
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Key words Spinal cord injury c-fos mRNA Basic fibroblast growth factor
碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是一种对神经细胞的生长、发育、分化及再生起重大调节作用的蛋白质，是近年来研究较多的一种新的神经营养因子。在体外试验中发现，bFGF对多种神经元可以促进再生和延长存活时间，且在体内能促进外周神经损伤的修复与再生。近期研究表明脊髓损伤后可明显增加损伤神经元bFGF mRNA的表达，提示bFGF可能对损伤神经元有保护作用，作者曾报道[1，2]bFGF对脊髓损伤后有保护作用，其机理仍不十分清楚。本文用c-fos基因分子杂交法，研究bFGF对脊髓损伤后神经元保护作用的机理。
1 材料与方法
1.1动物与分组
, 百拇医药
健康SD大白鼠54只，雌雄不限，体重250～300g，随机分成3组。即(1)正常组：6只动物，不损伤脊髓，为测量脊髓 c-fos基因作正常对照；(2)治疗组：24只动物，脊髓损伤后，经蛛网膜下腔插入细导管注入bFGF；(3)对照组：24只动物，脊髓损伤后，经蛛网膜下腔导管注入等量生理盐水。
1.2 动物模型的建立
1.2.1 手术方法 0.3%戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔麻醉，以T8棘突为中心取背部后正中切口长约5cm，显露T7～T11棘突及椎板。咬除T8棘突及全椎板，以脊髓为中心显露直径约3mm圆形区，用Allen's方法选用10g×2.5cm致伤力损伤T8脊髓造成截瘫模型，将细硅胶管自T10蛛网膜下腔向脊髓损伤方向插入3mm，妥善固定。
1.2.2 术后处理 治疗组分别于术后即刻、15、30min,1、2、3、4h经导管各注入bFGF溶液20ul(含bFGF100u)，于术后15min、1、2、4h分别取6只大鼠断头处死取材。切取损伤区脊髓5mm，中性福尔马林固定、脱水，石腊包埋，切片(6um)。对照组除以等量生理盐水代替bFGF外，其他一切同治疗组。正常组在对应时间测量脊髓c-fos基因。
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1.3 c-fos基因原位杂交
切片常规脱腊脱水后，PBS液洗10min，体积分数为0.2%甘氨酸洗10min，蛋白激酶k、37℃消化30min，梯度乙醇洗15min后进行预杂交和杂交，试剂均经RNA酶抑制剂DEPC处理。
c-fos探针购于华美生物技术有限公司，以地高辛作为标记物，随机引物法标记c-fos癌基因探针，检测试剂盒为武汉博士德生物工程公司产品。按说明书程序进行探针标记及杂交，结果用TJTY-300图像分析仪进行图像分析。
2 结 果
正常对照组：脊髓灰质内可见散在的c-fos基因表达弱阳性细胞，图像分析积分光密度(OD)值为：1.12±0.89；生理盐水组：术后15min灰质可见c-fos mRNA表达明显增加，以脊髓前角为主，阳性细胞的c-fos mRNA表达颗粒位于胞浆内，染成深蓝色，测量OD值为4.13±0.23，与正常对照组比较P<0.01。术后1h，c-fos mRNA表达达高峰，OD值为10.78±1.86(P<0.01)，以后逐渐下降，但仍较正常对照组表达增多，2、4h的测量OD值与正常对照组比较，进行统计学分析，差异仍有极显著性意义(P<0.01)。
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bFGF治疗组检测结果显示，bFGF能明显抑制脊髓神经元损伤后c-fos mRNA的表达，在术后15min、2h时的OD值，bFGF 治疗组与生理盐水组相比较，差异有极显著性意义(P<0.01)；在1、4h时测量的OD值相比较，差异有显著性意义(P<0.05)。(结果见表1)。
表1 c-fos mRNA在脊髓组织中的表达(
±s) 术后时间动物数(n)
生理盐水组
bFGF组
15min
6
4.13±0.23
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3.12±0.43**
1h
6
10.78±1.86
8.37±0.34*
2h
6
7.35±0.21
6.46±0.41**
4h
6
5.53±0.37
, 百拇医药
4.36±0.89*
bFGF治疗组与生理盐水组比较， P<0.01，P<0.05。
3 讨 论
对神经元功能活动进行细胞水平定位所建立的新型形态学方法—c-fos癌基因表达方法[3]，是利用神经元受到兴奋性刺激时，c-fos癌基因的表达急剧增加和fos蛋白迅速堆积于胞核的特点。用c-fos癌基因CDNA探针原位杂交组化法或fos蛋白抗体免疫组化法在切片上染出受兴奋的神经元[4]。正常情况下，c-fos的基础水平很低，经多种胞外刺激可迅速引起c-fos一过性表达，因而可较完整准确地反映某刺激条件下神经元的活动情况。
c-fos参与神经细胞的生长、分化、神经功能可塑性变化及学习记忆等生理过程。很多因素(控制刺激和自然刺激)可导致中枢神经系统内c-fos的表达。Bullitt[5]应用伤害性机械刺激及电刺激诱导出脊髓及丘脑Fos阳性反应神经元的增加。脊髓损伤后，也可观察到c-fos表达增加[6，7]。Presley[8](1990)采用5%福尔马林刺激大鼠下肢，1h后，发现相应脊髓阶段灰质出现Fos样免疫反应阳性神经元，2h达峰值，4h后逐渐减少，16h恢复至正常水平。徐如祥报道，脑损伤后30min在损伤区神经细胞核中出现c-fos基因表达产物增多，并随伤后时间延长而增多，同时电镜观察神经元结构有不同程度改变[9]，提示脑损伤早期神经细胞的病理损害可能与c-fos基因表达变化有关。对损伤的c-fos基因表达与调控变化机理还不十分清楚，多数学者认为，c-fos基因表达与钙离子、谷氨酸受体及胆碱能神经元受体有关。
, 百拇医药
bFGF是有促进细胞生长作用的多肽因子。bFGF广泛存在于全身组织，但神经系统中的含量比其它任何组织都高，说明bFGF对神经系统的生长发育起十分重要的作用。近年来的研究结果表明，bFGF对体外培养的多种神经元有营养作用，它除能增强正常神经元的存活和突起生长外，还能保护神经元免受损伤。本实验结果显示，脊髓损伤后，脊髓神经元c-fos mRNA表达明显增多，从15min～4h呈持续性，1h达高峰，这说明c-fos可能参与脊髓神经元的继发性损害。bFGF治疗组c-fos表达较对照组明显减少(P<0.01)，说明bFGF抑制了脊髓损伤后c-fos基因的表达。其机制可能是bFGF降低了脊髓损伤后钙离子含量，抑制了损伤造成的钙离子内流，使损伤后神经元c-fos基因异常表达受到抑制，保护了神经细胞，这可能是bFGF保护受伤后神经元作用机制之一。
作者简介：刘文革(1966-)，男，山东省人，主治医生，博士学位。主研方向：脊髓损伤。电话：(0591)3357896-8406
, 百拇医药
参考文献：
〔1〕 刘文革，罗永湘.碱性成纤维细胞生长因子对脊髓损伤早期保护作用的实验研究[J].中国修复重建外科杂志，1999，13(5)：291.
〔2〕 刘文革，罗永湘，王敬博.尾静脉注射bFGF对大鼠脊髓损伤的影响[J].中国矫形外科杂志，1999，6(10)：762.
〔3〕 Dragunow M,Faull R.The use of c-fos as a metabolic marker in neuronal pathway tracing[J].J Neurosci Meth,1989，29:26.
〔4〕 Ju G,Zhang X.Activation of corticotropin-releasing factor-containing neurons in the paraventricular nucles of the hypothalamus by interleukin-1 in the rat[J].Neurosci Lett,1991，132(2):151.
, http://www.100md.com
〔5〕 Bullitt E.Expression of c-fos-like protein as a marker for neuronal activity following noxious stimulation in the rat[J].J Comp Neurol,1990，296:517.
〔6〕 Ruggiero DA,Anwar M,Kim J,et al.Induction of c-fos gene expression by spinal cord transection in the rat[J].Brain Res,1997，763:21.
〔7〕 Yakovlev AG,Faden AI.Sequential expression of c-fos protooncogene,TNF-alpha,and dynorphin genes in spinal cord following experimental traumatic injury[J].Mol Chem Neuropathal,1994，23(2):179.
〔8〕 Presley RW,Menetrey D,Levine JD,et al.Systemic morphion suppresses noxious stimulus-evolked FOS protein-like immunoreactivity in the rat spinal cord[J].J Neurosci,1990，10:323.
〔9〕 徐如祥，袁冠前，陈长才，等.脑损伤早期神经细胞c-fos基因表达与钙通道变化的关系[J].中华实验外科杂志，1995，12(4):245.
(收稿：2000-05-11 修回：2000-07-19), 百拇医药