滴金免疫法快速检测肾综合征出血热血清特异性IgM的研究
046000 长治医学院附属医院传染科(赵中夫、杨显斌)；第四军医大学基因诊断技术应用研究所(郭进军、阎小君) 赵中夫；郭进军；阎小君；杨显斌
关键词：肾综合征性出血热；免疫球蛋白M；免疫组织化学
摘要：目的 建立一种快速、敏感、适于基层应用的检测肾综合征出血热患者血清特异性的方法。方法 将汉坦病毒核蛋白点于硝酸纤维薄膜上，用来捕获血清标本中的肾综合征出血热病毒特异性IgM，通过胶体金标记的抗人μ链单克隆抗体直接显色，阳性者出现红色斑点。结果 整个试验过程仅需2～4分钟，操作简单。用该法与酶联免疫吸附试验对比检测45份肾综合征出血热患者血清标本，两法均阳性为41份，两法均阴性为2份，总符合率为96%。结论 滴金免疫法简便、快速，适于基层应用，可用于肾综合征出血热的早期诊断及流行病学研究。
肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)是常见人畜共患病之一，临床诊治过程中早期明确诊断直接关系患者的预后，现有的诊断方法，在基层单位应用有条件限制，本研究应用滴金免疫法(dot immunogold filtration assay,DIGFA)检测患者血清中特异性IgM抗体，试图建立一种快速、敏感、适于基层医疗单位的诊断方法，现报告如下。
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材料与方法
一、材料
1.汉坦病毒核蛋白：为细胞培养抗原。病毒的细胞培养液经离心后，取上清液加甲醛进行灭活，然后经Sepharose 2B层析柱纯化，收集汉坦病毒核蛋白进行浓缩，加保护剂后，置-20℃保存[1，2]。
2.抗人μ链单克隆抗体[3]：第四军医大学免疫学教研室提供，小鼠腹水经分段盐析，彻底透析除盐后，DEAE-Sephadex A50层析柱纯化，调整蛋白含量至2 mg/ml，冻存备用。
3.氯化金：购于成都化工厂。用去离子水配制成1%的水溶液，4℃保存。
4.血清标本：长治医学院附属医院传染科收集肾综合征出血热患者血清45份，乙型肝炎患者血清20份，健康人血清40份，上述血清分别经酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒检测确定。
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5.抗肾综合征出血热病毒IgM ELISA试剂盒：购于上海科华实业公司。
二、方法
1.原理：间接法检测血清IgM。汉坦病毒核蛋白包被在微孔滤膜上，检测时将血清滴于其上，再加胶体金标记的抗μ链单抗，若血清中有特异性IgM存在，则可在膜上形成红色斑点。
2.胶体金制备：用柠檬酸还原法制备胶体金。取0.02%氯金酸溶液100 ml加热煮沸,剧烈搅拌下迅速一次加入1%柠檬酸三钠4 ml，待溶液变成葡萄酒红色后继续煮沸10分钟，冷却后置4℃保存。
3.胶体金抗人μ链单克隆抗体结合物制备：取胶体金溶液1ml，用0.1 mol/L K2CO3调pH值至8.2，加入抗人μ链单克隆抗体40 μg，迅速混匀。10分钟后，加入小牛血清白蛋白(BSA)至终浓度为1%，3 000 g离心5分钟，取上清液，12 000 g离心20分钟，弃上清液，沉淀用20 μl含1% BSA的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解，即为胶体金抗人μ链单克隆抗体结合物[4]。
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4.微孔滤膜处理及汉坦病毒核蛋白包被：硝酸纤维素薄膜(孔径0.65 μm)用去离子水浸泡，取出晾干，制成1 cm直径的圆片。用0.05 mol/L碳酸盐缓冲液浸泡，晾干后，将1 μl的汉坦病毒核蛋白点于膜片中央，室温干燥后，用0.5% BSA封闭，然后用PBS洗涤两次，置干燥器中干燥，并保存于4℃。
5.免疫渗滤装置：将干燥的抗原膜片点样面朝上装入自制的塑料小盒中，盒盖中央有一直径0.6 cm的小孔，盒内塞满一次性尿布中的吸水材料。
6.试验方法：在膜的中央点1滴洗涤液(0.01 mol/L PBS)活化膜表面，待渗入。加血清标本1滴，待渗入。用洗涤液冲洗3遍后加入胶体金抗人μ链单克隆抗体结合物1滴，待渗入，用洗涤液冲洗3遍后，观察结果[5]。阳性者在膜中央出现红色斑点，阴性则无红色斑点形成。
7.ELISA试验：严格按说明书操作。
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结果
1.滴金免疫法与酶联免疫吸附法的比较：DIGFA与ELISA(特异性IgM抗体捕捉)对比检测肾综合征出血热患者血清45份，结果见附表。两法总符合率为96%，经χ2检验，P>0.05。
2.非肾综合征出血热患者血清检测结果：用DIGFA法检测20份乙型肝炎患者和40份健康人血清,均为阴性。
附表 DIGFA与ELISA法检测患者血清
抗肾综合征出血热病毒IgM结果(份数)
DIGFA
ELISA
合计
阳性
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阴性
阳性
41
0
41
阴性
2
2
4
合计
43
2
45
3.重复性试验：随机选择上述肾综合征出血热阳性血清和阴性血清各10份，重复检测5次，均测定出相同的结果。
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4.阻断试验：随机抽取阳性标本10份，各取30 μl分别加入等量的包被抗原(汉坦病毒核蛋白)，37℃水浴1小时，8 000 g离心20秒后，取10 μl进行滴金免疫法检测，结果均为阴性。 讨论
滴金免疫法又称为斑点金免疫渗滤试验，是80年代末发展起来的一种快速免疫学测定方法，它是胶体金标记技术与快速免疫斑点结合技术相结合的产物[6]。其基本原理是利用微孔滤膜的渗滤浓缩和毛细管作用，使抗原抗体反应在固相膜上快速进行(反应时间缩短为数分钟)，然后用胶体金标记的抗体来进行直接显色，由于胶体金肉眼可见，故阳性反应者在膜上呈现红色斑点，阴性反应则不会形成红色斑点。滴金免疫法与ELISA相比，特异性、灵敏性几乎相当，但前者具有快速、简便等ELISA所无法比拟的优点[7]。
肾综合征出血热患者多见于农村、牧区、林区等医疗条件相对较差的地区，许多患者因无法得到早期诊断而延误病情，致使死亡率很高。现在临床普遍应用ELISA方法来检测肾综合征出血热血清特异性IgM，该方法虽然准确性较高，但基层人员操作不方便，不能及时作出诊断。本研究建立的测定肾综合征出血热患者血清特异性IgM的滴金免疫法，与ELISA对比测定的符合率为96%。它不失为一种既方便又快速的诊断肾综合征出血热的方法。其原料来源也较容易，制成试剂盒后有广泛应用价值。应当说明的是滴金免疫法本身存在较难进行质量控制的问题，通常可以在微孔滤膜上另加能与标记结合物直接反应的质控品，但这仅能作为实验是否有效的指标，真正的质控还需在同一批试剂中另行测试。故我们建议同一批试剂盒中应包括阳性和阴性对照血清，检测患者血清时，同批次的试剂盒应做一次阴性和阳性对照，是否可行，有待进一步探讨。
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作者单位：046000 长治医学院附属医院传染科(赵中夫、杨显斌)；第四军医大学基因诊断技术应用研究所(郭进军、阎小君)
参考文献
1 黄长形，李盈盈，杨为松，等.肾综合征出血热病毒核蛋白在大肠杆菌中表达及其产物的应用.中华传染病杂志，1996，14：28-31.
2 李德新，宋干，杨长寿，等.肾综合征出血热病毒结构蛋白的研究.病毒学报，1996，6：101-104.
3 杨为松，张文彬.肾综合征出血热患者对EHFV三种结构蛋白的抗体应答.中华传染病杂志，1992，10：187-190.
4 陶义训.快速斑点免疫结合试验在医学检验中的应用评价.中华医学检验杂志，1994，17：197-197.
, 百拇医药
5 肖乐义，阎小君，徐德忠，等.斑点金免疫渗滤试验快速检测抗甲型肝炎病毒IgM抗体.第四军医大学学报，1996，17：441-443.
6 Hayat MA. Colloidal gold-principales, methodes and applications. San Diego: Acad Press,1989.23-39.
7 Spielberg F, Kabeya CM, Ryder RW, et al. Field testing and comparative evaluation of rapid, visually read screening assays for antibody to human immunodeficiency virus.Lancet,1989,1:580-584.
(收稿：1997-08-11 修回：1998-01-04), 百拇医药
关键词：肾综合征性出血热；免疫球蛋白M；免疫组织化学
摘要：目的 建立一种快速、敏感、适于基层应用的检测肾综合征出血热患者血清特异性的方法。方法 将汉坦病毒核蛋白点于硝酸纤维薄膜上，用来捕获血清标本中的肾综合征出血热病毒特异性IgM，通过胶体金标记的抗人μ链单克隆抗体直接显色，阳性者出现红色斑点。结果 整个试验过程仅需2～4分钟，操作简单。用该法与酶联免疫吸附试验对比检测45份肾综合征出血热患者血清标本，两法均阳性为41份，两法均阴性为2份，总符合率为96%。结论 滴金免疫法简便、快速，适于基层应用，可用于肾综合征出血热的早期诊断及流行病学研究。
肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)是常见人畜共患病之一，临床诊治过程中早期明确诊断直接关系患者的预后，现有的诊断方法，在基层单位应用有条件限制，本研究应用滴金免疫法(dot immunogold filtration assay,DIGFA)检测患者血清中特异性IgM抗体，试图建立一种快速、敏感、适于基层医疗单位的诊断方法，现报告如下。
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材料与方法
一、材料
1.汉坦病毒核蛋白：为细胞培养抗原。病毒的细胞培养液经离心后，取上清液加甲醛进行灭活，然后经Sepharose 2B层析柱纯化，收集汉坦病毒核蛋白进行浓缩，加保护剂后，置-20℃保存[1，2]。
2.抗人μ链单克隆抗体[3]：第四军医大学免疫学教研室提供，小鼠腹水经分段盐析，彻底透析除盐后，DEAE-Sephadex A50层析柱纯化，调整蛋白含量至2 mg/ml，冻存备用。
3.氯化金：购于成都化工厂。用去离子水配制成1%的水溶液，4℃保存。
4.血清标本：长治医学院附属医院传染科收集肾综合征出血热患者血清45份，乙型肝炎患者血清20份，健康人血清40份，上述血清分别经酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒检测确定。
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5.抗肾综合征出血热病毒IgM ELISA试剂盒：购于上海科华实业公司。
二、方法
1.原理：间接法检测血清IgM。汉坦病毒核蛋白包被在微孔滤膜上，检测时将血清滴于其上，再加胶体金标记的抗μ链单抗，若血清中有特异性IgM存在，则可在膜上形成红色斑点。
2.胶体金制备：用柠檬酸还原法制备胶体金。取0.02%氯金酸溶液100 ml加热煮沸,剧烈搅拌下迅速一次加入1%柠檬酸三钠4 ml，待溶液变成葡萄酒红色后继续煮沸10分钟，冷却后置4℃保存。
3.胶体金抗人μ链单克隆抗体结合物制备：取胶体金溶液1ml，用0.1 mol/L K2CO3调pH值至8.2，加入抗人μ链单克隆抗体40 μg，迅速混匀。10分钟后，加入小牛血清白蛋白(BSA)至终浓度为1%，3 000 g离心5分钟，取上清液，12 000 g离心20分钟，弃上清液，沉淀用20 μl含1% BSA的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解，即为胶体金抗人μ链单克隆抗体结合物[4]。
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4.微孔滤膜处理及汉坦病毒核蛋白包被：硝酸纤维素薄膜(孔径0.65 μm)用去离子水浸泡，取出晾干，制成1 cm直径的圆片。用0.05 mol/L碳酸盐缓冲液浸泡，晾干后，将1 μl的汉坦病毒核蛋白点于膜片中央，室温干燥后，用0.5% BSA封闭，然后用PBS洗涤两次，置干燥器中干燥，并保存于4℃。
5.免疫渗滤装置：将干燥的抗原膜片点样面朝上装入自制的塑料小盒中，盒盖中央有一直径0.6 cm的小孔，盒内塞满一次性尿布中的吸水材料。
6.试验方法：在膜的中央点1滴洗涤液(0.01 mol/L PBS)活化膜表面，待渗入。加血清标本1滴，待渗入。用洗涤液冲洗3遍后加入胶体金抗人μ链单克隆抗体结合物1滴，待渗入，用洗涤液冲洗3遍后，观察结果[5]。阳性者在膜中央出现红色斑点，阴性则无红色斑点形成。
7.ELISA试验：严格按说明书操作。
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结果
1.滴金免疫法与酶联免疫吸附法的比较：DIGFA与ELISA(特异性IgM抗体捕捉)对比检测肾综合征出血热患者血清45份，结果见附表。两法总符合率为96%，经χ2检验，P>0.05。
2.非肾综合征出血热患者血清检测结果：用DIGFA法检测20份乙型肝炎患者和40份健康人血清,均为阴性。
附表 DIGFA与ELISA法检测患者血清
抗肾综合征出血热病毒IgM结果(份数)
DIGFA
ELISA
合计
阳性
, 百拇医药
阴性
阳性
41
0
41
阴性
2
2
4
合计
43
2
45
3.重复性试验：随机选择上述肾综合征出血热阳性血清和阴性血清各10份，重复检测5次，均测定出相同的结果。
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4.阻断试验：随机抽取阳性标本10份，各取30 μl分别加入等量的包被抗原(汉坦病毒核蛋白)，37℃水浴1小时，8 000 g离心20秒后，取10 μl进行滴金免疫法检测，结果均为阴性。 讨论
滴金免疫法又称为斑点金免疫渗滤试验，是80年代末发展起来的一种快速免疫学测定方法，它是胶体金标记技术与快速免疫斑点结合技术相结合的产物[6]。其基本原理是利用微孔滤膜的渗滤浓缩和毛细管作用，使抗原抗体反应在固相膜上快速进行(反应时间缩短为数分钟)，然后用胶体金标记的抗体来进行直接显色，由于胶体金肉眼可见，故阳性反应者在膜上呈现红色斑点，阴性反应则不会形成红色斑点。滴金免疫法与ELISA相比，特异性、灵敏性几乎相当，但前者具有快速、简便等ELISA所无法比拟的优点[7]。
肾综合征出血热患者多见于农村、牧区、林区等医疗条件相对较差的地区，许多患者因无法得到早期诊断而延误病情，致使死亡率很高。现在临床普遍应用ELISA方法来检测肾综合征出血热血清特异性IgM，该方法虽然准确性较高，但基层人员操作不方便，不能及时作出诊断。本研究建立的测定肾综合征出血热患者血清特异性IgM的滴金免疫法，与ELISA对比测定的符合率为96%。它不失为一种既方便又快速的诊断肾综合征出血热的方法。其原料来源也较容易，制成试剂盒后有广泛应用价值。应当说明的是滴金免疫法本身存在较难进行质量控制的问题，通常可以在微孔滤膜上另加能与标记结合物直接反应的质控品，但这仅能作为实验是否有效的指标，真正的质控还需在同一批试剂中另行测试。故我们建议同一批试剂盒中应包括阳性和阴性对照血清，检测患者血清时，同批次的试剂盒应做一次阴性和阳性对照，是否可行，有待进一步探讨。
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作者单位：046000 长治医学院附属医院传染科(赵中夫、杨显斌)；第四军医大学基因诊断技术应用研究所(郭进军、阎小君)
参考文献
1 黄长形，李盈盈，杨为松，等.肾综合征出血热病毒核蛋白在大肠杆菌中表达及其产物的应用.中华传染病杂志，1996，14：28-31.
2 李德新，宋干，杨长寿，等.肾综合征出血热病毒结构蛋白的研究.病毒学报，1996，6：101-104.
3 杨为松，张文彬.肾综合征出血热患者对EHFV三种结构蛋白的抗体应答.中华传染病杂志，1992，10：187-190.
4 陶义训.快速斑点免疫结合试验在医学检验中的应用评价.中华医学检验杂志，1994，17：197-197.
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5 肖乐义，阎小君，徐德忠，等.斑点金免疫渗滤试验快速检测抗甲型肝炎病毒IgM抗体.第四军医大学学报，1996，17：441-443.
6 Hayat MA. Colloidal gold-principales, methodes and applications. San Diego: Acad Press,1989.23-39.
7 Spielberg F, Kabeya CM, Ryder RW, et al. Field testing and comparative evaluation of rapid, visually read screening assays for antibody to human immunodeficiency virus.Lancet,1989,1:580-584.
(收稿：1997-08-11 修回：1998-01-04), 百拇医药